Содержание к диссертации
Введение
1. Механизмы регуляции биосинтеза бактериальных ферментов на уровне
транскрипции 15
1.1. Роль структуры промоторов в регуляции экспрессии генов и сигма-факторы бактериальной клетки 15
1.2. Механизмы позитивной регуляции экспрессии бактериальных генов на уровне транскрипции 24
2. Механизмы ответа бактериальных клеток на стресс 50
2.1. Белки ответа на стресс у грамотрицательных бактерий на примере E.coli 51
2.2. Белки ответа на стресс у грамположительных бактерий на примере В. subtil is 55
2.3. Осмоадаптация бактерий. Специфическая и неспецифическая реакция на повышенные концентрации соли в среде обитания 57
2.4. Адаптивный мутагенез и SOS-ответ клеток 62
3. Структура, функции и регуляция биосинтеза некоторых секретируемых гидролитических ферментов бактерий 67
3.1. Хитиназы 67
3.2. Рибонуклеазы 78
3.3. Протеазы 89
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ 103
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 105
1. Материалы и методы исследований 105
2. Результаты исследований 123
2.1. Хитинолитический комплекс Serratia marcescens и особенности его биосинтеза 123
2.1.1.Влияние хитина и индуктора SOS-функций клетки на биосинтез ферментов хитинолитического комплекса S. marcescens 123
2.1.2.Характеристика мутантного штамма S.marcescens с повышенной хитиназной активностью 125
2.1.3.Синтез эндохитиназы исходным и мутантным штаммами S.marcescens при культивировании на средах с митомицином С и без него 128
2.1 АОбщая хитиназная активность в процессе роста исходного и мутантного штаммов S.marcescens 131
2.1.5.Состав внеклеточных белков с хитиназной активностью исходного и мутантного штаммов 137
2.1.6.Анализ нуклеотидных последовательностей промоторных участков генов различных хитиназ S.marcescens 140
2Л ,7.Получение частично очищенных хитиназ путем аффинной сорбции на хитине 142
2.1.8.Разделение хитиназ частично очищенного препарата путем изоэлектрического фокусирования 142
2.1.9.Фунгистатическая активность хитиназ S.marcescens 147
2.2. Регуляция биосинтеза внеклеточных рибонуклеаз различных видов бацилл 149
2.2.1.Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей полных генов барназы, биназы и РНКазы Вр 149
2.2.2.Сравнительное изучение синтеза РНКаз в процессе роста В.intermedins, B.pumilus и B.amyloliquefaciens 153
2.2.3.Исследование влияния неорганического фосфата на синтез РНКаз В.intermedins, B.pumilus, B.amyloliquefaciens 157
2.2.4.Изучение закономерностей роста рекомбинантных штаммов E.coli и накопления РНКаз в культуральной жидкости этих штаммов 162
2.2.5.Исследование экспрессии генов РНКаз В.intermedins, B.pumilus и В. amyloliquefaciens в рекомбинантных штаммах Е. coli 165
2.2.6.Биосинтез РНКаз В.intermedins, B.pumilus и B.amyloliquefaciens в присутствии актиномицина Д 170
2.3. Регуляция биосинтеза глутамилэндопептидазы В. intermedins 176
2.3.1 .Особенности биосинтеза глутамилэндопептидазы В. intermedins 176
2.3.2.Экспрессия гена глутамилэндопептидазы B.intermedius в рекомбинантных штаммах B.subtilis 190
2.3.3.Анализ нуклеотидной последовательности промоторного участка гена глутамилэндопептидазы В. intermedins 198
2.3 АБиосинтез глутамилэндопептидазы B.intermedius в условиях стресса.202
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 214
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 255
ВЫВОДЫ 258
ЛИТЕРАТУРА 260
- Роль структуры промоторов в регуляции экспрессии генов и сигма-факторы бактериальной клетки
- Белки ответа на стресс у грамотрицательных бактерий на примере E.coli
- Хитиназы
Введение к работе
Актуальность темы. Современная биотехнология включает целый ряд разнообразных, быстро развивающихся, социально ориентированных направлений исследований. При этом успехи биотехнологии во многом связаны с использованием ферментов и ферментативных систем, позволяющих оптимизировать традиционные производства путем замены химических подходов энзиматическими либо за счет повышения эффективности уже существующих ферментативных процессов. Актуальной проблемой биотехнологии является поиск простых и экономически выгодных подходов направленного влияния на уровень синтеза целевых белков. Выяснение роли адаптационных систем бактерий в регуляции синтеза ферментов может открыть перспективное направление в микробной биотехнологии, заключающееся в использовании новых аспектов теории стресса для оптимизации ферментативных производств. Однако в настоящее время молекулярные механизмы, контролирующие адаптационный потенциал микробной клетки, изучены недостаточно.
Бактерии обладают множеством регуляторных систем, позволяющих им быстро адаптироваться в неблагоприятных условиях и контролирующих широкий спектр процессов, протекающих в клетке, включая образование жгутиков [Aizawa et al., 2000], синтез внутри- и внеклеточных ферментов [Kunst, Rapoport, 1995; Volker, Hecker, 2005], формирование состояния компетентности [Hamoen et al., 2003], переход к спорообразованию [Sonenshein, 2000], вступление в стационарную фазу роста [Головлев, 1999], образование некультивируемых форм [Романова с соавт., 2002]. В основе формирования перечисленных адаптационных реакций лежит регуляция экспрессии соответствующих генов на различных уровнях, в частности, на уровне инициации транскрипции [Lloyd et al., 2001; Mooney et al., 2005]. Широко распространена у бактерий позитивная регуляция экспрессии генов с участием сенсорно-регуляторных систем: фосфатный регул он или DegS-DegU система представляют собой примеры глобального контроля за процессами в клетке в стрессовых условиях [Wanner, 1993; Pragai et al., 2004; Eguchi, Utsumi,
2005]. У части клеток в условиях стресса включается механизм, генерирующий множественные адаптивные мутации (SOS-ответ) [Janion, 2001; Foster, 2005].
Секретируемые гидролазы бактерий в последние годы вызывают все больший интерес как модельные объекты при исследовании отдельных регуляторных процессов и как перспективные для промышленного использования ферменты. Так как усиленный синтез гидролитических ферментов является одним из способов адаптации бактерий к агрессивным условиям окружающей среды, установление молекулярных механизмов регуляции синтеза гидролаз может внести существенный вклад в выявление путей формирования ответа бактериальной клетки на стресс, а также позволит направленно влиять на уровень продукции этих ферментов.
Бактерии Serratia marcescens являются единственными представителями семейства Enterobacteriaceae, секретирующими в среду уникальные по свойствам гидролитические ферменты, включая хитиназы (КФ 3.2.1.14), и представляют собой адекватную систему для изучения механизмов регуляции синтеза хитинолитических ферментов. Циклизующие гуанилспецифичные рибонуклеазы (КФ 3.1.27) и глутамилэндопептидазы (3.4.21.19), продуцируемые различными видами бацилл, являются интересными моделями для исследования эволюционного развития ферментативной системы спорообразующих бактерий. Кроме того, хитиназы, РНКазы и глутамилэндопептидазы широко используются в биотехнологии, в молекулярной биологии, находят применение в медицине. Изучены физико-химические и каталитические свойства ферментов, установлены первичные структуры белков, клонированы и секвенированы соответствующие гены. Однако крайне мало работ посвящено изучению регуляции биосинтеза гидролаз, а накопленные данные, полученные традиционными физиолого-биохимическими методами исследования, часто противоречивы и недостаточно информативны. Все это определяет актуальность данной работы, посвященной исследованию конкретных молекулярных механизмов регуляции биосинтеза секретируемых гидролаз грамотрицательных и грамположительных бактерий в неблагоприятных условиях внешней среды.
Целью данной работы явилось установление механизмов регуляции биосинтеза ферментов гидролитического типа действия у Serratia marcescens и различных видов бацилл в условиях стресса.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие экспериментальные задачи:
Выяснение закономерностей биосинтеза хитиназ S.marcescens, РНКаз B.intermedius, B.pumilus, B.amyloliquefaciens и глутамилэндопептидазы В.intermedins в процессе роста бактерий.
Характеристика качественного и количественного состава хитинолитического комплекса штамма S.marcescens Bu-211 АТСС 9986. Характеристика мутантного штамма S.marcescens с повышенной хитиназной активностью.
Исследование влияния индуктора SOS-функций клетки митомицина С (МС) и субстрата фермента - хитина на биосинтез белков с хитиназной активностью у S.marcescens.
Анализ нуклеотидных последовательностей промоторов генов РНКаз B.intermedius, B.pumilus, B.amyloliquefaciens и глутамилэндопептидазы B.intermedius с целью обнаружения возможных консервативных участков для связывания с регуляторными белками.
Получение рекомбинантных штаммов E.coli, несущих плазмиды со структурными генами РНКаз B.intermedius, B.pumilus и B.amyloliquefaciens под собственными и гетерологичными регуляторными областями, а также рекомбинантных штаммов B.subtilis, несущих полный ген глутамилэндопептидазы B.intermedius, для изучения экспрессии генов данных ферментов.
Выяснение механизмов регуляции биосинтеза РНКаз B.intermedius, B.pumilus и B.amyloliquefaciens в условиях недостатка и избытка неорганического фосфата и под воздействием специфического ингибитора транскрипции актиномицина Д (АД).
Исследование механизмов регуляции биосинтеза глутамилэндопептидазы B.intermedius в условиях солевого и температурного стрессов.
Научная новизна работы. К началу настоящей работы данные по биосинтезу хитиназ S.marcescens и гуанилспецифичных РНКаз бацилл были ограничены изучением влияния факторов внешней среды, а для глутамилэндопептидазы B.intermedius публикации по исследованию биосинтеза фермента отсутствовали. В данной работе впервые исследования регуляторных механизмов биосинтеза перечисленных ферментов проведены на качественно новом уровне и систематизированы, установлены конкретные молекулярные механизмы регуляции биосинтеза хитиназ S.marcescens, а также РНКаз и глутамилэндопептидазы бацилл в условиях стресса.
Впервые изучен качественный и количественный состав хитинолитического комплекса штамма S.marcescens Bu-211 АТСС 9986 и мутантного штамма S.marcescens Д5 с конститутивным синтезом хитиназ. Получены приоритетные данные о том, что в условиях индукции системы SOS-ответа происходит координированная индукция белков, обладающих хитиназной активностью.
Впервые на основе анализа нуклеотидных последовательностей генов, физиологических экспериментов и исследования экспрессии соответствующих генов в рекомбинантных штаммах E.coli и B.subtilis показана регуляция синтеза РНКаз и глутамилэндопептидазы бацилл посредством сенсорно-регуляторных систем на уровне транскрипции. Установлено, что секретируемые РНКазы бацилл по типу регуляции биосинтеза можно разделить на две принципиально различные группы: синтез РНКаз B.intermedius и B.pumilus индуцируется посредством активации двухкомпонентной системы PhoP/PhoR; синтез РНКазы B.amyloliquefaciens не подвержен регуляторным воздействиям со стороны данной системы. Показано, что АД стимулирует синтез РНКаз, регулируемых по типу активации генов фосфатного регулона, и не оказывает видимого эффекта на синтез РНКазы B.amyloliquefaciens. Биосинтез глутамилэндопептидазы B.intermedius также подвержен регуляции со стороны сенсорно-регуляторной системы. В данном случае системой, контролирующей регуляцию процесса
биосинтеза, является система трансдукции сигнала DegS/DegU, а внешним индуктором служат условия солевого стресса.
Практическая значимость работы. Выявленные в работе закономерности важны для общего понимания механизмов формирования ответа бактериальных клеток на стресс. Хитиназы, секретируемые S.marcescens, РНКазы и специфические протеиназы, секретируемые бациллами, могут найти применение в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве, а также в аналитических технологиях и промышленности. В ходе исследования охарактеризован новый штамм S.marcescens, синтезирующий внеклеточные хитиназы в отсутствие индукторов. Разработана биотехнологическая схема для получения препарата хитиназы S.marcescens в промышленных условиях, отраженная в акте об испытании на ГУП Опытный завод АН РБ. Оптимизированы и заявлены к патентованию питательные среды, обеспечивающие высокую продукцию всех исследованных ферментов. Исследована экспрессия генов РНКаз и 01и,Азр-специфической протеиназы бацилл в рекомбинантньгх штаммах E.coli и B.subtilis, соответственно. Полученные рекомбинантные штаммы предложены как продуценты соответствующих ферментов. В каждом отдельном случае подобраны условия накопления гетерологичных ферментов в культуральной жидкости рекомбинантных штаммов, что используется при получении белков в препаративных количествах для структурно-функциональных исследований в соответствии с актом о внедрении в Институте молекулярной генетики РАН.
Научные положения, выносимые на защиту:
Все исследованные гидролазы являются ферментами второй фазы роста, и максимум их активности приходится на стационарную фазу роста культуры. Факторы среды, регулирующие биосинтез ферментов, индивидуальны для каждой группы гидролаз.
В присутствии индукторов штамм S.marcescens Bu-211 АТСС 9986 секретирует в среду четыре белка с хитиназной активностью с молекулярными массами 58, 52, 38 и 21 кДа. Мутантный штамм
S.marcescens Д5 синтезирует хитиназы конститутивно и не нуждается в индукторах для продукции больших количеств ферментов.
В условиях активации системы SOS-ответа происходит координированная индукция биосинтеза всех четырех хитиназ S.marcescens.
Близкородственные гуанилспецифичные циклизующие РНКазы бацилл имеют принципиальные различия в регуляции их биосинтеза: экспрессия генов РНКаз В.intermedins и B.pumilus контролируется двухкомпонентной системой трансдукции сигнала PhoP/PhoR, тогда как регуляция экспрессии гена РНКазы B.amyloliquefaciens происходит по иному механизму.
Регуляция биосинтеза глутамилэндопептидазы В.intermedins осуществляется посредством сенсорно-регуляторной системы типа DegS/DegU системы B.subtilis в условиях солевого стресса Регуляция биосинтеза фермента не зависит от активации ав-фактора, а также от функционирования специфических механизмов, индуцирующихся при холодовом и тепловом шоке.
Связь работы с базовыми научными программами. Исследования по теме диссертационной работы проводились в соответствии с программой НИР КГУ (№ гос.регистрации 01.2.00 104982; «Биосинтез, биогенез, классификация, физиологические функции новых микробных ферментов и возможные области их практического применения»). Исследования автора как исполнителя данной тематики поддержаны грантами фонда «Университеты России - фундаментальные исследования» (№ 015.07.01.32), Российского фонда фундаментальных исследований (№№ 01-04-48037, 04-04-49385, 05-04-48182), фонда НАТО (HTECHLG. 97337213), фонда Санкт-Петербургского университета (№ Е00-6.0-15), фонда Российско-Американской Программы «Фундаментальные исследования и высшее образование» (№ REC-007), фонда НИОКР и Академии Наук РТ (№№ 04-02/99, 04-02/2000, 03-3.10-11, 03-3.10-295), фонда Else-Kroner, Fresenius Medical Care (2003-2004 гг.), Государственными контрактами №02.434.11.3020 «Конструирование противоопухолевых препаратов
селективного действия на основе микробных рибонуклеаз (2005-2006 гг.) и №02.451.11.7019 «Центр коллективного пользования КГУ», Государственной программой «Развитие научного потенциала высшей школы» РНП 2.1.1.1005.
Место выполнения работы. Экспериментальные данные получены автором за время работы на кафедре микробиологии Казанского государственного университета в период с 1991 по 2005 гг. Научные положения диссертации и выводы, вытекающие из анализа полученного экспериментального материала, базируются на результатах собственных исследований автора.
Исследования были начаты в НИЛ биосинтеза и биоинженерии ферментов кафедры микробиологии КГУ под руководством к.б.н. Л.В.Знаменской и д.б.н., проф. И.Б.Лещинской. Изучение экспрессии гетерологичных генов РНКаз бацилл в рекомбинантных штаммах E.coli частично проводили в лаборатории проф. А. Ди Донато (кафедра биохимии Университета г. Неаполь, Италия). Работа по исследованию хитинолитического комплекса S.marcescens выполнена в лаборатории к.б.н. Д.В.Юсуповой при участии к.б.н. Порфирьевой, к.б.н. Е.В.Петуховой и Р.Б.Соколовой (НИЛ ББФ, КГУ). Исследования экспрессии гена глутамилэндопептидазы В.intermedins в клетках B.subtilis частично были выполнены в лаборатории д.х.н. С.В.Кострова (Институт молекулярной генетики РАН, г. Москва). Работа по изучению биосинтеза глутамилэндопептидазы В.intermedins проходила в сотрудничестве с к.х.н. Н.П.Балабан, к.б.н. А.М.Мардановой и д.б.н. М.Р.Шариповой (НИЛ ББФ, КГУ).
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность проф. Р.Хартли и доктору Е.Б.Чернокальской (Национальные Институты Здоровья, США), проф. М.Дебарбюлье (Институт Пастера, Франция), проф. С.В.Кострову (ИМГ РАН, г.Москва), проф. Й.Йомантасу (ГНИЙ Генетика, г.Москва) за любезно предоставленные для работы штаммы и плазмиды, а также сердечно благодарит всех коллег, в сотрудничестве с которыми выполнена работа.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на III, IV, V Международных симпозиумах по РНКазам (Капри, 1993; Гронинген, 1996; Уоррентон, 1999), VI конференции «Новые направления биотехнологии» (Пущино, 1994), Международных симпозиумах по биотехнологии (Брайтон, 1994; Мельбурн, 1995), Международной конференции «Молекулярная биология на рубеже XXI века» (Москва, 1995), VIII Европейском конгрессе по биотехнологии (Будапешт, 1997), VII Всемирной конференции по промышленному использованию ферментов (Барселона, 1997), Международной конференции «Экологические эффекты микробиологических воздействий» (Вильнюс, 1997), V, VI и VIII Международных конференциях «Новые перспективы в исследованиях хитина и хитозана» (Щелково, 1999, 2001; Казань, 2006), V Симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2002), III съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), I Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), Всероссийской конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2004), XI, XII и XIII Всероссийских конференциях «Ферменты микроорганизмов» (Казань, 1998, 2001, 2005), Всероссийской конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 70 печатных работ, из них 30 статей в центральных отечественных и зарубежных рецензируемых журналах.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 316 страницах, и содержит 15 таблиц и 45 рисунков. Работа оформлена по стандартному плану и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов, выводы, список цитируемой литературы (629 наименований), приложения.
class1 Механизмы регуляции биосинтеза бактериальных ферментов на уровне
транскрипции class1
Роль структуры промоторов в регуляции экспрессии генов и сигма-факторы бактериальной клетки
У прокариот процесс транскрипции осуществляется с помощью одного фермента - ДНК-зависимой РНК-полимеразы, который участвует в синтезе всех типов РНК и, помимо каталитической функции полимеризации нуклеотидов, выполняет еще и регуляторную роль. В зависимости от скорости роста в клетке Escherichia coli присутствует от 1500 до 11400 молекул РНК-полимеразы [Wosten, 1998; Mooney et al., 2005].
Бактериальные РНК-полимеразы - это сложные белки, состоящие из нескольких разных субъединиц. Наиболее изучена РНК-полимераза E.coli. Холофермент содержит в своем составе две идентичные а-субъединицы, 0- и Р -субъединицы, ю- и а-субъединицы. Известна еще одна, отличающаяся от холофермента отсутствием а-субъединицы, ферментативно активная форма асфР ш, способная осуществлять только низкоэффективный, неспецифический и неупорядоченный синтез РНК на большинстве природных ДНК. Эта форма называется минимальным, или кор-ферментом [Burgess et al., 1969; Murakami et al., 2002]. Следует отметить большое структурное и функциональное сходство РНК-полимераз всех изученных эубактерий. Все они имеют одинаковый субъединичный состав. Одноименные субъединицы обладают сходной пространственной структурой, выполняют одни и те же функции, что наиболее ярко проявляется во взаимозаменяемости субъединиц РНК-полимераз филогенетически далеких видов [Moran et al., 1982; Wigneshweraraj et al., 2000; Murakami, Darst, 2003].
Цикл транскрипции начинается с того, что РНК-полимераза находит в ДНК промотор [Chamberlin, 1974; Fassler, Gussin, 1996]. Попадание РНК-полимеразы на промотор приводит к образованию так называемого закрытого промоторного комплекса, который не стабилен и может превращаться в открытый, где РНК-полимераза расплетает двойную спираль промотора в районе стартовой точки [Kirkegaard et al., 1983].
Исследование роли отдельных субъединиц РНК-полимеразы на разных стадиях цикла транскрипции показало, что Р и (3 субъединицы участвуют во всех стадиях цикла [Камзолова, Озолинь, 1980; Nene, Glass, 1984; Morse et al., 2002], ос-субъединица, вероятно, обеспечивает правильное соединение всех остальных субъединиц. Кроме того, комплекс а- и р -субъединиц (а2р ) участвует в неспецифическом прочном связывании с ДНК и в специфическом взаимодействии холофермента с промоторами [McClure, 1985; Borukhov, Lee, 2005]. Функция со-субъединицы неизвестна. Наиболее полно по сравнению со всеми другими субъединицами холофермента изучена роль а-субъединицы. Показано, что точное связывание и инициация транскрипции в промоторах происходит только после добавления к кор-ферменту а-субъединицы и образования холофермента, то есть а-субъединица участвует в узнавании промотора [Record et al., 1996; Murakami, Darst, 2003]. Однако последние исследования показали, что а-субъединицы вовлечены во все аспекты инициации транскрипции, включая узнавание промотора, расплетание двойной спирали ДНК, инициацию синтеза РНК, абортивную инициацию и «разъединение» с промотором [Borukhov, Severinov, 2002; Barnard et al., 2004].
Белки ответа на стресс у грамотрицательных бактерий на примере E.coli
После того, как заканчивается рост культуры E.coli на полноценной среде в связи с исчерпанием какого-либо элемента питания, начинается снижение содержания большей части белков в клетке, но одновременно синтез ряда белков усиливается и начинается синтез новых белков [Kolter et al, 1993]. В основном эти белки неидентичны, однако 15 из них составляют ядро, которое синтезируется при любых типах голодания [Nystrom, Neidhardt, 1992]. Более того, они синтезируются и при некоторых видах физико-химических стрессов. Практически все белки, участвующие в различных ответах на стрессы, идентифицированы. В эту группу входят: RpoS (KatF), или а (р )-альтернативная сигма-субъединица РНК-полимеразы, контролирующая экспрессию генов, индуцируемых голоданием по углероду или (в растущей культуре) осмотическим шоком; UspA - «универсальный стрессовый белок»; GroEL, GroES, DnaK, GrpE, HtpH, HtpM - молекулярные шапероны, известные вначале как белки теплового шока; гистоноподобный белок H-NS, участвующий в формировании нуклеоида и топологии ДНК; каталаза НРП из системы ответа на окислительный стресс; экзонуклеаза III; белки, кодируемые опероном ftsQAZ, и BoIA, участвующие в контроле клеточного деления; белки, контролирующие синтез гликогена и микроцина В17 [Nystrom, Neidhardt, 1992; Ishihama, 1997]. Синтез данной группы белков индуцируется множественными сигналами внешней и внутриклеточной среды. Попытки обнаружить общий регулятор этой системы успеха не имели.
RpoS-зависимая регуляция в E.coli индуцируется голоданием по углероду и при ответе на осмотический шок в растущей культуре. При этом синтезируется около 50 новых белков, от наличия которых зависит способность клеток переживать долговременное голодание. Центральным регулятором системы является альтернативная субъединица РНК-полимеразы а . Функция белка RpoS активируется в стационарной фазе, но экспрессия гена начинается еще в период экспоненциального роста. Основной из трех его промоторов, rpoSpl, является типичным представителем группы промоторов, получивших название «коробка скоростей», так как их активность обратно пропорциональна скорости роста культуры [Bohannon et al., 1991]. Синтез RpoS практически не регулируется на уровне инициации транскрипции, однако, на уровне элонгации транскрипции rpoS регулируется гуанозинтетрафосфатом, синтез которого синтетазой SpoT резко усиливается при голодании по углероду и который, видимо, препятствует преждевременной терминации транскрипции [Lange et al., 1995]. RpoS регулон активируется также и азотным дефицитом. Основной уровень регуляции RpoS - контроль его стабильности, так как он активно расщепляется протеосомой С1рХ/С1рР, ответственной за деградацию стрессовых белков [Zgurskaya et al., 1997]. Обнаружен ген rssB, активирующий протеолиз RpoS и обладающий высокой гомологией с генами белков-регуляторов двухкомпонентных систем сигнальной трансдукции. Белка-сенсора найти не удалось.
Из 50 генов RpoS регулона идентифицированы около 30. Среди кодируемых ими белков более 10 связаны с делением клетки, ее морфологией, структурой наружной мембраны, процессами транспорта, сюда же входят периплазматические белки. Большая группа генов участвует в формировании нуклеоида, изгибании и топологии ДНК, модуляции степени суперскрученности, в репарации. Несколько генов контролируют функции защиты от стрессов - теплового, осмотического, окислительного, фагового.
Идентифицированы ключевые гены синтеза и расходования запасных веществ - гликогена, трегалозы, полифосфатов, а также гены, контролирующие энергетический метаболизм и анаболизм [Lombardo et al., 2004].
Хитиназы
Хитин - второй (после целлюлозы) по распространенности природный биополимер. Он входит в состав опорных тканей и внешнего скелета членистоногих, насекомых, оболочек клеток микроорганизмов и грибов, где хитин находится в комплексе с белками и минеральными солями. Структура хитина имеет большое сходство с целлюлозой, одна из гидроксильных групп которой в хитине замещена аминоацильной группой.
В расщеплении хитина участвует широкий спектр ферментов: эндо- и экзохитиназы, хитозаназы, хитодекстриназы, хитобиазы, хитобиозидазы, глюкозаминидазы и др. [Peter, 2002].
Хитиназы (КФ 3.2.1.14), расщепляющие 1,4-3-гликозидные связи в молекулах полимера беспорядочно, и, таким образом являющиеся ферментами эндо-типа, осуществляют гидролиз хитина главным образом до олигосахаридов [Тиунова, 1989]. Экзохитиназы, названные сначала по аналогии с Срферментом целлюлазного комплекса СНрферментами [Тиунова, 1989], а позднее хитобиозидазами [Tronsmo, Harman, 1993], пока не имеют идентификационного номера. Эти ферменты последовательно отщепляют молекулы М,К -диацетил-3-В-хитобиозы от нередуцирующего конца молекулы хитина, продуктом реакции является диацетилхитобиоза [Robbins et al., 1988]. Существование экзохитиназ у микроорганизмов до 90-х годов только предполагалось, поэтому многими авторами до настоящего времени используется термин «хитиназы» применительно к ферментам, расщепляющим хитин до олигосахаридов и хитобиозы. Гидролиз хитина до мономера М-ацетил-Б-глюкозамина (N-АГА) происходит под действием комплекса хитинолитических ферментов: хитиназ и (3-N-ацетилглюкозаминидазы (КФ 3.2.1.30), или хитобиазы. Хитобиаза отщепляет мономеры N-АГА с нередуцирующих концов дисахарида хитобиозы и высокомолекулярных хитоолигосахаридов. Кроме того, обнаружены p-N-ацетилгексозаминидазы (КФ 3.2.1.52), которые действуют сходным образом, но являются менее специфичными ферментами [Bielka et al., 1984]. Однако, согласно последней классификации, p-N-ацетилглюкозаминидазы и P-N-ацетилгексозаминидазы объединены единым классификационным номером (КФ 3.2.1.52) [Coutinho, Henrissat, 1999].
В природе наряду с хитиназами встречаются хитозаназы (КФ 3.2.1.132) -ферменты, которые неупорядоченным образом гидролизуют частично дезацетилированное производное хитина - хитозан. Продуктом действия хитозаназ является, главным образом, хитобиоза [Fukamizo et al., 1994].
Для измерения активности всех перечисленных ферментов предложены оригинальные методы, наиболее полно представленные в обзоре Шпиндлера [Spindler, 1997].
Хитиназы обнаружены у представителей всех крупных таксономических групп: архей, эубактерий, простейших, грибов, высших растений, беспозвоночных и позвоночных [Fukamizo, Kramer, 1985; Gooday, 1986; Araki et al., 1995; Andronopoulou, Vorgias, 2004].
Физиологические функции хитиназ зависят от организма, в котором они обнаружены. У членистоногих эти ферменты участвуют в процессах морфогенеза, и биосинтез хитиназ резко возрастает во время линьки [Koga et al., 1983]. Хитиназы, обнаруживаемые в качестве пищеварительного фермента в кишечном тракте рыб, моллюсков и насекомых, являются, как правило, продуктом жизнедеятельности бактериальной микрофлоры, специфической для каждого организма [Matsumiya, Mochizuki, 1996; Peter, 2002]. Однако у некоторых позвоночных были обнаружены собственные хитинолитические ферменты [Overdijk et al., 1996]. Возможно, что в этом случае они выполняют защитную функцию, поскольку индуцируются при определенных патологиях. Например, у людей с болезнью Гоше в плазме крови обнаружен белок с хитиназной активностью, секретируемый активированными макрофагами [Boot et al., 1995]. У растений хитиназы являются частью защитной системы против грибных инфекций, механических повреждений, а также таких стрессовых воздействий, как тепловой и холодовой шок [Margispinheiro et al., 1994; Appel et al., 1995; Arakane et al., 2000]. У грибов хитиназы играют важную роль в процессах клеточного деления и дифференцировки, а также участвуют в питании энтомопатогенных грибов и таких микопаразитов, как Trichoderma [Gokul et al., 2000].
