Содержание к диссертации
Введение
I. ЛИПАЗА: СТРОЕНИЕ И ОСОБЕННОСТИ КАТАЛИЗА 9
1.1. Общая характеристика липаз из разных источников 9
1.2. Аминокислотный и углеводный состав И
1.3. Структура активного центра и поверхностная активация липазы 13
1.4. Механизм катализа и кинетические модели действия липаз 18
1.5. Факторы, влияющие на липолиз 21
1.6. Субстратная специфичность липаз 31
1.7. Методы определения активности липаз 34
1.8. Применение липаз 40
II СИСТЕМЫ ОБРАЩЕННЫХ МИЦЕЛЛ, ИХ ДОСТОИНСТВА 47
2.1 Системы обращенных мицелл, общие характеристики 47
2.2. Ферменты в системах обращенных мицелл: регуляция их активности и
олигомерного состава 49
2.3. Катализ липазой в системах обращенных мицелл 56
III. ЛИПОКСИГЕНАЗА: СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА 61
3.1. Нахождение в природе, катализируемые реакции и биолопіческая важность липоксигеназ 61
3.2. Структура активного центра и механизм катализа липоксигеназ 65
IV. КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПОЛИФЕРМЕНТНЫХ РЕАКЦИЙ 69
ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ 73
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 74
I. МАТЕРИАЛЫ 74
II. МЕТОДЫ 76
2.1. Характеристика препаратов ферментов 76
2.2. Определение каталитической активности ферментов 77
2.3. Химическая модификация ферментов 79
2.4. Седиментационный анализ 80
2.5. Изучение собственной флуоресценции липаз 81
2.6. Изучение стабильности липаз 81
2.7. Синтез ацилированного ацикловира, катализируемый липазой в системе обращенных мицелл 82
2.8. Изучение биферментной системы «липаза / липоксигеназа» 84
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 87
I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕПАРАТОВ ЛИПАЗ 87
1.1. Панкреатическая липаза свиньи 87
1.2. Липаза из Mucor miehei. 87
1.3. Липаза из Chromobacterium viscosum 87
II. РЕГУЛЯЦИЯ ЛИПОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ 89
2.1. Оптимизация условий катализа 89
2.1.1. Зависимость каталитической активности липаз от рН среды, температуры реакции и концентрации фермента 89
2.1.2. Кинетические характеристики реакций, катализируемых липазами в водной среде и в системе обращенных мицелл 93
2.1.3. Влияние ионов кальция и желчных солей на липолиз в водном растворе и в системе обращенных мицелл 98
2.2. Регуляция олигомерного состава липаз в системе обращенных мицелл 105
2.3. Регуляция активности липаз изменением концентрации ПАВ в системе обращенных мицелл 109
2.4. Химическая модификация липазы 116
2.5. Собственная флуоресценция липаз 121
2.6. Предполагаемая локализация липаз в системе обращенных мицелл 125
III. СТАБИЛЬНОСТЬ ЛИПАЗ 128
IV. РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЛИПАЗ 135
V. БИФЕРМЕНТНАЯ СИСТЕМА «ЛИПАЗА /ЛИПОКСИГЕНАЗА» 137
5.1. Катализ соевой липоксигеназой-1 в системе обращенных мицелл 138
5.2. Кинетические характеристики биферментной реакции: определение скорость лимитирующей стадии 140
5.3. Зависимости кинетических констант биферментного процесса от степени гидратации и концентрации АОТ в системе обращенных мицелл 142
5.4. Тестирование масел с помощью биферментной системы «липаза/ липоксигеназа» 144
ВЫВОДЫ 148
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 150
БЛАГОДАРНОСТИ 184
- Общая характеристика липаз из разных источников
- Системы обращенных мицелл, общие характеристики
- Нахождение в природе, катализируемые реакции и биолопіческая важность липоксигеназ
Введение к работе
Липазы (гидролазы высших триглицеридов) играют ключевую роль в обмене липидов всех живых организмов, а также участвуют в процессах отложения и утилизации жира, используемого в качестве энергетического резерва клетки. Липазы не только гидролизуют триглицериды в пищеварительном тракте до ди-, моноглицеридов и свободных жирных кислот, но также способны катализировать с высокой стереоспецифичностью ацилирование и деацилирование большого числа субстратов, отличных от глицеридов. Липазы стабильны в водных и органических средах и могут быть получены с хорошим выходом из растений, животных, а также из природных и рекомбинантных микроорганизмов. В настоящее время липазы находят широкое применение во многих областях, включая лечебную и диагностическую медицину, пищевую, косметическую и бумажную промышленности, производство детергентов и органический синтез. В результате, в последнее время особое внимание уделяется оптимизации биокаталитических характеристик этого фермента.
Исключительной особенностью липазы, отличающей ее от других эстераз, является свойство поверхностной активации фермента в присутствии агрегированных молекул субстрата (жировых капель), что обусловлено формированием активной конформации фермента в результате его адсорбции на поверхности липида. В литературе имеются указания на то, что адсорбция липазы на липидном монослое является определяющим фактором катализа липазой, предшествуя образованию фермент-субстратного комплекса. Очевидно, что эффективность взаимодействия липазы с поверхностью липида будет зависеть как от свойств межфазной поверхности (заряда, плотности, поверхностного натяжения и т.д.), так и от свойств самого фермента, в том числе от наличия на его поверхности функциональных групп углеводной и липидной природы. Вопрос о роли взаимодействия липазы с межфазной поверхностью в регуляции активности фермента представляет, с одной стороны, фундаментальный интерес для понимания закономерностей механизма катализа липазами разной природы, а с другой стороны, имеет важное прикладное значение, заключающееся в контролировании ферментативного процесса in vitro и в направленной регуляции катализа липазами при решении различных биотехнологических задач. Для решения данного вопроса представляется весьма удобной система обращенных мицелл, которая, в отличие от липидного монослоя, может быть использована как для моделирования мембранного окружения ферментов, так и для
проведения биокаталитических процессов. В случае системы этого типа эффективность взаимодействия фермента с межфазной поверхностью (слоем ПАВ) может регулироваться как путем изменения параметров системы, а именно, размера и числа мицелл, так и путем химической модификации (дополнительной гидрофилизации и гидрофобизации) поверхности фермента. Таким образом, основной целью работы явилось выявление регуляции липолитической и синтетической активности липаз раной природы в системе обращенных мицелл АОТ в изооктане изменением параметров системы (числа и размера мицелл) и свойств поверхности фермента. В качестве объектов исследования были выбраны широко используемые на практике липазы: панкреатическая липаза свиньи и липазы из Mucor miehei и Chromobacterium viscosum.
На сегодняшний день определение липолитической активности по-прежнему является непростой задачей, а существующие высокочувствительные методы обладают рядом недостатков, включающих: 1) дороговизну оборудования и реагентов; 2) неприменимость во многих природных средах и системах, содержащих амфифильные соединения, связывающие субстраты и продукты липолитических реакций; 3) применение синтетических субстратов, по отношению к которым липазы проявляют низкую активность. В связи с этим, другой важной задачей работы являлась разработка простого непрерывного метода определения активности липазы по отношению к природному субстрату (триглицериду) с помощью бнферментной системы «липаза /липоксигеназа», включающего липолитическое высвобождение полиненасыщенной жирной кислоты из триглицервда и последующее липоксигеназное окисление полиненасыщенной жирной кислоты до ее гидропероксида, регистрируемого спектрофотометрически.
Предлагаемая биферментная система «липаза / липоксигеназа» может быть удобной для изучения позиционной специфичности липаз из разных источников, если использовать в качестве субстрата триглицериды, содержащие полиненасыщенный ацильный фрагмент в строго опреленном 5л-положении триглицервда. Универсальность данной бнферментной системы также заключается в том, что замена липазы на фосфолипазу позволяет расширить круг изучаемых липолитических ферментов и определять их активность по отношению к природным субстратам, содержащим полиненасыщенные жирные кислоты.
В настоящий момент одной из важных практических задач в медицине и пищевой промышленности стоит проблема переработки жиров и получения триглицеридов, содержащих ненасыщенные жирные кислоты. Полиненасыщенные жирные кислоты, содержащие 1,4-цис,цис-пентадиенильный фрагмент и являющиеся субстратами
липоксигеназ, представляют собой предшественники биологически активных соединений (лейкотриенов, простагландинов, тромбоксанов и др.), выполняющих важные регуляторные функции и вовлеченных в иммунную систему организма человека. Известно, что утилизация именно этих жирных кислот снижает риск многих заболеваний, в том числе сердечно-сосудистых заболеваний, рака и воспалительных процессов различной этиологии.
Поэтому предлагаемая нами биферментная система «липаза / липоксигеназа» может оказаться удобной тест-системой и позволит оценивать качество пищевых масел и жиров, заключающееся в содержании в них биологически важных полиненасыщенных жирных кислот.
Общая характеристика липаз из разных источников
Липаза (гидролаза триациглицеридов, К.Ф. 3.1.1.3) представляет собой фермент, катализирующий in vivo гидролиз триглицеридов до моноглицеридов и жирных кислот [1]. Липолитический процесс в пищеварительном тракте животных и человека контролируется желудочными липазами, гидролизующими около 10% пищевых триглицеридов до жирных кислот и .ш-1,2-диглицеридов, и далее панкреатическими липазами, осуществляющими превращение триглицеридов и /7-1,2-диглицеридов в жирные кислоты и .sn-2-моноглицериды, которые лете усваиваются организмом.
Липазы также способны катализировать при определенных условиях обратную реакцию ацилирования жирной кислотой глицерина, моно- и диглицеридов, а также переэтерификацию триглицеридов (Рис.1). Несмотря на предпочтение к триглицеридам, липазы гидролизуїот большое разнообразие отличных от триглицеридов субстратов, таких как алифатические, ациклические, бициклические и ароматические эфиры и даже эфиры на основе органометаллнческих сендвич соединений [2]. По отношению к рацемическим эфирам или субстратам с разными пшроксильными группами, липазы реагируют с высокой энантио- и региоселективностью.
Липаза является широко распространенным ферментом, обнаруженным у животных [3-5], растениий [6,7] и микроорганизмов [8-Ю]. Коммерчески доступные липазы обычно производят из микроорганизмов, а с появлением генной инженерии увеличилось число липаз, производимых из рекомбинантных бактерий и дрожжей [3].
Обычно липазы являются одним из составляющих «гидролитического ферментативного коктейля», наработанного организмом с целью поддержания его роста. Процедура очистки липаз от эстераз и протеаз весьма трудоемка, так как аффинность липаз высока не только к границе вода/масло, но и к другим поверхностям с меньшей полярностью (вода / органический растворитель, стекло, пластик, воздушные пузыри), на которых липаза может обратимо адсорбироваться и денатурировать [11 ].
Оптимум действия большинства липаз лежит в области рН 7-9. Исключение составляют языковые и желудочные липазы позвоночных, тканевые липазы липосомного происхождения и липазы некоторых микроорганизмов, которые наиболее активны и стабильны при кислых рН [1]. рН-оптимум желудочных липаз равен рН 5.4 [12] в отличие от рН 8-9 для панкреатических липаз [13]. Липаза ID клещевины наиболее активна при рН 4.2, а липазы из микроорганизма Mucorpusillus проявляют максимальную активность в области рН 5-6 [1].
Липолитические ферменты могут действовать в очень широком диапазоне температур. Например, некоторые липазы микроорганизмов активны при -20С [1], а фермент из семян Vernoma anihelminthica — при 65С. Температурный оптимум большинства липаз лежит в районе 30-37 С.
Системы обращенных мицелл, общие характеристики
В тройных системах ПАВ-вода-органический растворитель в зависимости от химической природы и соотношения компонентов существуют термодинамически устойчивые состояния различных типов упаковки молекул ПАВ: прямые и обращенные мицеллы, жидкокристаллические структуры с ламеллярной, обращенной гексагональной и кубической упаковками молекул ПАВ [263]. Как видно на Рис.14, для тройной системы АОТ-вода-октан существует широкий набор условий, при котором формируются обращенные мицеллы АОТ.
Обращенные мицеллы ПАВ в органических растворителях представляют собой ассоциаты молекул ПАВ сферической или эллипсоидной формы, внутренняя полость которых образована полярными «головами», а внешняя поверхность - углеводородными «хвостами» этих молекул. Важным свойством таких систем является способность солюбилизировать воду и другие полярные вещества, причем солюбилизирующая способность сильно зависит от природы мицеллообразующего ПАВ [264]. Солюбилизация воды приводит к образованию гидратированных обращенных мицелл, которые сильно отличаются по размерам и форме от мицелл, существующих в безводных системах. При включении воды во внутреннюю полость мицелл происходит увеличение их размеров и числа агрегации, ассиметричность мицелл уменьшается и, мицеллы приобретают более сферическую форму [265].
Степень распределения обращенных мицелл по размерам сильно зависит от природы ПАВ [266]. Мицеллы, образованные аниоными ПАВ, характеризуются обычно узким распределением по размерам и форме, не зависящим от концентрации ПАВ [267]. Именно благодаря способности образовывать монодисперсные системы, наиболее широкое применение в различного рода физико-химических исследованиях нашли обращенные мицеллы на основе АОТ, натриевой соли ди-(2-этил)-гексилового эфира сульфоянтарной кислоты.
Радиус внутренней полости мицеллы определяется степенью гидратации w0 (w0 = [НгО]/[ПАВ]). Для обращенных мицелл АОТ эта связь описывается линейным уравнением (7) [268].
Вода, заполняющая внутреннюю полость гидратированных обращенных мицелл, по своим физико-химическим свойствам отличается от обычной (объемной) воды [269,270]. Масштаб различий определяется степенью гидратации w0 (w0 = [Н20]/[ПАВ]): при малых значениях w0 свойства мицеллярной и объемной воды различаются, однако по мере увеличения w0 различия постепенно сглаживаются [269]. Так, например, при малых степенях гидратации АОТ (w0 5) микровязкость мицеллярной воды более чем в 200 раз превышает вязкость объемной воды, а при w0 30 различия составляют лишь несколько раз [270]. Полярность микросреды внутренней полости обращенных мицелл существенно ниже полярности воды. Она не достигает значения полярности объемной воды даже при высоких значениях w0 [269]. Внутри мицеллы и полярность, и вязкость воды зависят от расстояния, то есть, имеет место градиент этих параметров от центра водной полости к её" границе. Основная причина наблюдаемой неоднородности - наличие внутри мицеллы слоев воды различной степени связанности [269]. При введении воды в систему обращенных мицелл АОТ в органическом растворителе первые 4-6 молекул воды прочно связываются ионами натрия, следующие 6-10 молекул воды идут на гидратацию сульфонатных групп. Образование самостоятельной водной микрофазы отмечено со степени гидратации, равной 10 [271].
Одним из главных достоинств мицеллярных систем является возможность строгого контроля состава и размеров мицелл путем простого изменения соотношения компонентов системы
Нахождение в природе, катализируемые реакции и биолопіческая важность липоксигеназ
На сегодняшний день известно немало сопряженных ферментативных систем, которые, как правило, используют для количественного определения концентраций многих биоорганических соединений. В качестве примера можно привести определение АТР в системе «гексокиназа / глюкозо-б-фосфат-дегидрогеназа» или в системе «пируваткиназа / лактатдегідрогеназа», а также определение гликогена с помощью «амилоглюкозидазы / глюкозидазы».
Известно всего лишь несколько работ, посвященых изучению биферментных систем в среде обращенных мицелл. На примере биферментных систем «глюкозооксидаза/ пероксидаза» [438], «пируваткиназа/лактатдегидрогеназа» [439] и «алкогольдегидрогеназа / формиатдегидрогеназа» [440] показано, что кинетика биферментных реакций в системах обращенных мицелл, как и в водном растворе, имеет лаг-период, определяемый каталитическими константами второго фермента. Для всех трех систем установлены более высокие значения скорости биферментных реакций в системах обращенных мицелл по сравнению с водным раствором.
Примером полиферментной системы, содержащей липазу, является система «липаза / глицерокиназа / глицерол-3-фосфат-оксидаза / пероксидаза», используемая для определения триглицеридов в сыворотке крови [441,442] согласно следующей последовательности реакций:
Реакции в полиферментных системах с кинетической точки зрения можно рассматривать как последовательные процессы, специфической особенностью которых является катализ ферментами каждой из стадии реакции. Простейшая кинетическая схема, включающая образование активного промежуточного метаболита, может быть представлена Схемой 5. где Sj - исходный субстрат, . — промежуточный метаболит, Р - продукт реакции, / и Ег - ферменты, участвующие на первой и второй стадиях, соответственно.
Предполагается, что в системе гомогенно распределены субстраты и ферменты, т.е. нет образования специфических комплексов между ферментами.
При постоянстве концентрации исходного субстрата (5/ = S0 = const) или в условиях его превращения на небольшую глубину, кинетику реакции описывает система уравнений (9):
Таким образом, концентрация промежуточного субстрата ограничена, и это ограничение определяется константой Михаэлиса второго фермента и отношением максимальной скорости второй реакции к скорости первой. В случае, когда максимальная скорость второй стадии существенно превышает скорость первой (V2n/v0), зависимость концентрации промежуточного субстрата от времени задается уравнением (12):
