Содержание к диссертации
Введение
I. Литературный.обзор II
1.1. Морфология слизистой оболочки желудка лягушки и ультраструктура оксинтных клеток II
1.2. Краткие сведения о механизме образования и транспорта протонов в слизистой желудка 19
1.2. Карбоангидразная гипотеза 19
1.2.2. Редокс-гипотеза . . 21
1.2.3. АИ-АТФазная гипотеза 23
1.3. Пути регуляции секреции соляной кислоты 26
1.4. Секреция соляной кислоты слизистой оболочкой желудка и роль в этом процессе цАМФ 32
1.4.1. Аденилатциклазная система 34
1.4.2. Краткая характеристика фосфодиэстеразы 38
1.4.3. ЦАМФ-зависимые протеинкиназы 39
1.5. Фосфорилирование белков, как один из основных путей реализации физиологической функции гормонов . 43
1.6. Роль ионов калия и кальция в обеспечении регуляции секреции соляной кислоты слизистой желудка . 47
II. Методическая часть 51
2.1. Реактивы, растворы- 51
2.2. Получение изолированной слизистой оболочки желудка лягушки 53
2.3. Выделение изолированных оксинтных клеток 54
2.3.1. Выделение оксинтных .клеток ферментативной обработкой СОЖ 54
2.3.2. Окраска оксинтных клеток на сукцинатдегидрогеназу 55
2.4. Изучение секреции МОЇ изолированной СОЖ и изолированными оксинтными клетками с помощью рН-статического метода .- 56
2.4.1. Устройство рН-стата 56
2.4.2. Работа гастро-рН-стата 59
2.4.3. Регистрация и обработка результатов 61
2.5. Определение циклических нуклеотидов (цАМФ и цГШ) в ткани . - 63
2.5.1. Выделение циклических .нуклеотидов-из ткани и подготовка материала к анализу 63
2.5.2. Определение циклических нуїдіеотидов по методу Гил-мана 64
2.6. Метод изучения включения (с^Р)-ортофосфата в белки изолированных оксинтных клеток 64
2.7. Метод фракционирования цАМФ-зависимых и цАМФ-неза-висимых протеинкиназ .изолированных оксинтных клеток 65
2.7.1. Фракционирование протеинкиназ . 65
2.7.2. Определение активности протеинкиназ . 66
2.8. Статистическая обработка экспериментальных данных 67
III. Результаты , - 68
3.1. Секреторная активность, уровень цАМФ и цГМФв изолированной СОЖ лягушки 68
3.2. Влияние гистамина и циметидина на уровень секреции НСІ изолированной СОЖ *. 70
3.3. Влияние циклических нуклеотидов, З-тизобутил-1-метил-ксантина на уровень секреции НСІ изолированной СОЖ 74
3.4. Влияние метаболитов (пирувата, сукцината) на секрецию соляной кислоты изолированной СОЖ 77
3.5. Влияние циклогексимида на секрецию НСІ изолированной СОЖ 79
3.6. Регуляция секреции HCI изолированной СОЖ лягушек
в зимнем и летнем периодах 80
3.7. Влияние ионов .калия и кальция на уровень секреции НСІ изолированной СОЖ 85
3.8. Влияние гистамина и циметидина на содержание циклических нуклеотидов в изолированной СОЖ 91
3.9. Исследование влияния модификаторов секреции на изолированные оксинтные клетки желудка .лягушки 96
3.9.1. Выделение изолированных оксинтных клеток 96
3.9.2. Влияние специфических агентов на регуляцию секреции НСІ изолированными оксинтными клетками 97
3.9.3. Влияние гистамина и циметидина на уровень циклических нуклеотидов и фосформирование белков изолированных оксинтных клеток 99
3.10. Изучение гетерогенности протеинкиназ в изолиро ванных оксинтных клетках желудка лягушки 105
IV. Обсуждение результатов . 109
V. Выводы 123
VI. Список литературы 124
- Морфология слизистой оболочки желудка лягушки и ультраструктура оксинтных клеток
- Получение изолированной слизистой оболочки желудка лягушки
- Секреторная активность, уровень цАМФ и цГМФв изолированной СОЖ лягушки
- Обсуждение результатов
Морфология слизистой оболочки желудка лягушки и ультраструктура оксинтных клеток
Исследователи различают три области в слизистой желудка лягушки: преджелудок, фундальный отдел и пилорический ( Norris., 1959; Porte .» 1972; Не lander ., 1972). Преджелудок является промежуточным звеном между пищеводом и собственно желудком (рис. I). Он выстлан однослойным ресничным призматическим эпителием и содержит отдельные бокаловидные клетки (одноклеточные железы). Внутренняя поверхность преджелудка покрыта небольшими ямками, в которых расположены трубчатые железы, включающие в себя зимогенные и слизистые клетки.
Фундальная область желудка покрыта однослойным призматическим .эпителием. Шундальные железы достаточно глубокие (составляют 1/3 - 2/3 толщины собственно слизистой), разветвленные. В среднем, в одну ямку выходят четыре железы. Железы состоят из трех типов клеток: слабо дифференцированных слизистых клеток, расположенных в области шейки железы, оксинтных, выстилающих базальную область железы, и эндокринных ( Forte ., 1972; Helander.,et.аЪ 1972).
В пилорической области желудка трубчатые железы состоят из двух типов клеток: слизистых клеток, подобных слизистым клеткам і шейки железы фундального отдела, и эндокринных.
Океинтные клетки расположены в базальной части железы и сверху ограничены слизистыми шеечными клетками. Их объем равен 1000 мкмп, что соответствует размеру средней обкладочной клетки млекопитающих ( Genze., Tolkovsky.,et.al , 1971).
Базальная поверхность оксинтной клетки имеет сильно выраженную складчатость ( Sedar,et.al , 1965; Ito.,et.al, 1967), а латеральная образует цитоплазматические выросты. В состоянии покоя апикальная область мембраны характеризуется ограниченным числом микроворсинок. В противоположность обкладочным клеткам млекопитающих здесь нет внутриклеточных секреторных канальцев. Плазматическая мембрана апикальной области - преимущественное место локализации ферментов, важных для мембранного транспорта протонов и других ионов. Цитоплазма апикальной области заполнена гладкими однородными тубулами и везикулами, которые имеют диаметр 20 - 200 нм.
Получение изолированной слизистой оболочки желудка лягушки
Принцип метода: с помощью операций, рекомендованных в работе Дебина ( Dur"bin,et.al , 1965) и описанных ниже, удается получить изолированную СОЖ, способную -при определенных условиях " in vitro " секретировать HCI.
Извлеченный-,из анестезированной лягушки желудок разрезали по средней линии малой кривизны и помещали-на 10 минут в раствор А, после чего слизь и основную массу эпителиальныхклеток удаляли путем мягкого промакания поверхности СОЖ фильтровальной бумагой. С помощью препаравальных игл слизистую закрепляли на парафиновом столике и отделяли собственно слизистую от наружного мышечного слоя. Обработанную таким образом изолированную СОЖ помещали в раствор Б и хранили 20 - 40 минут при 0 - 2С до использования в эксперименте. В случае более длительного хранения (2-3 часа и более) в раствор Б вводили бактериоста-тики (стрептомицин, пеницилин) в концентрации I мг/мл.
Секреторная активность, уровень цАМФ и цГМФв изолированной СОЖ лягушки
Изолированная СОЖ .лягушки представляет собой сложнооргани-зованный ансамбль клеток. Наряду с оксинтными (оксинтнопепти-ческими) клетками, непосредственно вырабатывающими HCI, имеются и различные другие типы-клеток (см.обзор литературы). В связи с этим было решено провести исследования с целью выявления активности секреции HCI и распределения цАМЗ и цГЖ в 4-х основных зонах желудка.
Как следует из рис. 18 только участки Ш (корпус желудка) и 1 (пилорическая зона) активно продуцируют соляную кислоту. Можно думать, что именно в этих участках сосредоточена основная масса оксинтных клеток. Результаты анализа содержания циклических нуклеотидов в каждом из четырех участков желудка представлены также на рис. 18. Уровень циклических нуклеотидов различен во всех участках: в районе перехода пищевода в преджелудок содержание цАМ 2,4 + 0,4 пмоль/мг.б., а цГМФ 0,24 + 0,04 пмоль/ мг.б. ; в районе преджелудка содержание цАМЗ? 3,3 + 0,5 пмоль/мг.б., а цГМЗ 0,38 + 0,05 пмоль/мг.б. ; в районе корпуса желудка содержание цАН 5,7 + 0,4 пмоль/мг.б., а содержание цГМЗ? 0,52 + 0,06 пмоль/мг.б. ; в пилорической зоне содержание цАМШ 3,9 + 0,7 пмоль/мг.б., а цГМЗ? 0,74 + 0,06,пмоль/мг.б. Значение уровня цАМФ и цГМФ в зоне перехода пищевода в преджелудок минимально. Максимальный уровень цАШ, таким образом, отмечен в районе корпуса желудка, а цГМШ максимальна в ІУ участке (пилорическая зона).
Обсуждение результатов
В поисках наиболее подходящей модели, мы не случайно обратились к специализированному органу - желудку, формой ответа которого является продукция легко определяемого вещества - соляной кислоты. Выбранная модель отличается целым рядом экспериментальных преимуществ. Во-первых, в отличии от мышечной ткани и нервного волокна, ее деятельность осуществляется в удобных временных интервалах. Во-вторых, этот орган может быть диспергирован на клетки. Наконец, слизистая оболочка желудка лягушки может сохранять физиологическую и функциональную целостность "in vitro " длительное время.
Прежде чем приступить к обсуждению основных результатов исследования необходимо остановиться на результатах, которые характеризуют изучаемый нами объект. На рис. 18 представлены . результаты по распределению секреторной активности и циклических нуклеотидов в слизистой желудка лягушки. Видно, что секреторная активность различна во всех исследуемых нами участках желудка и максимальна в фундальном отделе. Прослеживая в этом же направлении распределение цАМФ и цГМФ, нельзя не отметить различия как в абсолютных-величинах, так и в тенденции их изменения. Если уровень цАМФ минимален в антральном отделе, возрастает и достигает максимального значения (5,7 + 0,4 пмоль/мг.б) в фундальном отделе желудка лягушки, а затем вновь понижается в пило-рической зоне, то уровень цГМШ возрастает на,всем протяжении желудка лягушки. Таким образом, первые же результаты исследования , позволили высказать предположение, и это уже в самом, начале исследования, о функциональной взаимосвязи между секреторной активностью слизистой и уровнем цАМФ. Определенных корреляций . между секреторной активностью желудка и содержанием цГМФ не. выявлено. На основании полученных результатов мы пришли к выводу, что в дальнейших исследованиях целесообразнее всего использовать 2 и 3 участки желудка лягушки.
Как известно, прямым и наиболее мощным стимулятором секреции протонов является гистамин а одним из наиболее эффективных его антагонистов - циметидин. Выбор оптимальных доз воздействия данных модификаторов, изучение их эффектов на изолированную СОЖ еще раз подтвердили те основные закономерности, которые ранее были отмечены другими исследователями при работе с данной моделью ( Brennan,et.al , 1975; Brimblecombe » 1978; Batzri, et.aj, 1979).
