Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава I. Регуляция аденилатциклазы клеток эукариот гуани-
ловыми нуклеотидами 7
-
ГТФ-зависимая активация аденилатциклазы гормонами. Гормонстимулируемый регуляторный ГТШ-азный цикл 7
-
Белковые компоненты гормонстимулируемого аденилат-циклазного комплекса ; 12
-
Гормональный рецептор 12
-
Регуляторный компонент, опосредующий ГТШ-зависимую активацию аденилатциклазы гормоном 14
-
Каталитический компонент адёнилатциклазного ком-плекса 18
1.3. Лигандзависимые взаимодействия-между компонентами
адёнилатциклазного комплекса. Модель активации аденилат
циклазы гормонами и гуаниловыми нуклеотидами 24
Глава 2. Регуляция аденилатциклазы ионами кальция. Участие кальмодулина в проявлении Са +-зависимой активации
фермента У35
Глава 3. Аденилатциклаза сердца 48
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 54
-
Вьщеление препарата наружных плазматических мембран (легкой сарколеммы) из сердца кролика 54
-
Солюбилизация и хроматография регуляторного и каталитического компонентов аденилатциклазы сердца 55
-
Вьщеление кальмодулина из головного мозга быка 56
стр.
1.4. Выделение препарата плазматических мембран из ...
стриарной системы головного мозга кролика 57
-
Выделение препарата плазматических мембран из тромбоцитов человека 58
-
Определение активности аденилатциклазы 59
-
Электрофорез в полиакриламидном геле 60
-
Расчет концентрации свободного Са + 61
-
Определение концентрации белка 62
1.10. Использованные реактивы. 62
2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 64
2.1. Характеристика свойств аденилатциклазы в препарате
легкой сарколеммы из сердца кролика 64
-
Регуляция аденилатциклазы в препарате легкой сарколеммы ионами кальция. Участие кальмодулина в проявлении активирующего влияния Са + на активность фермента 79
-
Солюбилизация, разделение и реконструкция4каталитического компонента и n -белка аденилатциклазного комплек-са сердца. Проявление кальмодулинзависимой регуляции на реконструированном комплексе: n -белок-каталитический ком-
понент 106
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 123
ВЫВОДЫ 138
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 139
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АТФ - аденозин-5'-трифосфат
ШФ - аденозин-5'-монофосфат
цАМШ - циклический аденозин-3':5'-монофосфат
ГТШ - гуанозин-5'-трифосфат
гдаз - гуанозин-5'-дифосфат
6рр.(сн2)р - гуанозин-5'- Q3,/-метилен.)-трифосфат
6рр.(ш.)р - гуанозин-5 '-(7},У-имидо.)-трифосфат
ГТФуБ - гуанозин-5'-.(к-тио>-трифосфат
ГДФ& s - гуанозин-5'-(Я-тио)-дифосфат
НАД4" - никотинамидадениндинуклеотид
ШШН - пирофосфат неорганический
$н - фосфат неорганический
ГТФ-
сефароза - сефароза с иммобилизованным по У-фосфату ГТФ
ДЭАЭ-
сефароза - диэтиламиноэтилсефароза
КМ-
сефароза - сефароза с иммобилизованньм калъмодулином
ПЭИ-
целлюлоза - полиэтилениминоцеллюлоза
трис - трис-,(гидроксиметил.)аминометан
ДТТ - дитиотрейтол
АКТГ - адренокортикотропный гормон
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
ЭГТА - этиленгликольбисОЗ-аминоэтил)- n,n,njn; -тетра-
ацетат
Введение к работе
Расположенная в наружной плазматической мембране клеток эука-риот гормонстимулируемая аденилатциклаза /АТФ-пирофосфат-лиаза(ци-клизующая) Ш 4.6.1.I./ представляет собой трансмембранный комплекс, состоящий по меньшей мере из трех компонентов: гормонального рецептора, регуляторного компонента, связывающего гуаниловые нуклеотиды, (Ng-белка) и собственно каталитического компонента фермента. Гормонсвязывающий участок рецептора экспонирован в межклеточное пространство, а участок связывания гуаниловых нуклеотидов Ng-белка и активный центр каталитического компонента ориентированы в сторону цитоплазмы. Связывание гормона с рецептором вызывает РШ-зависимое сопряжение Ng-белка с каталитическим компонентом и появление у последнего способности катализировать образование цАШ в физиологических условиях. Гидролиз Ns-белком ГТІ до ГДШ и Фи приводит к диссоциации каталитического компонента и Ng-белка и,соответственно, к устранению гормонстимулированной активности фермента. Помимо гормона и ГТФ необходимым кофактором функционального сопряжения Ng-белка и каталитического компонента является м9 : переход Ng-белка в ГТФ-активированную конформацию возможен лишь в присутствии этого катиона /38, 57, 67, 189, 263/.
Са является также важным регулятором активности гормончув-ствительной аденилатциклазы (АЦ). В области физиологических концентраций: 10 М-ІСГ М Са вызывает ингибирование активности этого фермента. Высказывается предположение, что негативная регуляция АЦ ионами кальция осуществляется в результате связывания катиона в регуляторном центре, расположенном на каталитическом компоненте фермента /25, 57, 115, 176, 184, 204, 243, 244, 297/.
АЦ некоторых тканей (головного мозга, почек, кишечника, легких, надпочечников и др.) способна также и активироваться микро-молярными концентрациями Са . Установлено, что эта активация происходит в результате Са +-зависимого сопряжения фермента с ка-льмодулином /9, 33, 42, 44, 47, 50, 65, 100, 103, 207, 234, 242, 316/. Существует точка зрения, что кальмодулин (КМ) регулирует активность особой (КМ-зависимой формы) АЦ, отличной от той, активность которой регулируется гормонами, путем сопряжения каталитического компонента с ns-белком /34, 43, 45/.
АЦ сердца активируется большим числом гормонов: катехолами-нами, гистамином, глюкагоном и рядом других эффекторов по "клас-
2+ 2+ сическому" мд , ГТШ-зависимому механизму /40, 82, 93/. Са -зависимая регуляция АЦ сердца изучена в значительно меньшей степени.
К моменту выполнения настоящей работы бьшо твердо установлено лишь
2+ то, что в сердце АЦ ингибируется Са , тогда как.вопрос о способ-
2+ ности этого фермента активироваться Са опосредовано через сопряжение с КМ оставался открытым /3, 247, 329/.
Целью настоящей работы было на примере АЦ из сердечной мышцы кролика изучить регуляцию АЦ сердца ионами кальция и КМ. Учитывая облигатную роль гуаниловых нуклеотидов в функционировании АЦ комплекса клеток эукариот, особое внимание было уделено характеристи-ке Ng-белка и выяснению его роли в Са -зависимой регуляции АЦ сердца КМ. На примере АЦ сердца была подвергнута анализу гипотеза о существовании в тканях двух независимых форм АЦ: КМ-зависимой и гормонрегулируемой. В работе были поставлены следующие задачи: I) выделить высокоочищенный препарат сарколеммы из сердца кролика и охарактеризовать в нем регуляцию АЦ ионами кальция и КМ; выяснить действие мд , гуаниловых нуклеотидов, гормонов, ионов фтора, фо-рсколина и холерного токсина на активность и Са -зависимую регуляцию фермента ; 2) провести солюбилизацию компонентов АЦ сердца из мембраны, разделить их и затем реконструировать каталитический компонент с N -белком и КМ. На реконструированном АЦ комплексе изу-чить характер регуляции каталитического компонента Ng-белком и КМ.
