Введение к работе
Актуальность проблемы. Один из классических нейромедиаторов, серотонин выполняет, помимо нейротрансмиссии, множество ненервных функций, в том числе участвует в важнейших процессах индивидуального развития. Серотонинергическая сигнальная система хорошо изучена на нервных клетках взрослых млекопитающих: для всех ее компонентов известны гены, нуклеотидные и аминокислотные последовательности, исследованы структура и механизмы их функционирования. Исследованы механизмы некоторых ненервных функций серотонина, в частности его роль в системе свертывания крови и регуляции тонуса сосудов. Особое место занимают открытые более 50 лет назад Г.А. Бузниковым функции серотонина в эмбриональном и личиночном развитии. За этот период накоплено большое количество физиологических и биохимических данных, свидетельствующих о присутствии серотонина в эмбрионах, начиная с самых ранних стадий развития, о многочисленных специфических эффектах этого вещества и его аналогов, на раннее эмбриональное развитие, а также о механизмах этих эффектов. В то же время молекулярно-биологические исследования компонентов эмбриональной серотонинергической системы до сих пор остаются немногочисленными и разрозненными.
В настоящее время исследования в области биологии развития, в том числе ранних этапов онтогенеза, ведутся чрезвычайно активно. Это связано как с общим интересом к собственно раннему развитию, так и, в частности, с большим сходством эмбриональных и опухолевых тканей. В свете современных достижений в этих областях на первый план выходит выяснение молекулярных основ раннего развития. Важное место в этих работах занимает изучение сигнальных путей, контролирующих ранние этапы эмбриогенеза. Учитывая широкий спектр функций серотонина и множество его эмбриональных эффектов, можно полагать, что серотонин является одним из сигнальных веществ, регулирующих раннее развитие. Исследование донервной эмбриональной серотонинергической системы на молекулярном уровне может пролить свет на механизмы регуляции процессов раннего эмбриогенеза.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключается в обзорном исследовании экспрессии компонентов донервной серотонинергической системы в раннем эмбриогенезе двух классических объектов биологии развития - шпорцевой лягушки Xenopus и морского ежа. Для ее достижения были поставлены следующие задачи:
исследовать экспрессию генов, гомологичных компонентам серотонинергической системы, в раннем развитии морских ежей и функциональную активность компонентов, экспрессирующихся на ранних стадиях развития;
исследовать экспрессию генов компонентов серотонинергической системы в нормальном развитии Xenopus и выявить гены, экспрессирующиеся на ранних стадиях развития, для дальнейшего исследования;
исследовать количественно уровень и динамику экспрессии этих генов в течение раннего развития Xenopus;
исследовать пространственное распределение в ранних эмбрионах Xenopus мРНК генов серотонинергической системы;
исследовать на уровне трансляции экспрессию генов серотонинергической системы, выявленных в раннем эмбриогенезе Xenopus;
выявить возможные источники материнского (ооцитарного) серотонина путем анализа экспрессии генов ферментов синтеза серотонина.
Научная новизна. На классической экспериментальной модели - эмбрионах Xenopus впервые проведено комплексное исследование донервной эмбриональной серотонинергической системы. Впервые была исследована экспрессия всех компонентов серотонинергической системы на одном экспериментальном объекте. Показано, что на ранних стадиях развития Xenopus, в составе материнской мРНК экспрессируются основные компоненты, необходимые для осуществления сигнальной функции - везикулярный транспортер VMAT2, рецепторы HTR1E, HTR2C, HTR5 и HTR7 и транспортер обратного захвата SERT, а также ферменты синтеза серотонина ТРН2 и AAAD. Впервые получены и опубликованы частичные последовательности мРНК HTR1E, HTR5 и SERTX. laevis (NCBI Nucleotide Ш: КС477213, КС477214 и JQ001861). Количественно исследованы уровень, динамика экспрессии и пространственное распределение транскриптов основных компонентов серотонинергической системы в ранних эмбрионах Xenopus, и их экспрессия на уровне трансляции. Показано, что на ранних стадиях эмбриогенеза Xenopus не экспрессируется основной фермент деградации серотонина МАО А. Выявлено, что ферменты синтеза серотонина экспрессируются как в ооцитах на ранних стадиях оогенеза, так и в фолликулярных оболочках.
Впервые проведен анализ экспрессии гомологов генов компонентов серотонинергической системы в раннем развитии морских ежей, являющихся классическим объектом исследования донервных функций нейротрансмиттеров. Показано, что на ранних стадиях развития экспрессируются гомологи рецепторов серотонина четырех типов, транспортера серотонина SERT, фермента деградации серотонина МАОА и в течение донервного развития начинают экспрессироваться гомологи везикулярного транспортера моноаминов VMAT, и ферментов синтеза серотонина. Впервые получены и опубликованы частичные последовательности мРНК SERT, VMAT P. lividus. Функциональная активность компонентов систем синтеза и обратного захвата подтверждена экспериментально. Полученные результаты являются первыми молекулярно-биологическими свидетельствами экспрессии компонентов серотонинергической системы в раннем развитии морских ежей.
Научная и практическая значимость работы. В работе получены результаты, представляющие фундаментальный научный интерес. В частности, продемонстрировано, что рецепторы серотонина, экспрессирующиеся в раннем развитии, гомологичны или идентичны дефинитивным рецепторам нервных клеток. Показана экспрессия на ранних донервных стадиях развития нейральной формы фермента синтеза серотонина. Показано, что набор типов рецепторов серотонина, экспрессирующихся в раннем развитии, консервативен, по крайней мере, среди позвоночных. Выполнено исчерпывающее сравнительное обзорное исследование, в
результате которого выявлены гены серотонинергической системы, экспрессирующиеся на ранних стадиях развития и, возможно, принимающие участие в реализации донервных функций серотонина. Полученные результаты могут быть использованы как основа для дальнейших практических и теоретических исследований донервных функций серотонина и других нейротрансмиттеров. Разработанный методический подход может быть использован для исследования других нейротрансмиттерных систем в раннем развитии.
Личное участие автора. Автор непосредственно участвовал как в планировании работы, сборе материала, отработке экспериментальных методов, постановке экспериментов, получении всех результатов, так и в их дальнейшей обработке и интерпретации. Автор лично участвовал в апробации результатов исследования и подготовке основных публикаций по выполненной работе.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на VII и VIII Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2010, 2011), Первых Международных Беккеровских чтениях (Волгоград, 2010), XXI Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010), VI и VII Конференциях молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, 2010, 2011), П Объединенном симпозиуме Французского и Британского обществ биологии развития (Ницца, Франция, 2011).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 103 страницах, содержит 21 рисунок и 4 таблицы, состоит из следующих разделов: Список сокращений, Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты, Обсуждение результатов, Выводы и Список литературы, включающий 141 цитируемый источник.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК, статья в сборнике и глава в монографии.
