Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Микроэмульсии вода/масло как среда для биохимических и химических процессов . 10
1.1. Высокоорганизованные системы на основе поверхностно активных веществ 10
1.2. Структура и физико-химические свойства обращенных мицелл 14
1.3. Методы исследования структуры обращенных мицелл 19
1.3.1. ЯМР самодиффузия 20
1.3.2. ЭПР спиновых зондов 23
1.3.3. Кондуктометрия 27
1.3.4. Другие методы исследования 29
1.4. Мицеллярный каталитический эффект 30
1.5. Ферменты в обращенных мицеллах 32
Глава 2. Методика измерений и объекты исследования 38
2.1. Объекты исследования 38
2.2. Кондуктометрия, 41
2.3. Исследование структуры монослоя АОТ обращенных мицелл методом ЭПР спинового зонда 41
2.4. Исследование структуры микроэмульсии методом ЯМР -самодиффузии 46
2.5. Исследование структуры белка методом ИК-спектроскопии 49
2.6. Кинетические измерения 51
Глава 3. Структура микроэмульсий вода/масло и локализация реагентов 54
3.1. Температурные изменения в структуре системы обращен ных мицелл, стабилизированных АОТ. ЯМР-самодиф фузия и электропроводность 54
3.2. Влияние модифицирующих добавок на процесс кластеризации обращенных мицелл . 62
3.3. Определение локализации субстрата по данным методов ЯМР-самодиф фузии и электропроводности 67
3.4. Изменения в структуре гидрофобного слоя обращенных мицелл под действием иммобилизованного фермента 69
Глава 4. Температурный фактор и кинетические эффекты в системе обращенных мицелл в химических процессах, моделирующих действие гидролитических ферментов 78
4.1. Щелочной гидролиз и-нитрофенил(этил)хлорметил-фосфоната в условиях кластеризации обращенных мицелл 78
4.2. Щелочной гидролиз и-нитрофенилацетата в системе обра-щенных мицелл 83
Глава 5. Каталитическая активность трипсина в условиях температурных изменений в микроэмульсионной среде 86
5.1. Температурный фактор и каталитическая активность трипсина в системе обращенных мицелл 86
5.2. Температурные изменения в структуре трипсина , 90
5.3. Влияние микроокружения на каталитическую активностьтрипсина в системе обращенных мицелл 94
Литература99
- Структура и физико-химические свойства обращенных мицелл
- Мицеллярный каталитический эффект
- Исследование структуры белка методом ИК-спектроскопии
- Определение локализации субстрата по данным методов ЯМР-самодиф фузии и электропроводности
Введение к работе
Ферментативные процессы лежат в основе функционирования любого живого организма. Особую роль в метаболизме играют процессы расщепления сложноэфирных и пептидных связей, протекающие под действием про-теолитических ферментов.
Ферментативные реакции в биологической клетке чаще всего протекают вблизи или на поверхности раздела фаз. Ферменты адсорбированы на биологических мембранах, встроены;в мембрану или иммобилизованы внутри замкнутых мембранных структур. Даже плазматические ферменты зачастую образуют ассоциаты с компонентами клетки и функционируют в составе субклеточных единиц. Среда,; в которой существуют ферментыin vivo, по своим физико-химическим свойствам (полярность, вязкость, диэлектрическая проницаемость и пр.) и химическому составу существенно отличается от водных растворов, используемых в большинстве энзимологических исследований.- ; :'
Более двадцати пяти лет назад была предложена [Мартинек, 1977] уникальная по своим свойствам система - дисперсии обращенных мицелл, позволяющая максимально естественно моделировать природную иммобилизацию ферментов и их локальное микроокружение. Оказалось, что водорастворимые ферменты можно солюбилизировать в органических растворителях с помощью поверхностно-активных веществ (ПАВ), сохраняя при этом их каталитическую активность. Система обращенных мицелл представляет собой одну из структурных разновидностей .микроэмульсий [Миттел, 1980] - дисперсию микрокапель воды в органической жидкости. Поверхность водных микрокапель стабилизируется мономолекулярным слоем ПАВ, полярные головные группы которого расположены на водной поверхности микрокапли, а углеводородные радикалы ориентированы в сторону объемной органической фазы. Дисперсии обращенных мицелл обладают качествами, незаменимыми
7 при исследовании механизмов функционирования ферментов [Березин, 1985]: 1) простота приготовления; 2) возможность изменения в широких пределах количества воды в микроокружении фермента; 3) термодинамическая устойчивость и оптическая прозрачность систем, позволяющая контролировать структуру и каталитическую активность фермента спектральными методами; 4) обеспечение реакционного контакта водорастворимого фермента с водонерастворимыми субстратами. Несмотря на то, что природа не подготовила ферменты для функционирования в системах с органическим растворителем, изучение закономерностей биокатализа в таких системах позволяет получать принципиально новые данные о стабильности белков и силах, поддерживающих каталитически активную конформацию ферментов [Гладилин, 1998]. Установлено, что многие ферменты демонстрируют хорошую стабильность и высокую активность в системах обращенных мицелл, хотя в сравнении с водной; средой могут проявлять специфические особенности (изменение оптимума рН, субстратной специфичности и др.). Особенности поведения ферментов в системе обращенных мицелл имеют многочисленные экспериментальные подтверждения. Для объяснения «суперактивности» и субстратной специфичности ферментов в этих средах предложены теоретические модели, в которых рассматриваются различные аспекты влияния микроокружения на ферменты: изменения в структуре молекулы фермента [Walde, 1988; Stupishina, 2001], увеличение жесткости молекулы фермента под действием мицеллярной матрицы [Levashov, 2001; Klyachko, 2003], солевые эффекты [Walde, 1988; Fadnavis, 1998] и пр.
Параллельно, на протяжении последних десятилетий постоянно возрастает интерес к использованию различных микроэмульсионных сред, в частности обращенных мицелл, в качестве среды для проведения различных химических процессов не только ферментативной природы. Это обусловлено свойствами подобных систем солюбилизировать значительные количества веществ различной полярности (эффект концентрирования) и обеспечивать
надежный контакт между соединениями несовместимыми в обычных условиях за счет большой межфазной поверхности [Garti, 2003; Holmberg, 2003; Kumar, 1999; Texter, 2001; Levashov, 2001; Schwuger, 1995; Qi, 1997].
Свойства микроэмульсии в первую очередь определяются составом системы. Вместе с тем, хорошо известно [Moulik, 1998], что вносимые добавки, в том числе химические и биохимические реагенты, могут существенно модифицировать ее структуру и физико-химические свойства. Одной из наиболее распространенных в мицеллярной энзимологии систем является обращенная микроэмульсия, стабилизированная анионным ПАВ Аэрозолем ОТ (АОТ), Наряду с такими свойствами, выигрышными с позиций мицеллярной энзимологии, как высокая солюбилизирующая емкость по отношению к воде, незначительное распределение по размерам мицелл, эта система характеризуется тенденцией мицелл к кластеризации [Moulik, 1998]. Условия, при которых происходит спонтанная кластеризация мицелл в обращенных микроэмульсиях на основе АОТ, являются следствием внутренних перестроек в мицеллах. При этом возможны локальные изменения параметров локального микроокружения солюбилизированных реагентов.
Основной целью работы является изучение структурных характеристик обращенных микроэмульсий на основе АОТ как среды для ферментативных процессов, а именно для гидролитического расщепления сложно-эфирных связей в присутствии трипсина, и поиск взаимосвязи между структурными и каталитическими характеристиками системы. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Изучить температурные изменения в структуре обращенных микроэмульсий методами ЯМР-самодиффузии и кондуктометрии.
Исследовать влияние добавок/реагентов на структуру гидрофобной оболочки обращенных мицелл на основе АОТ методами ЭПР спинового зонда и кондуктометрии.
9. .
На примере щелочного гидролиза сложных эфиров изучить каталитический эффект системы обращенных мицелл в условиях ее структурных перестроек под действием температуры,
На примере гидролиза N-a-бензоил-і-аргинин этилового эфира (БАЭЭ) и л-нитрофенилацетата (ПНФА) в присутствии трипсина исследовать взаимосвязь структуры и каталитических свойств системы «фермент - обращенная мицелла».
Структура и физико-химические свойства обращенных мицелл
Последние десятилетия характеризуются все возрастающим интересом к дисперсиям обращенных мицелл или мироэмульсиям вода/масло благодаря их разнообразным и уникальным свойствам [см. например, обзоры Luisi, 1988; Метелица, 1988; Moulik, 1998].Обращенные мицеллы (рис. 3) состоят из водного ядра, как правило, сферической или эллипсоидальной формы, окруженного монослоем ПАВ. Полярные фрагменты молекул ПАВ обращены внутрь мицеллы, а углеводородные хвосты находятся в гидрофобном растворителе. Радиус водного ядра сферической мицеллы определяется степенью гидратации ПАВ [Lang, 1988], которая определяется как молярное отношение воды к ПАВ Wo=[H20]/[nAB]. Зависимость радиуса водного ядра обращенной мицеллы от Wo можно представить в виде [Zulauf, 1979]где V} - объем молекулы воды, V2 - объем молекулы ПАВ, rw -радиус водного ядра и L — длина молекулы ПАВ.
Обращенные мицеллы представляют собой динамические образования, которые с высокой скоростью обмениваются молекулами ПАВ между собой и дисперсионной средой. Время жизни молекулы ПАВ в составе мицеллы составляет около 10"7 с, а время жизни мицеллы 1 — 10"3 с [Русанов, 1992]. Кроме того, молекулы ПАВ, входящие в состав обращенных мицелл, непрерывно совершают быстрые колебания, подобные колебанию птичьего пера при сильном ветре [Martin, 1981]. Интенсивность колебаний зависит от степени гидратации обращенных мицелл. В то же время, несмотря на высокую подвижность молекул ПАВ, поверхность раздела водной и масляной фаз остается непроницаемой для окружающего мицеллу органического растворителя. Вода, заполняющая внутреннюю полость обращенных мицелл, отличается по своим физико-химическим свойствам от объемной воды. Степень различий определяется гидратацией обращенных мицелл (Wo). При малых значениях Wo свойства мицеллярной и объемной воды сильно различаются, однако по мере увеличения этого соотношения различия постепенно сглаживаются [Jain, 1989; Karukstis, 1996]. Причина состоит в том, что первые порции добавляемой в систему воды прочно связываются молекулами ПАВ за счет гидратации полярных частей этих молекул. Количество связанной воды составляет 4 - 10 молекул на молекулу ПАВ в зависимости от природы последнего. Так называемая, свободная вода, приближающаяся по своим свойствам к объемной воде, появляется внутри мицеллы только после завершения гидратации ПАВ. Условно водное ядро обращенной мицеллы делят на три области: свободную, связанную и граничную (находящуюся между головными группами молекул ПАВ) (рис.3). Эти области различаются по своим характерным свойствам, таким как эффективная диэлектрическая константа, вязкость, подвижность (вращательная и поступательная) и т.д. На рисунке 4. показано как меняется доля каждой области с увеличением W0 на примере микроэмульсии на основе АОТ.
Внутренняя полость гидратированных обращенных мицелл, стабилизированных ионогенньши ПАВ характеризуется высокой концентрацией электрических зарядов, возникающих при ионизации полярных групп молекул ПАВ. В результате диссоциации молекул АОТ, например, до 70 % про-тивоионов Na+ может находиться в водной фазе мицеллы в свободном состоянии [Lang, 1988]. Локальное значение рН водной полости мицеллы может существенно отличаться от рН исходного раствора [Smith, 1980]. Для анионных ПАВ микросреда внутренней полости мицелл является, в общем, более кислой по сравнению с исходным раствором, а для катионных ПАВ -более щелочной. На рис. 5 показано как изменяется рН водного ядра обращенной мицеллы АОТ в изо октане в зависимости от значений рН исходного раствора.
Введение в микроэмульсию каких-либо добавок может изменить микроструктуру мицелл и повлиять на их свойства. Локализация добавок происходит в соответствии с их гидрофильно-липофильными свойствами. Небольшие молекулы, растворимые в неполярных средах, как правило, локализуются в объемной масляной фазе и не оказывают существенного влияния на структуру обращенных мицелл [Pileni, 1985]. Водорастворимые молекулы встраиваются во внутреннее водное ядро обращенных мицелл. Если молекула добавляемого вещества сравнима по размерам с водным ядром мицеллы, то ее внесение может привести к небольшому уменьшению размера мицеллы [Luisi, 1988]. Молекулы веществ, обладающих амфифильными свойствами, встраиваются в поверхностный слой мицелл, изменяя его свойства. Полимерные молекулы, намного превышающие размеры мицелл, также могут солю билизироваться в микроэмульсии вода/масло, образуя конгломераты из-мицелл, нанизанных на полимерную цепочку подобно «ожерелью» [Meier, 1996]. Используя простую геометрическую модель, можно предсказать изменения радиуса мицелл при внесении в них добавок [Luisi, 1988]. Предполагая, что мицелла имеет сферическую форму, записываем выражение для ее радиусагде R, V и S соответственно радиус, объем и поверхность сферы. Если добавка располагается в поверхностном слое, то площадь поверхности мицеллы увеличивается на величину dS. Если добавленное вещество проникаетвнутрь мицеллы, объем внутренней полости увеличивается на величину dV . Таким образом, радиус ядра мицеллы будет равен
Величина его будет изменяться в зависимости от значений dS и dV. Таким образом, при локализации добавки в поверхностном слое мицеллы будет происходить уменьшение радиуса водного пула, в то время как солюбилиза-ция вещества внутри водного ядра мицеллы приведет к увеличению его радиуса и размера мицеллы в целом. Подтверждение данной модели было получено при исследовании влияния аминов на структуру водных мицеллярных растворов и микроэмульсий масло/вода [Миргородская 1998 и 2001, Mir-gorodskaya, 2000].Органические вещества, обладающие сходными характеристиками гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ), но различающиеся по своему химическому строению, могут оказывать различное действие на мицеллярные системы. Так, исследование влияния некоторых ароматических соединений
Мицеллярный каталитический эффект
Последние десятилетия ми це ллярный катализ находится под пристальным вниманием исследователей [Tondre, 2001; Brinchi, 2000; Разумов, 1996; Bunton, 1991]. Принципиальное отличие мицеллярных сред от гомогенных растворов (водных, не водных или водно-органических) состоит в том, что определяющую роль в них играет локальный эффект [Березин, 1977; Штыков, 2002]. Это означает, что изменение свойств веществ, солюбилизирован-ных в микроэмульсиях, обусловлено состоянием среды только в их микроокружении, а не во всем объеме. Можно выделить ряд свойств микроэмульсий, которые, в основном, определяют мицеллярный каталитический эффект: 1. Способность солюбилизировать вещества, нерастворимые в растворителе, образующем дисперсионную среду; 2. Способность сближать и приводить в реакционный контакт вещества, значительно различающиеся по своему гидрофобно-липофильному ба . лансу; 3. Возможность концентрирования реагентов в зоне реакции за счет электростатических и гидрофобных взаимодействий между молекулами реагентов и мицеллами; 4. Значительная микрогетерогенность среды внутри микрофазы, выражающаяся в резком изменении диэлектрической проницаемости, микровязкости, микрополярности, микрокислотности и других физико-химических свойств в нанометровом масштабе. Реагенты, в зависимости от своей природы и природы мицеллярной системы, могут локализоваться в самых различных участках высокоорганизованной системы. Таким образом, реализуется их вынужденное сближение, концентрирование и взаимодействие.
Возможность менять локальные параметры микроокружения, такие как диэлектрическая проницаемость, микровязкость, микрополярность и т.п. позволяет целенаправленно влиять на свой ства каждого из компонентов реакции и на скорость и механизм реакции в целом. Были обнаружены некоторые общие закономерности для катализа в мицеллярных системах [Molinero, 1996]. Так катионные мицеллы, как правило, катализируют реакцию отрицательных ионов с гидрофобным субстратом, анионные оказывают в этом случае ингибирующий эффект и катализируют реакцию с участием положительных ионов. Неионные мицеллы практически не оказывают влияния на прохождение химических реакций. Примером может служить щелочной гидролиз органофосфорных соединений, который ускоряется мицеллами катионных ПАВ и замедляется мицеллами анионных ПАВ [Martinek, 1977]. В этом случае основной причиной мицеллярного каталитического эффекта является концентрирование (или в случае ингибирова-ния разделение) реагентов в мицеллярной псевдофазе. Субстрат (в зависимости от своей структуры) полностью или частично солюбилизируется мицеллами, а концентрация гидроксид иона в мицеллярной псевдофазе определяется поверхностным потенциалом мицеллярной поверхности. На мицеллярный катализ оказывают влияние такие факторы как, например, свойства и структура ПАВ, концентрация ПАВ и субстрата, температура, свойства и концентрация добавок. Добавки, изменяющие поверхностный потенциал мицелл, например электролиты [Grand, 1990], спирты [Kib-blewhite, 1987] и со-ПАВ [Hobson, 1994] также влияют на скорость мицеллярного катализа. Электролиты уменьшают поверхностный потенциал мицелл. При увеличении концентрации электролитов до некоторого значения Ссг наблюдается переход сфера-цилиндр [Ikeda, 1984], который оказывает влияние на скорости реакций в мицеллярных средах. В работе [Zakharova, 1998] было исследовано влияние добавок КС1, КВг и салицилата натрия (NaSal) на щелочной гидролиз О-этил-О-и-нитрофенилэтилхлорметилфосфоната в водных мицеллярных растворах цетилпиридинии бромида. Ингибирование реакции, как показано, вызвано изменениями в структуре и свойствах мицеллярных агрегатов и снижением концентрации нуклеофила вблизи мицелл из-за уменьшения их поверхностного потенциала. Высокоорганизованные среды такие, как мицеллы, микроэмульсии и жидкие кристаллы могут рассматриваться как биомиметические структуры, действующие по принципу гость-хозяин. Одним из наиболее важных свойств биокаталитических систем является их субстратная специфичность [Ленинд-жер, 1976]. Влияние структуры субстрата на каталитический эффект прямых мицелл было исследовано в работах [Захарова, 2000 и Zakharova, 1999]. Существует много работ по исследованию влияния модификации добавками микроэмульсионных и мицеллярных систем на скорость прохождения реакций [Ruan, 2001; Нао, 2000]. Кинетика большинства реакций в ми-целлярном катализе хорошо описывается в рамках псевдофазной модели, предложенной в работе [Menger, 1967] и дополненной позже [Мартинек, 1977]. Исследование ферментов в системах обращенных мицелл ведется в течение последних 20 - 25 лет [Luisi, 1988; Klyachko, 2003]. С одной стороны микроэмульсии вода/масло можно рассматривать как модели биологических мембран, поскольку поведение ферментов в мицеллярном окружении позволяет промоделировать роль биологической мембраны в биокатализе [Грин-штейн, 2001; Chang, 2000]. С другой стороны, обращенные мицеллы широко применяются в биотехнологии и биоорганическом синтезе [Мартинек, 1985; Stamatis, 1999]. Существуют три основных способа приготовления фермент-содержащей микроэмульсии вода/масло. Согласно первому способу [Мартинек, 1977], водный раствор белка добавляется в раствор ПАВ в органическом . растворителе (безводный, либо с небольшим содержанием воды).
Полученная смесь тщательно перемешивается, пока не становится прозрачной. Этот способ наиболее прост в исполнении. Второй способ [Menger, 1979] заключается в том, что готовится мицел-лярной раствор с требуемой степенью гидратации. Затем в нем растворяется сухой (лиофилизованный) фермент, путем тщательного перемешивания. Преимуществом этого метода является возможность получения максимально высоких конечных концентраций белка в системе. Однако то,,что фермент находится в длительном контакте с растворителем, приводит к его частичной денатурации. В основе третьего метода [Hanahan, 1952], лежит возможность спонтанного перехода фермента из одной фазы в другую в системе, состоящей из равных долей водного раствора белка и раствора ПАВ в органическом растворителе. Этот процесс достаточно медленный (может занимать от нескольких часов до нескольких дней), кроме того, контакт фермента с областью раздела фаз, может привести к его дезактивации. Поэтому последний метод чаще применяется для очистки белка от примесей, чем для задач ферментативного катализа. Кинетика ферментативных реакций в системе обращенных мицелл в большинстве случаев следует классическому уравнению Михаэлиса. Однако, величины определяемых кинетических параметров являются эффективными и зависят от степени гидратации и концентрации мицелл. Наблюдаемые параметры (такие как константа Михаэлиса, Кт) в микрогетерогенных системах зависят от локальных концентраций реагентов. Реакционная способность ферментов в мицеллярных системах обычно характеризуется величиной каталитической константы, kcah что позволяет избежать влияния эффектов концентрирования. Однако kcat зависит от структуры мицелл и их размера. Зависимость ксас от размера мицелл (или от величины молярного отношения во
Исследование структуры белка методом ИК-спектроскопии
Метод инфракрасной (ИК) спектроскопии применялся для контроля структурных изменений в молекулах фермента, солюбилизованных в обращенных мицеллах. В ИК диапазоне пептидные соединения имеют пять основных полос поглощения, относящихся к колебаниям группы OCNH — амид А, В, I, II, III. Диполь-дипольное взаимодействие пептидных групп в упорядоченной вторичной структуре приводит к расщеплению полос и сдвигу относительно положения, характерного для изолированной пептидной группы. Величина этого расщепления зависит от взаимной ориентации и расстояния между колебательными диполями и несет информацию о конформации полипептидной цепи. Сложность пространственной структуры молекулы белка приводит к размыванию спектра, который представляет собой набор перекрывающихся компонент, обусловленных участками с различной регулярностью. Для достижения сужения компонент спектра используют операцию взятия второй производной [Dong, 1990]. Соотнесение компонент амидного спектра с определяемой вторичной структурой основывается на теоретических расчетах [Krimm, 1986] и на эмпирических корреляциях с модельными полипептидами. Общепринято считать, что к а-спирали относится компонента полосы амид I с частотой максимума в интервале 1650-1658 см , а амидные группы, включенные в состав р-слоев имеют ряд характерных полос в интервале 1620-1640 см-1 [Krimm, 1986]. Изучение структуры трипсина проводилось на ИК - Фурье спектрофотометре Vector-22 (Bruker) при спектральном разрешении 4 см". Спектры записывались после 64 накоплений. Измерения выполнены в температурном диапазоне 20-80 С в термостатируемых кюветах -10 мкм из CaF2. На рисунке 19 в микроэмульсии с белком присутствует максимум на полосе амид II ( 1550 см"1), который относится к поглощению пептидных групп трипсина. Максимум в области 1630 см 1 соответствует суперпозиции полос поглощения воды и белка. Для выделения полосы амид 1 белка из спектра микроэмульсии с белком вычитали спектр микроэмульсии без белка. Сигнал на полосе амид I (1630 см"1) был отнесен к р-структуре трипсина.
Реакции, скорость которых линейно зависит от концентрации только одного из вступающих в реакцию веществ, называют реакциями первого порядка (Aj -константа скорости 1-го порядка). Уравнение (16) может описывать и реакции более высокого порядка при значительном преобладании одного из реагентов, когда изменением его концентрации в ходе процесса можно пренебречь (условия псевдопервого порядка). В этом случае константу к{ называют эффективной (наблюдаемой или кажущейся) константой скорости и обозначают (или k0bs) Для нахождения k0bs используют графический метод решения уравнения (16), где тангенс угла наклона зависимости (іп(ЛҐ0/А"),ґ) равен кажущейся константе скорости реакции. В ходе ферментативной реакции субстрат образует комплекс с активным центром фермента, в котором происходят фермент-субстратные изменения, образуются продукты реакции, которые уходят из активного центра, освобождая его для взаимодействия с новой молекулой субстрата [Варфоломеев, 1998]. Согласно уравнению Михаэлиса-Ментен, начальная скорость реакции V0 зависит от концентрации субстрата Sa при этом параметр Vm (максимальная скорость реакции) линейно увеличивается с ростом количества фермента, вводимого в реакцию: где Е0 - начальная концентрация фермента, kcat — каталитическая константа реакции (Кт — константа Михаэлиса). Кинетические измерения проводили на спектрофотометре UV-VIS Spe-cord. Кинетику щелочного гидролиза наблюдали по изменению оптической плотности полосы 400 нм (412 нм для я-нитрофенилацетата), что соответствует образованию л-нитрофенолят-аниона. Наблюдаемые константы скорости kobs определяли по зависимости ІпСД, - D) =-kobst + const, где D и Д , оптическая плотность раствора в момент времени t и по окончании реакции соответственно. Значения kobs рассчитывали методом взвешенных наименьших квадратов. Каталитическую константу кса( находили по формуле (18). Изменение концентрации субстрата (БАЭЭ) от ОД до 1,3 мМ несущественно влияло на определяемую величину начальной скорости реакции (VQ) В буферном растворе.
В рамках уравнения Михаэлиса - Ментен это свидетельствует о том, что фермент работает в режиме, приближающем его к полному насыщению субстратом. Для микроэмульсии вода-АОТ-декан, вследствие, по-видимому, частичного электростатического связывания положительно заряженного субстрата с ионизованными отрицательно заряженными головками АОТ, мы на
Определение локализации субстрата по данным методов ЯМР-самодиф фузии и электропроводности
В основе молекулярных механизмов, определяющих функциональную стабильность ферментов в системе обращенных мицелл, лежит не только модификация структурно-функциональных свойств белковой макромолекулы под влиянием среды. В системе, характеризующейся высокой степенью микрогетерогенности структуры, немаловажным может быть доступность субстрата для второго реагента. Мы использовали данные физических методов для оценки локализации органических субстратов, которые используются в настоящей работе в качестве объектов для химической трансформации, в ми-целлярной системе. Особенности микроэмульсий вода/масло, стабилизированных АОТ, позволили использовать явление кластеризации мицелл для определения локализации добавок/субстратов в структуре обращенных мицелл. На рис. 29 представлены результаты диффузионных исследований обращенной микроэмульсии, содержащей п-нитрофенил(этил)хлорметилфосфонат (IV)- сложный эфир фосфоновой кислоты, который использовался для исследования мицеллярного каталитического эффекта [Zakharova, 1998; Захарова, 1999]. Структура этого соединения позволяет предполагать его локализацию в различных фазах системы. С этим согласуется вид температурной зависимости КСД IV (рис. 29). Действительно, если IV полностью растворен в декане, логично предположить аррениусовскую зависимость его КСД с наклоном параллельным КСД декана. Пользуясь моделью двух состояний (ур-е 8) мы определили, что во всем температурном диапазоне только 52 % IV растворены в дисперсионной фазе (декан), а остальная часть локализована в обращенных мицеллах. При расчете КСД IV в составе мицелл приравнивался к КСД мицелл (DJOT), а соответствующее значение КСД IV в свободном состоянии было получено из независимых измерений раствора IV в декане. Анализ места локализации IV в структуре обращенных мицелл основан на форме его температурной зависимости. Если бы IV был локализован в водных ядрах мицелл, температурные изменения его диффузии должны повторять температурные изменения КСД воды. Из данных, приведенных на рис. 29 , следует, что температурная зависимость КСД IV имеет сходный вид с DAOT, и отражает все структурные перестройки гидрофобной оболочки мицелл. Таким образом, и-нитрофенил(этил)хлорметилфосфонат распределяется между объемным деканом и мицеллами, причем в составе мицелл он локализован в их в поверхностном слое, сформированном молекулами АОТ. Изучение локализации других соединений, также часто используемых в кинетических исследованиях, было проведено кондуктометрическим методом. Установлено, что соединения I и II оказывают различное влияние на положение перколяционного перехода в микроэмульсии на основе АОТ (рис. 30). В отличие от БАЭЭ (I), который растворим в воде, концентрируется в водных ядрах обращенных мицелл и не влияет на положение перколяционного перехода (рис. 30а), существенное изменение Тп для случая с БАПНА (II) (рис. 306) свидетельствует о его локализации в гидрофобном слое мицелл.
В соответствии с моделью «фиксированного объема» [Levashov, 2001], если размер молекулы белка превышает размер водного ядра обратной мицеллы, солю бил изация молекулы белка в водном ядре не вызывает увеличения размера мицеллы. Вода из ядра мицеллы вытесняется молекулой белка в монослой ПАВ, чему имеются экспериментальные подтверждения [Шапиро, 1993]. Нами проведено экспериментальное изучение изменений в структуре гидрофобной оболочки мицелл под действием вытесненной воды. С этой целью выбраны системы обращенных мицелл с различным радиусом водного ядра. Согласно известному соотношению [Levashov, 2001]:можно оценить радиус белка Rp по его молекулярной массе Мр. Для трипсина с молекулярной массой - 24 000 Да средний радиус молекулы равен 2 нм. Одна из выбранных микроэмульсий (W0=12) близка по размеру водного ядра мицелл (Rw=2,2 нм) к среднему радиусу белка, тогда как другая значительно его превышает (Wo=20, RW=3A нм). Ранее, методом 13С ЯМР было показано [Шапиро, 1993], что при встраивании молекулы сс-химотрипсина в обращенные мицеллы происходит вытеснение молекул воды в гидрофобную область мицеллы вплоть до расстояния 0,5-0.7 нм от границы раздела вода - АОТ. Подобное поведение можно ожидать и в случае трипсина. Для молекулы трипсина в обращенной мицелле можно оценить расстояние, на которое возможно вытеснение воды, исходя из простых геометрических соображений, рассматривающих увеличение радиуса сферы при включении в нее сфероидальной частицы:
Очевидно, что при меньшем Rw относительное увеличение радиуса будет больше, т.е. возможно более глубокое проникновение воды в гидрофобную оболочку обращенной мицеллы, что соответствует ARW-0A5 нм при Wo=12 и 0.22 нм при W0=20.Чтобы убедиться, что солюбилизация белка в системе не приводит к увеличению размера мицеллы, выполнены измерения коэффициентов самодиффузии «пустых» и «заполненных» мицелл. На основании измерений для системы W0=12 была произведена оценка относительного изменения радиуса
