Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
I. ЛИПАЗА: СТРОЕНИЕ И ОСОБЕННОСТИ КАТАЛИЗА 9
1.1. Общая характеристика липаз из разных источников 9
1.2. Аминокислотный и углеводный состав И
1.3. Структура активного центра и поверхностная активация липазы 13
1.4. Механизм катализа и кинетические модели действия липаз 18
1.5. Факторы, влияющие на липолиз 21
1.6. Субстратная специфичность липаз 31
1.7. Методы определения активности липаз 34
1.8. Применение липаз 40
II СИСТЕМЫ ОБРАЩЕННЫХ МИЦЕЛЛ, ИХ ДОСТОИНСТВА 47
2.1 Системы обращенных мицелл, общие характеристики 47
2.2. Ферменты в системах обращенных мицелл: регуляция их активности и
олигомерного состава 49
2.3. Катализ липазой в системах обращенных мицелл 56
III. ЛИПОКСИГЕНАЗА: СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА 61
3.1. Нахождение в природе, катализируемые реакции и биолопіческая важность
липоксигеназ 61
3.2. Структура активного центра и механизм катализа липоксигеназ 65
IV. КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПОЛИФЕРМЕНТНЫХ РЕАКЦИЙ 69
ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ 73
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 74
I. МАТЕРИАЛЫ 74
II. МЕТОДЫ 76
2.1. Характеристика препаратов ферментов 76
2.2. Определение каталитической активности ферментов 77
2.3. Химическая модификация ферментов 79
2.4. Седиментационный анализ 80
2.5. Изучение собственной флуоресценции липаз 81
2.6. Изучение стабильности липаз 81
2.7. Синтез ацилированного ацикловира, катализируемый липазой в системе обращенных мицелл 82
2.8. Изучение биферментной системы «липаза / липоксигеназа» 84
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 87
I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕПАРАТОВ ЛИПАЗ 87
1.1. Панкреатическая липаза свиньи 87
1.2. Липаза из Mucor miehei. 87
1.3. Липаза из Chromobacterium viscosum 87
II. РЕГУЛЯЦИЯ ЛИПОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ 89
2.1. Оптимизация условий катализа 89
2.1.1. Зависимость каталитической активности липаз от рН среды, температуры реакции и концентрации фермента 89
2.1.2. Кинетические характеристики реакций, катализируемых липазами в водной среде и в системе обращенных мицелл 93
2.1.3. Влияние ионов кальция и желчных солей на липолиз в водном растворе и в системе обращенных мицелл 98
2.2. Регуляция олигомерного состава липаз в системе обращенных
мицелл 105
2.3. Регуляция активности липаз изменением концентрации ПАВ в системе обращенных мицелл 109
2.4. Химическая модификация липазы 116
2.5. Собственная флуоресценция липаз 121
2.6. Предполагаемая локализация липаз в системе обращенных мицелл 125
III. СТАБИЛЬНОСТЬ ЛИПАЗ 128
IV. РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЛИПАЗ 135
V. БИФЕРМЕНТНАЯ СИСТЕМА «ЛИПАЗА /ЛИПОКСИГЕНАЗА» 137
5.1. Катализ соевой липоксигеназой-1 в системе обращенных мицелл 138
5.2. Кинетические характеристики биферментной реакции: определение скорость лимитирующей стадии 140
5.3. Зависимости кинетических констант биферментного процесса от степени гидратации и концентрации АОТ в системе обращенных мицелл 142
5.4. Тестирование масел с помощью биферментной системы «липаза/ липоксигеназа» 144
ВЫВОДЫ 148
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 150
БЛАГОДАРНОСТИ 184
Введение к работе
Липазы (гидролазы высших триглицеридов) играют ключевую роль в обмене липидов всех живых организмов, а также участвуют в процессах отложения и утилизации жира, используемого в качестве энергетического резерва клетки. Липазы не только гидролизуют триглицериды в пищеварительном тракте до ди-, моноглицеридов и свободных жирных кислот, но также способны катализировать с высокой стереоспецифичностью ацилирование и деацилирование большого числа субстратов, отличных от глицеридов. Липазы стабильны в водных и органических средах и могут быть получены с хорошим выходом из растений, животных, а также из природных и рекомбинантных микроорганизмов. В настоящее время липазы находят широкое применение во многих областях, включая лечебную и диагностическую медицину, пищевую, косметическую и бумажную промышленности, производство детергентов и органический синтез. В результате, в последнее время особое внимание уделяется оптимизации биокаталитических характеристик этого фермента.
Исключительной особенностью липазы, отличающей ее от других эстераз, является свойство поверхностной активации фермента в присутствии агрегированных молекул субстрата (жировых капель), что обусловлено формированием активной конформации фермента в результате его адсорбции на поверхности липида. В литературе имеются указания на то, что адсорбция липазы на липидном монослое является определяющим фактором катализа липазой, предшествуя образованию фермент-субстратного комплекса. Очевидно, что эффективность взаимодействия липазы с поверхностью липида будет зависеть как от свойств межфазной поверхности (заряда, плотности, поверхностного натяжения и т.д.), так и от свойств самого фермента, в том числе от наличия на его поверхности функциональных групп углеводной и липидной природы. Вопрос о роли взаимодействия липазы с межфазной поверхностью в регуляции активности фермента представляет, с одной стороны, фундаментальный интерес для понимания закономерностей механизма катализа липазами разной природы, а с другой стороны, имеет важное прикладное значение, заключающееся в контролировании ферментативного процесса in vitro и в направленной регуляции катализа липазами при решении различных биотехнологических задач. Для решения данного вопроса представляется весьма удобной система обращенных мицелл, которая, в отличие от липидного монослоя, может быть использована как для моделирования мембранного окружения ферментов, так и для
проведения биокаталитических процессов. В случае системы этого типа эффективность взаимодействия фермента с межфазной поверхностью (слоем ПАВ) может регулироваться как путем изменения параметров системы, а именно, размера и числа мицелл, так и путем химической модификации (дополнительной гидрофилизации и гидрофобизации) поверхности фермента. Таким образом, основной целью работы явилось выявление регуляции липолитической и синтетической активности липаз раной природы в системе обращенных мицелл АОТ в изооктане изменением параметров системы (числа и размера мицелл) и свойств поверхности фермента. В качестве объектов исследования были выбраны широко используемые на практике липазы: панкреатическая липаза свиньи и липазы из Mucor miehei и Chromobacterium viscosum.
На сегодняшний день определение липолитической активности по-прежнему является непростой задачей, а существующие высокочувствительные методы обладают рядом недостатков, включающих: 1) дороговизну оборудования и реагентов; 2) неприменимость во многих природных средах и системах, содержащих амфифильные соединения, связывающие субстраты и продукты липолитических реакций; 3) применение синтетических субстратов, по отношению к которым липазы проявляют низкую активность. В связи с этим, другой важной задачей работы являлась разработка простого непрерывного метода определения активности липазы по отношению к природному субстрату (триглицериду) с помощью бнферментной системы «липаза /липоксигеназа», включающего липолитическое высвобождение полиненасыщенной жирной кислоты из триглицервда и последующее липоксигеназное окисление полиненасыщенной жирной кислоты до ее гидропероксида, регистрируемого спектрофотометрически.
Предлагаемая биферментная система «липаза / липоксигеназа» может быть удобной для изучения позиционной специфичности липаз из разных источников, если использовать в качестве субстрата триглицериды, содержащие полиненасыщенный ацильный фрагмент в строго опреленном 5л-положении триглицервда. Универсальность данной бнферментной системы также заключается в том, что замена липазы на фосфолипазу позволяет расширить круг изучаемых липолитических ферментов и определять их активность по отношению к природным субстратам, содержащим полиненасыщенные жирные кислоты.
В настоящий момент одной из важных практических задач в медицине и пищевой промышленности стоит проблема переработки жиров и получения триглицеридов, содержащих ненасыщенные жирные кислоты. Полиненасыщенные жирные кислоты, содержащие 1,4-цис,цис-пентадиенильный фрагмент и являющиеся субстратами
липоксигеназ, представляют собой предшественники биологически активных соединений (лейкотриенов, простагландинов, тромбоксанов и др.), выполняющих важные регуляторные функции и вовлеченных в иммунную систему организма человека. Известно, что утилизация именно этих жирных кислот снижает риск многих заболеваний, в том числе сердечно-сосудистых заболеваний, рака и воспалительных процессов различной этиологии.
Поэтому предлагаемая нами биферментная система «липаза / липоксигеназа» может оказаться удобной тест-системой и позволит оценивать качество пищевых масел и жиров, заключающееся в содержании в них биологически важных полиненасыщенных жирных кислот.
