Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 8
1.1. Строение порфина и его производных 8
1.2. Природные металлопорфирины и их свойства 8
1.3. Металлопроизводные фталоцианина 11
1.4. Водорастворимые порфирины 13
1.5. Электронные спектры поглощения порфиринов 15
1.6. Порфирины как сенсибилизаторы в фотодинамической терапии 17
1.7. Взаимодействие порфиринов с ДНК 23
1.8. Поли-М-виниламиды и их свойства в водных растворах 27
1.9. Магнитные жидкости - синтез, свойства и области применения 31
Глава 2. Объекты и методы исследования 35
2.1. Объекты исследования 35
2.2. Методы исследования 35
2.2.1. Спектры поглощения и спектрофотометрическое титрование ... 35
2.2.2. Капиллярная и низкоградиентная вискозиметрия 39
2.2.3. Малоугловое рассеяние нейтронов 43
2.2.3.1. Метод малоуглового рассеяния нейтронов и его применение к исследованию крупномасштабных неоднородностей 43
2.2.3.2. Когерентное и некогерентное рассеяние нейтронов на ядрах. 47
2.2.3.3. Метод дейтериевого контрастирования и исследование строения макромолекул 49
2.2.3.4. Методы структурной интерпретации данных малоуглового рассеяния 53
2.2.3.5. Анализ с помощью корреляционных функций в прямом пространстве 56
2.2.3.6. Использованные приборы 56
2.2.4. Динамическое рассеяние света 58
Глава 3. Исследование взаимодействия сульфированных порфиринов и дифталоцианинов металлов с поли-М-винипирролидоном и ДНК 61
3.1. Комплексы сульфированного тетрафенилпорфина с поли-N- винилпирролидоном 62
3.1.1. Определение связывания TPPS с ПВП методом спектрофотометрического титрования 63
3.1.2. Капиллярная вискозиметрия растворов комплексов TPPS с ПВП 67
3.1.3. Исследование строения комплексов TPPS с ПВП методом малоуглового рассеяния нейтронов 68
3.1.4. Динамическое рассеяние света на растворах комплексов TPPS с ПВП 85
3.1.5. Анализ результатов 86
3.2. Исследование взаимодействия сульфированных дифталоцианинов лютеция и скандия с ДНК 88
3.2.1. Спектрофотометрическое титрование L11PC2S4 и SCPC2S4 растворами ДНК 89
3.2.2. Исследование комплексов L11PC2S4 и SCPC2S4 с ДНК методом низкоградиентной вискозиметрии 91
3.2.3. Малоугловое рассеяние нейтронов на растворах комплексов flHKcScPc2S4 94
3.2.4. Динамическое рассеяние света на растворах комплексов ДНК с ScPc2S4 99
3.2.5. Анализ результатов, выводы 100
Глава 4. Синтез, структура и свойства магнитных наноразмерных комплексов фотодитазина. 106
4.1. Синтез и стабилизация магнитных жидкостей 108
4.2. Нейтронные исследования образцов 111
4.3. Доклинические испытания препаратов на культурах опухолевых клеток и на мышах 131
4.4. Обобщение результатов, выводы 141
Приложение. Расчет состава оболочки магнитных частиц с плюроником и фотодитазином 143
Заключение 150
Список литературы
- Металлопроизводные фталоцианина
- Спектры поглощения и спектрофотометрическое титрование
- Исследование строения комплексов TPPS с ПВП методом малоуглового рассеяния нейтронов
- Доклинические испытания препаратов на культурах опухолевых клеток и на мышах
Введение к работе
Порфирины и их аналоги — макрогетероциклические соединения, содержащие в своей основе цикл порфина, состоящий из четырех колец пиррола. Природные порфирины являются широко распространенными веществами и выполняют важнейшие биологические функции. Они входят в состав гемоглобина, миоглобина, ферментов каталазы, пероксидазы и многочисленной группы цитохромов. В форме железосодержащих комплексов гемопротеиды участвуют в транспорте кислорода, обеспечивая процесс дыхания. Фотосинтез и родственные ему процессы выполняются хлорофиллами и бактериохлорофиллами, содержащими магний.
Большое разнообразие свойств порфиринов и их распространенность обуславливают их применение в промышленности красящих пигментов, полупроводников и катализаторов, а также широкое использование в научных исследованиях физико-химического и биологического характера.
Фундаментальный и прикладной интерес к природным порфиринам и их синтетическим аналогам связан с широкими возможностями синтеза молекулярных структур, обладающих выраженными фотолюминесцентными свойствами, а также высокой устойчивостью к температурным и химическим воздействиям. Благодаря наличию я-электронного сопряжения по макрокольцу и особенностям электронных спектров поглощения (ЭСП) порфирины служат основой для получения множества перспективных материалов (пигменты, полупроводники, сенсоры, катализаторы), функциональные свойства которых базируются на чрезвычайно высокой чувствительности ЭСП порфиринов к молекулярному окружению вблизи центра и периферии молекулы. Наблюдаемые изменения ЭСП порфиринов позволяют детектировать процессы кислотной ионизации, протонирования, комплексообразования и молекулярной агрегации с участием молекул порфиринов.
Важной областью применения порфиринов и их аналогов является медицина. Интенсивно развиваются исследования порфиринов в качестве сенсибилизаторов для фотодинамической терапии (ФДТ) онкологических заболеваний, основанной на способности порфиринов к накоплению преимущественно в опухолевых клетках и к фотолюминесценции с генерацией цитотоксичного синглетного кислорода. Поглощая свет, сенсибилизатор переходит из основного в возбужденное состояние. Возбуждение передается на содержащийся в тканях организма кислород, который переходит в синглетную форму и разрушает главным образом опухолевые клетки, поскольку сенсибилизаторы обладают сродством и накапливаются преимущественно в опухолевых клетках.
Наиболее эффективным сенсибилизатором, разработанным и применяющимся в России, является фотодитазин (производное хлорина), однако, он не всегда накапливается в опухолевых клетках с достаточным контрастом по отношению к нормальным. Важной и актуальной задачей является повышение контраста накопления сенсибилизатора, например, в комплексе с внешне управляемым магнитным носителем. Известны антивирусные свойства некоторых порфиринов. Так, сульфированные тетрафенилпорфины, помимо фотодинамической активности, проявляют активность против вируса иммунодефицита. Сульфированные дифталоцианины редкоземельных элементов (впервые синтезированные П.Н. Москалевым и сотр. в ЛИЯФ АН СССР в 1960-х годах [1, 2]) и некоторых других металлов обладают антивирусной активностью против вируса гриппа, саркомы Рауса [3]. Наибольшим индексом антивирусной защиты в ряду сульфированных дифталоцианинов металлов обладают соединения лютеция и скандия.
Терапевтический эффект порфиринов напрямую связан со структурной организацией и взаимодействием порфиринов с молекулами и органеллами в живых клетках и организмах. Актуальной задачей является изучение механизмов взаимодействия порфиринов и их аналогов с различными биомолекулами (ДНК, белки, ферменты) и другими биосовместимыми полимерами в связи с необходимостью разработки новых эффективных антивирусных и терапевтических препаратов.
Цель работы заключалась в изучении механизмов взаимодействия порфиринов и их аналогов с биосовместимыми полимерами (поли-М-винилпирролидон и ДНК) и магнитными частицами для создания перспективных антивирусных и противоопухолевых препаратов, исследовании структуры комплексов порфирин-полимер и магнитных носителей с фотодитазином для магнитоуправляемого транспорта препарата к опухолевым клеткам, а также оценке эффективности магнитоуправляемого противоопухолевого препарата в доклинических испытаниях на животных.
Задачи исследования:
1. Исследование межмолекулярных взаимодействий и образования комплексов в водных растворах при взаимодействии сульфированного тетрафенилпорфина и поли-К-винилпирролидона, определение характера конформационных изменений полимера при комплексообразовании, анализ молекулярной структуры комплексов и количественных характеристик связывания в зависимости от температуры и соотношения концентраций компонентов.
2. Изучение механизмов образования комплексов сульфированных дифталоцианинов лютеция и скандия с макромолекулами ДНК, исследование структуры комплексов и их гидродинамических свойств в водно-солевых растворах.
3. Разработка стабильного наноразмерного магнитоуправляемого носителя для фотодитазина на основе частиц магнитной жидкости для повышения эффективности препарата для фотодинамической терапии. Определение и сравнительный анализ структуры магнитных наносистем с фотодитазином и тройных комплексов с биосовместимым полимером (плюроником), стимулирующим активность фотодитазина в модельных системах.
4. Проверка эффективности разработанных магнитных комплексов с фотодитазином и плюроником в ходе биомедицинских тестов на животных.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Сульфированный тетрафенилпорфин образует комплексы с макромолекулами поли-N-винилпирролидона по данным спектрофотометрического титрования, рассеяния нейтронов, вискозиметрии и динамического рассеяния света. Связывание носит кооперативный характер и приводит к нарушению электронейтральности цепей полимера при низких ионных силах внешнего электролита.
2. Отрицательно заряженные сульфированные дифталоцианины лютеция и скандия образуют комплексы с ДНК в водно-солевых растворах, приводя к компактизации молекулы ДНК, что подтверждено данными рассеяния нейтронов, вискозиметрии, спектрофотометрического титрования.
3. Установленные по данным рассеяния нейтронов структура и характер корреляций между частицами в магнитных жидкостях регулируются способами стабилизации феррочастиц. В феррожидкостях, стабилизированных лимонной кислотой, частицы ассоциируют в цепные структуры по мере повышения концентрации синтезированной магнитной жидкости.
4. Введение макромолекул плюроника, играющего роль полимерного поверхностно-активного вещества, в феррожидкость блокирует образование цепных структур, вызывая формирование глобулярных кластеров из феррочастиц в оболочках плюроника. 5. Фотодитазин в составе синтезированных магнитных комплексов с плюроником не только сохраняет свои функциональные свойства, но и приобретает повышенную эффективность как магнитоуправляемый сенсибилизатор для фотодинамической терапии.
Научная новизна работы:
1. Установлено образование комплексов сульфированного тетрафенилпорфина с поли-N-винилпирролидоном в водных растворах, определена молекулярная структура, гидродинамические и спектральные характеристики комплексов.
2. Установлено образование комплексов отрицательно заряженных сульфированных дифталоцианинов с ДНК в водно-солевых растворах, определены структурные и гидродинамические свойства комплексов.
3. Разработаны стабильные магнитоуправляемые комплексы на основе наночастиц магнетита, связанных с молекулами сенсибилизатора фотодитазина. Достигнута биосовместимость комплексов при сохранении функциональных свойств сенсибилизатора, в том числе, с использованием плюроников, связывающих фотодитазин и повышающих его эффективность.
4. Показано торможение роста опухоли в ходе доклинических испытаний на мышах при применении магнитоуправляемого комплекса с фотодитазином и направленной доставке препарата с помощью внешнего магнитного поля. Использование плюроника в составе комплексов увеличивает терапевтическое воздействие на опухоль.
Практическая значимость работы. Синтезированные и исследованные в работе комплексы порфиринов и их аналогов с поли-Ы-винилпирролидоном и ДНК перспективны для создания новых эффективных антивирусных препаратов. Полученные магнитоуправляемые комплексы с фотодитазином представляют практический интерес в качестве эффективных сенсибилизаторов для фотодинамической терапии.
Металлопроизводные фталоцианина
Фталоцианин является синтетическим аналогом порфиринов. Во фталоцианине четыре молекулы изоиндола (производные пиррола) соединены в макроцикл с помощью четырех атомов азота (рис. 1.6). Фталоцианин может образовывать комплексные соединения - металлофталоцианины, реагируя с солями металлов. Впервые фталоцианины легких металлов были синтезированы в Англии в 1930-е годы. Они оказались очень прочными радиационно и термически устойчивыми соединениями [7-10]. Линстедом были впервые получены дифталоцианины олова [8] - соединения сэндвичевого типа, в которых ион металла-комплексообразователя расположен между двумя молекулами фталоцианинов.
В конце 1950-х годов в нашей стране началась работа по синтезу и исследованию фталоцианинов тяжелых металлов. Фталоцианины ряда металлов (Со, Ni, Си и др.) оказались комплексами с высочайшей устойчивостью, в растворах концентрированной H2SO4 они не изменяются месяцами и даже годами, тогда как почти все комплексы других лигандов в этих условиях мгновенно диссоциируют на ион металла и протонированный лиганд.
Фталоцианин и все его комплексы нерастворимы в воде и органических растворителях, чрезвычайно устойчивы к щелочам, кислотам и свету, обладают окрасками спектральной чистоты, являются отличными пигментами для полиграфической промышленности, могут использоваться в качестве фото- и хемосенсоров, полупроводников, жидких кристаллов и носителей информации [5,11].
В 1960-х гг. П.Н. Москалев с соавторами проводили исследования фталоцианинов редкоземельных элементов (РЗЭ). Им впервые удалось синтезировать дифталоцианины РЗЭ [1, 2]. Оказалось, что дифталоцианины являются самыми прочными из известных комплексных соединений РЗЭ. Они также не разрушаются в концентрированной H2SO4, выдерживают нагревание до 600С. Дифталоцианины РЗЭ обладают рядом интересных свойств. Под действием электрических сигналов малой мощности они обратимо меняют окраску на синюю, зеленую, красную, фиолетовую (в зависимости от напряжения и полярности электрического сигнала), реагируют на наличие в воздухе паров вредных веществ - аммиака, оксидов азота, ацетона, бензина и др., откликаются на механические воздействия (меняют спектр и электрическое сопротивление).
Дифталоцианины РЗЭ могут быть получены в двух формах — монопротонной МРсгН, в которой трехзарядный катион М замещает три протона NH-связей, в то время как четвертый остается незамещенным, и окисленной радикальной МРсг , в которой удален один гс-электрон и отсутствует атом Н [12—14].
Синтез фталоцианинов РЗЭ приводит к смеси комплексных соединений сэндвичевого типа МРсгН, биядерного МгРсз и ХМРс (рис. 3) с различным содержанием отдельных комплексов в зависимости от природы металла и условий синтеза [12].
Понятие «растворимый в воде порфирин» подразумевает, по крайней мере, некоторую растворимость в воде при рН от 0 до 14. Растворимость зависит от природы порфирина и достигается, в основном, наличием гидрофильных периферийных заместителей. Многие водорастворимые порфирины образуют в растворе димеры или надмолекулярные агрегаты, а также молекулярные комплексы с заряженными или незаряженными органическими молекулами [24].
Возможно применение многих водорастворимых порфиринов в медицине. Так, гематопорфирин, сульфированные тетрафенилпорфины, фталоцианины, хлорины и др. способны накапливаться преимущественно в опухолях по сравнению со здоровыми клетками. Порфирины, способные генерировать синглетный кислород, используются в фотодинамической терапии (ФДТ). Порфирины, содержащие бор, могут использоваться в борнейтронзахватной терапии опухолей [25]. Наименее токсичны природные порфирины, типа Со(Ш) и Pd(II) гемато- и протопорфирина DC. Синтетические отрицательно заряженные металлопроизводные ТМРуР[Х], ТАРР, TPPS, а также сульфированные фталоцианины являются более токсичными [25, 26].
Еще одно клиническое применение тетрапиррольных соединений, локализующихся в опухоли, связано с ранней диагностикой опухоли с помощью инфракрасного излучения (infrared imaging), основанной на флуоресценции порфириновых хромофоров [27]. Однако этот метод ограничен тремя факторами: селективностью накопления в опухоли по отношению к здоровой ткани, фототоксичностью и квантовым выходом флуоресценции [28].
Порфирины и металлопорфирины могут существовать в водных или неводных растворах как мономеры, димеры или более ассоциированные системы. Системы, у которых оптическая плотность линейно зависит от концентрации (по закону Бугера-Ламберта) рассматриваются как мономеры. Ассоциирование молекул происходит при высоких концентрациях порфирина и зависит от рН и ионной силы среды [24].
Порфирины могут образовывать супрамолекулярные агрегаты. Так, сульфированные тетрафенилпорфины H4(TPPS) " и Н ТРРБз) в кислых растворах имеют полосу Соре в спектре поглощения около 433 нм, однако при больших концентрациях часто появляется новый узкий пик при 489 нм. Этот пик соответствует так называемым J-агрегатам, соединенным подобно ленте за счет электростатических взаимодействий, где центральные протоны . одного двухосновного порфирина взаимодействуют с сульфогруппами других молекул [28, 29]. Такие агрегаты могут состоять из десятков и сотен тысяч молекул. В растворах H TPPS)2" при больших концентрациях (больше 10"4 М) появляется новый пик на 422 нм, который является следствием образования крупных //-агрегатов, построенных «лицом к лицу» за счет ассоциации J-форм [24, 30].
Электронные спектры поглощения (ЭСП) и испускания порфиринов обладают уникальными особенностями, обусловленными я-электронным сопряжением по всему 16-членному макрокольцу, плоской конфигурацией макрокольца и возможностью замещения атомов водорода. Введение атома металла изменяет свойства всех групп молекулы порфирина, что отражается на ЭСП молекул. Замещение метановых мостиков на азамостики, т.е. образование фталоцианина, приводит к совершенно иным электронным спектрам [4], увеличению ароматичности (7і-сопряжения в макрокольце), а также к увеличению прочности металлокомплексов. Из ароматичности порфиринов следует наличие вакантной я-орбитали с низкой энергией, а значит, их способность одинаково легко отдавать и присоединять электрон (полупроводниковые свойства) и расположение полос я-я -переходов в видимой области.
Электронные спектры поглощения порфиринов характеризуются сложностью, изменчивостью положения и интенсивности полос в зависимости от строения порфирина, высокой интенсивностью полосы Соре (около 400 нм), малой чувствительностью полос к природе инертных растворителей и очень высокой чувствительностью к протонирующим и комплексообразующим агентам, а также к очень сильным основаниям [5].
Спектры поглощения и спектрофотометрическое титрование
При прохождении света через среду его интенсивность /о уменьшается с ростом толщины слоя L по экспоненциальному закону вследствие рассеяния и поглощения: / = hekL, где к— коэффициент ослабления данного вещества.
Для растворов поглощающего вещества в непоглощающем растворителе этот закон можно переписать в виде / = IQWZCL (закон Бугера-Ламберта-Беера), где С — молярная концентрация вещества, а є — молярный коэффициент экстинкции, зависящий от индивидуальных поглощательных свойств вещества. Для количественной характеристики поглощающих свойств вещества вводят оптическую плотность D = \g(Jo/I). Тогда получаем є = DICL [87].
Согласно современным представлениям, каждое вещество имеет набор энергетических уровней, соответствующих определенным электронным состояниям молекул вещества. Испускание или поглощение электромагнитных волн происходит при переходе молекул вещества с одного уровня на другой. Частота v испускаемого или поглощаемого света связана с разностью энергий состояний: АЕ = hv. Набор испускаемых или поглощаемых частот называется спектром испускания (поглощения) и определяется природой вещества и его состоянием, т.е. зависит и от внешних условий. Каждому переходу между уровнями соответствует своя частота, то есть, полоса в спектре поглощения. Спектры обычно характеризуют длиной волны в
Максимуме ПОГЛОЩеНИЯ Хтах И МОЛЯРНЫМ Коэффициентом ЭКСТИНКЦИИ Б При Хщах.
Спектры поглощения используются для [87]: - определения концентрации веществ (в тех случаях, когда оптическая плотность пропорциональна концентрации); - изучения влияния условий среды и различных добавок на макромолекулы; - определения степени нативности ДНК (по гиперхромному эффекту -увеличению поглощения в полосе 260 нм при денатурации); - определения параметров связывания при образовании комплексов.
В рамках этого метода проводится спектрофотометрическое титрование растворов лигандов (в нашем случае — порфиринов или их аналогов) растворами полимера [87]. Суть метода заключается в следующем. Готовят серию растворов полимер-лиганд с различными концентрациями полимера и постоянной концентрацией лиганда. Снимают спектры поглощения этих растворов. Спектры обрабатывают по Скэтчарду [87, 122, 123] - для каждого раствора по величинам оптической плотности на выбранных длинах волн определяют концентрации свободного и связанного с полимером лиганда (исходят из того, что предельные спектры соответствуют случаю полностью связанного лиганда). Длины волн для обработки выбирают такие, при которых наблюдается наибольшая разность оптических плотностей для крайних спектров из серии растворов. По результатам обработки строят изотермы Скэтчарда — зависимости ГІССВОБ ОТ Г, где ССВОБ — вычисленная по спектрам концентрация свободного лиганда в растворе, а г = СсвязІСпотт (отношение молярных концентраций связанного с полимером лиганда и самого полимера в растворе или число молей лиганда, связанных с одним молем макромолекул). Для простейшего случая (идентичные независимые типы связывания) изотерма Скэтчарда имеет вид прямой (рис. 10а). Прямая отсекает на оси абсцисс отрезок, равный п (количеству мест связывания), а на оси ординат — отрезок пКсв, где Ксв — константа связывания.
Нелинейность графика Скэтчарда может означать, что полимерная молекула может иметь центры связывания нескольких типов, каждый из которых характеризуется своей константой связывания (рис. 106), либо наличие взаимодействий между центрами связывания (рис. 10в), когда связывание одной молекулы лиганда изменяет сродство макромолекулы к следующей молекуле лиганда, что приводит к кооперативности или антикооперативности связывания. В последнем случае можно использовать подход Хилла, основанный на предположении, что связывание в пределах части области насыщения описывается уравнениями, похожими на уравнения для систем с высокой степенью кооперативности. В действительности систем с бесконечно большой степенью кооперативности не обнаружено.
Исследование строения комплексов TPPS с ПВП методом малоуглового рассеяния нейтронов
ПВП с молекулярной массой М= 360x10 Да при массе мономера т = 111 имеет число мономеров в цепи, равное к - М/т = 3240, с общей контурной длиной L = 973 нм. Из величины к и известного значения длины сегмента Куна А = 2.2 нм [174] (количество сегментов Куна на молекулу N = к/А = 442) следует невозмущенный диаметр цепи ПВП (h2)1 2 = ыАЬ = 46.3 нм и радиус инерции клубка Rs = (NA2 /6)-18.9 нм. Для цепей данного размера оценена критическая концентрация полимера, выше которой наступает перекрывание клубков, С = Мl(NA(h2)V2) = 0.60 г/дл. В экспериментах использована концентрация С = 0.49 г/дл С ниже критической величины, т.е. системы находились близко к порогу перекрывания - в условиях, когда из-за тепловых флуктуации размеров клубков и их диффузии вероятны явления их ассоциации цепей ПВП.
В растворе молекула сульфированного порфирина может образовать водородные связи через четыре группы SO3H с молекулами воды из гидратной оболочки полимера или непосредственно с атомами кислорода карбонильных групп ПВП. Молекула порфирина способна связать 2-4 цепи (или фрагмента одной и той же цепи), играя роль физической сшивки размером 2 нм на уровне длины сегмента Куна. В этих условиях стерические ограничения при формировании комплекса с участием 2-4 цепей не должны быть особенно существенными. По этим причинам в системах ПВП + порфирин + D2O вероятна межцепная и внутрицепная ассоциация, когда молекулы порфирина являются центрами ветвления в образовавшихся структурах, в которых наблюдаются не отдельные цепи, а фрагменты цепей между сшивками.
Рис. 20 иллюстрирует изменение поведения дифференциального сечения рассеяния da/сЮ = a(q) при 20С в зависимости от импульса q для раствора ПВП и систем с ПВП и TPPS. В качественном отношении данные для сечений растворов при температурах Т = 40, 60, 70, 80 и 90С (рис. 21—25) не отличаются радикальным образом от данных при 20С.
Экспериментальные кривые для сечений имеют две характерные области изменения. При импульсах 0.1 q 1 нм" данные относятся к полимерным структурам пространственного масштаба R ті/q, превышающего размер сегмента и достигающего диаметра цепи. Напротив, в области высоких значений импульсов q 1 нм"1 рассеяние определяется локальным строением макромолекул на масштабах, сравнимых с длиной мономерного звена. По этим причинам данные при всех температурных и концентрационных условиях описываются законом рассеяния, включающим вклады, связанные с этими структурными уровнями (первое и второе слагаемые) o-i(O) , т2(0) (1) )= \ + (Rcqf (l + (rcq)2f где о"і(0), о"г(0) - сечения рассеяния в пределе малых импульсов (q — 0), a Re и гс — радиусы корреляции для указанных структурных элементов масштаба цепи и звена, соответственно. В некоторых случаях размеры наблюдаемых образований вырастают до порядка 100 нм и выше, вызванные флуктуациями из-за использованной концентрации полимера вблизи порога перекрывания клубков, что не позволяет точно определить размеры (Re) в исследованном диапазоне импульсов. Такая картина наблюдалась в образцах 4 и 5 (с наибольшим содержанием порфирина) при 40, 80 и 90С, и кривые рассеяния в этих случаях аппроксимировали моделью , ч А г2(0) (2) j(q) = — + /л av , t (l + (rcqY) где A — параметр, характеризующий рассеяние на образованиях больших размеров.
При 90С в образце 4 также наблюдались флуктуации на масштабах размера звена (гс), не позволяющие достоверно определить эти размеры. Значения параметров рассеяния приведены в табл. 3-8.
При низком содержании TPPS в растворе, го = 1/6061 и 1/1887, когда 1 молекула TPPS приходится на 2 цепи ПВП и 2 молекулы TPPS на каждую цепь ПВП, создаются центры ассоциации цепей, о чем свидетельствует резкое увеличение сечения (массы) и радиуса корреляции рассеивающих объектов. При 20С с ростом содержания порфирина (го 1/500) и образованием множества комплексов в цепях более вероятной становится внутрицепная ассоциация, при которой наблюдаемый масштаб корреляций характеризует размеры фрагментов цепей между физическими сшивками, являющимися молекулами порфирина в составе комплексов. О явлениях внутрицепной ассоциации свидетельствует уменьшение размера и сечений рассеивающих объектов при 20С (рис. 26). При более высоких температурах наблюдается рост характерных размеров рассеивающих объектов при увеличении содержания порфирина из-за взаимного отталкивания цепей полимера со связанными на них отрицательно заряженными молекулами TPPS (рис. 27).
Доклинические испытания препаратов на культурах опухолевых клеток и на мышах
Динамика средних размеров опухоли на левой лапке показана на рис. 69. Несмотря на отсутствие облучения этой лапки, отмечено воздействие препарата (системный эффект на организм), которое наиболее эффективно проявляется в группе Ф (чистый фотодитазин, без магнетита). Препараты с магнетитом не сильно влияют на отличия размеров опухолей от таковых в контрольной группе. Воздействие плюроника значительно ниже, чем на правую лапку, не отмечено ни одного случая некротической ампутации левой лапки.
Синтезированы магнитные жидкости двух типов на основе магнетита — ионная магнитная жидкость, стабилизированная ионами хлора (ФМЖ-1) и стабилизированная лимонной кислотой (ФМЖ-2). Показано преимущество использования ФМЖ-2 для в качестве магнитного носителя для фотодитазина перед ФМЖ-1.
Выявлены структурные отличия магнитных жидкостей на лимонной кислоте, приготовленных с разными исходными концентрациями. В жидкости с низкой исходной концентрацией (ФМЖ-2.1) магнетит содержится в виде отдельных частиц, кластеры магнетита отсутствуют и не образуются при повышении концентрации этой жидкости при частичном испарении растворителя, а в жидкости с высокой исходной концентрацией (ФМЖ-2.2) присутствуют кластеры магнетита, которые частично разрушаются при выпаривании жидкости досуха.
Установлено образование комплексов порфиринов с частицами магнетита. В случае фотодитазина показано сохранение его фотокаталитических свойств в комплексе с ФМЖ-2.2 и усиление их под действием плюроника.
Методом малоуглового рассеяния нейтронов показано, что образование комплексов фотодитазина и плюроника с частицами магнетита приводит к структурированию феррожидкости с образованием компактных глобулярных кластеров в отличие от явлений ассоциации феррожидкостей классического типа, частицы которых склонны формировать протяженные цепные структуры. Полученные комплексы с фотодитазином и плюроником остаются стабильными длительное время при 2О-40С, что важно для применения в медицине. Проведены испытания препаратов на мышах с перевитой опухолью на лапках, которые показали увеличение эффективности применения фотодитазина в комплексе с магнитными частицами при направленной локализации препарата внешним магнитным полем. Отмечена высокая эффективность комплексов, содержащих плюроник, которая проявлялась в значительной доле случаев полного исчезновения опухоли в течение нескольких суток. Использование магнетита в составе препарата для ФДТ дает возможность применения в лечении совместно с ФДТ метода гипертермии, когда происходит термическое разрушение клеток за счет нагрева магнетита при внешнем воздействии на него (например, инфракрасным излучением или магнитным полем). Комплексное применение методов ФДТ и гипертермии способно еще больше повысить эффективность препарата.
Приложение. Расчет состава оболочки магнитных частиц с плюроником и фотодитазином Параметры рассеяния нейтронов на образцах 2 и 3 (с плюроником) приведены в табл. 20. Комплексы содержат: растворитель (90% D2O и 10 %НгО), магнетит (Рез04), плюроник F-\21 (С580Н1162О261), фотодитазин (C48H7oN60i6). Использованы известные значения длин когерентного рассеяния на ядрах [147]: Ьн --3.7390ХІ0"13 см, bD = +6.67ІХІ0-13 см, b0 = +5.803х10"13 см, bFe = +9.45ХІ0-13 см, Ьс = +6.6460x10" см, Ьк = +9.36х10"13 см. Суммы длин когерентного рассеяния на молекулах образцов: Y,b(H20) = (-3.7390 2 + 5.803) 10""см = -1.675 10""см, 2 (А ?) = (6-671 2 + 5.803) 10"" см = 19.145 10"" см, YuhM = Ь(Ге304) = (9.45 3+ 5.803 4) Ю 13 см = 51.562 10 и см, ІХ-ш = 2 580 162 26,) = (6.646 580 - 3.739 1162 + 5.803 261) 1(Г13сж = +1.0245 10"10сл , Yub4 om = 5] (С«ята віб) = (6-646 48- 3-739 70 + 9-36 6 + 5-803 16) Ю-"см = 206.286 \0 псм. Плотности веществ при 20С: р(Н20) = 0.99823г/сд 3, p(D20) = 1.10539г/см3, p(FepA) = 5.24г/см3, p(F -127) 1г/см3, р(фот) » 1г /см3. Растворитель содержит 90% D20 и 10% НгО по объему (VD = 0.9VSOLV,VH = O.WSOLV). VSOLVPSOLV = SOLV = D + % = VDpD + VHPH = -9VSOLVPD + 0-WSOLVpH Следовательно: PSOLV = 0.9 p{ D20) + 0. lp(H20) = (0.9 1.10539 + 0.1 0.99823)г I см3 = 1.0947г /см3.
Молярные массы: М{НгО) = 18г / моль, M(D20) = 20г /моль, Ми = M(FejOA) = (56 3 +16 4)г / моль = 232г /моль, МF_l27 = (580 12 + П62 + 261 16)г/моль = 12298г/моль, Мфот = (48 12 + 70 + 14 6 + 16 16)2/моль = 986г/моль. Эффективная молярная масса растворителя:
