Введение к работе
Актуальность проблемы, йлавинмононукяеотид (fun ) и флавин-адениндинуклеотид (fad ) входят в состав флавопротеинов, катализирующих многочисленные окислительно-восстановительные реакции клеток. Они образуются из рибофлавина (витамина &>), биосинтез которого осуществляют микроорганизмы я растения.
Структура рибофлавина (РФ), который представляет собой 7,8-диметил-IO-d'-D -рибмтил)нзоаллоксаэин, установлена более 50-тя лет назад, однако исследование путей его образования в связи со сложностью строения молекулы растянулось на долгие годы и. продолжается до сих пор. К началу настоящей работы (1970 г.) при помощи гуанинзависимых мутантов дрожжей ( Шавловский и соавт., 1969 ) и бактерий ( Bacher0 Maiiander „ 1969 ) было установлено, что РФ образуется из гуанилового соединения. Из культур флавиногекиых микроорганизмов выделен непосредственный предшественник витамина Bg б,7-диметил-8-рибитиллюмазин (ДМРЛМ Мавшіе « 1957; jjaley,plaut, 1959 ) и показано его превращение в РФ под влиянием РФ-синтезы (riaut, 1963). В культуральной жидкости РФ-зависимык мутантов sac-charomycee cerevisiae Бахер И соавт. (oltmanns et al. » 1969; ва-cher.Llngena , 1970, 1971 ) обнаружили пиримидиновые продукты фла-виногенеза, что позволило им создать гипотетическую схему биосинтеза РФ у дрожжей: гуаниловое соединение —*- 2,5,6-триамяно-4-ок-сипиримидин — 2,5-диамино-4-окси-б-рибитияаминопиримидин —*- 2,4-диокси-5-амино-6-рибитиламинопиримидин —=» ДМРЛ —»- РФ.
Оставались невыясненными следующие вопросы: какое гуаниловое соединение (основание, нуклеозид или нуялеотид) используется для флавиногензза; являются ли пиримидины, накапливающиеся в культурах РФ-зависимых мутантов, истинными предшественниками РФ или продуктами их распада; каково происхождение рибитияьной цепи флашнов; как образуется птЪридиновый предшественник'витамина Б>>.
До середины 70-х годов были изучены свойства только одного фермента биосинтеза витамина Bg - РФ-сйнтазы (КЭ 2.5,X.9)(plaut , 1963; Harvey,plaut , 1966 \ Были начаты работы по изучению механизмов регуляции флавиногенеза у бактерий Bacillus aubtilie ( Врес-лер и соавт., 1969 ). Отсутствовали сведения о механизмах регуляции этого процесса у эукариотическия микроорганизмов,,
Цель и задачи исследования. Работа посвящена изучению пути биосинтеза РФ и механизмов регуляции этого процесса у дродаей. Основным объектом исследования служили дрожв» Plchia guilXienscadii АТСС 9058, синтезирующие при росте а желеэодефицитных средах повы-
шенные количества витамина Bg.
В число основных задач работы входило:
- изучение природы продуктов флавиногенеза, накапливающихся в культурах РФ-зависимых мутантов p.guilliermondils
~ исследование химизма биосинтеза РФ у дрожжей в опытах In vitro и свойств ферментов, катализирующих этот процесс yp.guil-liermondii;
- изучение механизмов регуляции активности и образования ферментов биосинтеза витамина &> у ряда видов дрожжей - активных и слабых продуцентов этого витамина.
Научная новизна работы. Впервые систематически исследованы реакции биосинтеза РФ у дрожжей в опытах in vitro. Установлена природа гуанилового предшественника РФ, происхождение рибитильной цепи флавинов, более детально охарактеризованы пириыидиновые интер-медиаты флавиногенеза у дрожжей, установлена роль рибозо-5-фосфата как углеводного предшественника витамина Bg у дрожжей и бактерий. Подученные нами данные позволили существенна дополнить предложенную ранее схему биосинтеза РФ у дрожжей.
Из клеток P.guiXliermondil впервые выделены и охарактеризованы ферменты, участвующие в биосинтезе РФ у дрожжей: gtp -цикло-гидролаза, редуктаза, дезаминаза, синтеза алифатического предшественника РФ (АПР-сннтаза) и ДМРЛ-синтаэа. Идентифицированы структурные гены, кодирующие их синтез.
Изучены механизмы регуляции флавиногенеза у дрожжей как представителей эукариотических микроорганизмов. Обнаружен общий для флазиногеннцх и нефлавиногенных видов механизм ретроингибирования фермента первого этапа GTP-циклогидролазы конечным продуктом флавиногенеза FAD ..Показано, что у ряда видов дрожжей (p.guilliermon-dii, Torulopaia cacdida и некоторых других), осуществляющих сверхсинтез витамина Б^ в условиях дефицита железа, ионы этого металла в качестве корепрессора участвуют в координированной регуляции образования почти всех ферментов биосинтеза РФ. Выяснена основная причина сверхсинтеза витамина Bg у этих организмов.
Практическая ценность работы. Результаты настоящей работы имеет важное значение для разработки рациональных методов селекции дрожжей - продуцентов витамина Bg, его предшественников и производных, (hiii з»е нгили применение для селекции мутантов p.guilliermon-dii о нарушенной регуляцией флавиногенеза, способных синтези-ровачь значительные количества витаихна Bg в среде с высоким содержанием ионов железа (Шавдоввкий и соавт., 1935).
Разработанные нами методы селекции РФ-зависимых мутантов и определения активности ферментов флавиногенеза использовались рядом исследователей ( Шавяовский и соавт., 1978-1980, 1982, 1985, 1988; Сибирный и соавт., 1978; Бандрин и соавт., 1975; васпег et al., 1984-1986). Рй-зависимый мутант, способный расти при низких концентрациях РФ, использовался для исследования закономерностей транспорта PS у этого организма ( Сибирный и соавт., 1977-1979; 1985).
РФ-зависимые мутанты P.guilliermondii могут найти применение для клонирования структурных генов биосинтеза витемина Bg эу-кариотических микроорганизмов.
Апробация работы. Основные положения работы докладывались или были представлены на международных, всесоюзных и республиканских съездах, симпозиумах и конференциях.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 63 работы.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), экспериментальной части (4 главы),, заключения и выводов. Работа изложена на 220 страницах машинописного текста, содержит 73 рисунка, 59 таблиц, 507 литературных источников, в том числе 372 иностранных.
