Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Регуляция важнейших ферментов энергетического обмена нервной ткани 11
1.1. Общая характеристика креатинкиназной реакции 11
1.1.1. Митохондриальная креатинкиназа 16
1.2. Гексокиназа мозга 23
1.3. Особенности энергетического обмена мозга и состояние мембран при повышении устойчивости к кислородному голоданию 29
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 46
ГЛАВА 3. Результаты исследований 60
3.1. Каталитические свойства основных мембраносвязанных ферментов и общая характеристика свободно радикального окисления в головном мозге интактных животных 60
3.2. Каталитические свойства фосфокиназ и состояние свободно радикального окисления в головном мозге животных при острой ишемии 79
3.3. Особенности мембранной регуляции гексокиназы и креатинкиназы и состояние свободно радикального окисления в динамике после острой ишемии мозга 99
3.4. Адаптационная защита мозга от гипоксических воздействий. Каталитическая активность мембраносвязанных ферментов энергетического обмена и роль свободно радикального окисления при повышении устойчивости организма животных к ишемии 126
3.5. Каталитическая активность митохондриальных креатинкиназы и гексокиназы мозга и состояние свободно радикального окисления при проверке устойчивости организма тренированных животных к ишемии 145
3.6. Каталитические свойства мембраносвязанных ферментов и состояние свободнорадикального окисления в ткани мозга в условиях острой ишемии на фоне предварительного введения пептида, индуцирующего дельта-сон 171
ГЛАВА 4. Обсуждение 178
Выводы 196
Приложение 199
Список сокращений 224
Список литературы 225
- Митохондриальная креатинкиназа
- Особенности энергетического обмена мозга и состояние мембран при повышении устойчивости к кислородному голоданию
- Каталитические свойства фосфокиназ и состояние свободно радикального окисления в головном мозге животных при острой ишемии
- Каталитическая активность митохондриальных креатинкиназы и гексокиназы мозга и состояние свободно радикального окисления при проверке устойчивости организма тренированных животных к ишемии
Введение к работе
Актуальность темы:
Проблема адаптации к изменяющимся условиям жизнедеятельности организма относится к фундаментальным проблемам общей биологии и чрезвычайно актуальна для многих разделов клинической и экспериментальной медицины. Гипоксические и ишемические повреждения являются основой или сопутствующим факторами патогенеза многих заболеваний. В отечественной и зарубежной литературе достаточно полно рассмотрены приспособительные реакции дыхательной, сердечно-сосудистой и кроветворной систем организма к условиям кислородной недостаточности. Однако молекулярные механизмы развития острой ишемии во многом остаются малоизученными, хотя именно они дают представление о фундаментальных основах регуляции хода важнейших реакций, позволяющих поддерживать жизнеспособность организма при дефиците кислорода. Изучение механизмов этих повреждений, разработка методов их профилактики и коррекции является важнейшей задачей молекулярной нейробиологии и медицины.
Хорошо известно, что основу всех метаболических процессов составляют
ферменты, являющиеся основными регуляторами обмена веществ (Диксон,
Уэбб, 1982; Hochachka, 1996; Baynes, Dominiczak, 2005). Известно, что
многие ферменты способны образовывать динамические надмолекулярные
комплексы с белками цитоскелета, другими ферментами, мембранами
органелл клетки (Linden et al., 1982; Kellershohn, Ricard, 1994; Lyubarev, 1997;
Beutner et al., 1998; Ovadi, Srere, 2000; Dolder et al., 2001; da-Silva et al., 2004).
Ферменты, адсорбированные мембранами клеточных органелл, имеют иное
микроокружение, чем ферменты в растворенном состоянии, и
характеризуются измененными каталитическими свойствами.
Митохондрии клетки содержат несколько сот различных ферментов и являются примером внутриклеточных структурных образований, у которых
5 обе мембраны могут быть местом адсорбции ферментов из цитозоля или матрикса.
Головной мозг среди других тканей организма отличается высоким уровнем энергетического обмена (Siesjo et al., 1985; Хватова и др., 1987; Schurr, 2002). Интенсивный синтез АТФ обеспечивает энергией специфические функции нервной ткани. Для энергетического метаболизма мозга характерна высокая скорость гликолитического и дыхательного этапов обмена глюкозы, компартментализация метаболических систем и широкие возможности метаболической альтерации. Метаболизм головного мозга целиком зависит от завершенности энергетической реакции в митохондриях и возможности их регуляции в измененных условиях жизнедеятельности.
Ключевые позиции в регуляции баланса внутриклеточной энергии занимают два фермента - креатинкиназа и гексокиназа. Их активность в нервной ткани в сравнении с другими тканями достигает высшего уровня для гексокиназы (Wilson, 1995, 1997) или занимает вторую позицию после скелетной или сердечной мышцы для креатинкиназы (Wyss et al., 1992; Hemmer, Wallimann, 1993; Липская, 2001). Общим для названных ферментов является способность к адсорбции на мембранах митохондрий, особенно в местах контактных сайтов (Kropp and Wilson, 1970; Xie and Wilson, 1988; Stachowiak, et al., 1996; Eder et al, 2000).
Показано, что митохондриальная креатинкиназа совместно с транслоказой адениловых нуклеотидов, порином наружной мембраны митохондрий и мембраносвязанной гексокиназой образуют динамический мультибелковый комплекс (Высоких, 1999; Schlattner et al., 2001; Vyssokikh and Brdiczka, 2003). В литературе практически отсутствуют сведения о роли данных фосфокиназ в функционировании комплекса при измененных физиологических состояниях организма.
Головной мозг характеризуется высокой чувствительностью к недостатку кислорода, которая связана с отсутствием энергоресурсов и аэробным типом обменных процессов. Важнейшим проявлением кислородной
недостаточности является нарушение субстратного обеспечения мозга, снижение уровня макроэргов. Недостаток кислорода вызывает нарушение функционирования гексокиназы и креатинкиназы, что негативно сказывается на энергообеспечении головного мозга.
Одним из ключевых механизмов повреждения клеток при ишемии является чрезмерная активация свободнорадикального окисления (Maulik et al., 1999; Сазонтова и др., 2002; Rauchova et al., 2002; Cherubini et al., 2005). Изменение состояния мембраны может привести к нарушению взаимодействия ферментов со структурными элементами митохондрий. В связи с этим представляет интерес изучение роли мембран в регуляции каталитических свойств фосфокиназ при различных функциональных состояниях организма.
Адаптация к условиям окружающей среды как универсальное общебиологическое явление формируется и проявляется на самых различных уровнях организации живого, в том числе молекулярном.
В последние годы для повышения резистентности организма к гипоксии используют комбинированные методы тренировочного режима: гипоксически-гиперкапническое прекондиционирование (Куликов, 2005), комбинация периодов гипоксии и умеренной гипероксии (Жукова, 2005), интервальные нормобарические гипоксические тренировки (Маев с соав., 2004). Известно, что формирование устойчивой адаптационной защиты требует длительного времени (3-5 недель). В связи с этим актуальной задачей является изучение молекулярных механизмов формирования защитных эффектов краткосрочных режимов тренировок, повышающих интенсивность адаптационного сигнала без углубления гипоксической компоненты.
Для предупреждения метаболических нарушений при гипоксии и ишемии широко применяют нейропептиды или лекарственные препараты на основе эндогенных биологически активных соединений. Среди них пептид, индуцирующий дельта-сон (ДСИП), или «дельтаран», синтетический аналог
7 пептида, обладающий адаптогенным действием. Однако влияние нейропептида на обменные процессы в мозге изучено слабо.
Таким образом, в литературе имеются отдельные сведения об изменении каталитических свойств гексокиназы и креатинкиназы при кислородном голодании и практически отсутствуют данные по мембранной регуляции этих ферментов в динамике нарушения мозгового кровообращения и в условиях повышения устойчивости организма к недостатку кислорода. Роль данных ферментов в развитии метаболической адаптации к различным факторам среды остается еще далеко не раскрытой. Важно отметить, что исследование механизмов метаболических процессов индивидуальной устойчивости организма к экстремальным воздействиям и определение критериев режима тренировки следует рассматривать как важный и необходимый этап для использования в практической медицине. Данный вопрос требует всестороннего изучения механизма контроля метаболизма клетки на уровне функционирования отдельных ферментов, связанных с клеточными мембранами, и исследование функционального взаимодействия этих ферментов в условиях ишемии мозга и повышении устойчивости организма к кислородной недостаточности.
Цель исследования: изучение зависимости свойств основных фосфокиназ энергетического обмена мозга от взаимодействия с митохондриальными мембранами при нарушении мозгового кровообращения и адаптивной перестройке метаболизма в разных условиях повышения устойчивости организма к кислородному голоданию.
С этой целью в работе были поставлены следующие задачи: 1. изучить распределение активности креатинкиназы, ее кинетические свойства в митохондриях и субмитохондриальных фракциях мозга и дать характеристику взаимодействия фермента с внутренней мембраной митохондрий.
исследовать механизмы взаимодействия гексокиназы с наружной мембраной митохондрий и зависимость свойств фермента от связи с мембраной.
провести сравнительный анализ изменений каталитических свойств фосфокиназ в зависимости от характера взаимодействия с митохондриальными мембранами при острой ишемии и в динамике нарушения мозгового кровообращения.
исследовать особенности регуляции каталитических свойств креатинкиназы и гексокиназы в условиях интервального гипобарического прекондиционирования и предварительного введения пептида, индуцирующего дельта-сон.
Научная новизна: Обосновано положение о зависимости
каталитических свойств основных фосфокиназ энергетического обмена мозга от взаимодействия со структурными элементами митохондрий.
Дана количественная характеристика распределения креатинкиназы в митохондриях и субмитохондриальных фракциях, изучены ее кинетические особенности. Выявлено, что тип кинетического поведения зависит от характера связи креатинкиназы с митохондриальной мембраной.
Выявлена роль ассоциативных взаимодействий (предположительно белок-липидных) в модификации каталитических свойств ассоциированной и прочносвязанной форм креатинкиназы. Показано, что прочное взаимодействие креатинкиназы с нативно организованной мембраной ведет к развитию аномального типа кинетики.
Изучена роль белок-белковых взаимодействий гексокиназы с мембраной митохондрий. Установлено, что адсорбционные взаимодействия фермента с мембраной подчиняются гиперболическому закону Михаэлиса-Ментен, что подтверждено сохранением классической кинетики гексокиназы на мембране после воздействия солюбилизирующих агентов.
9 Дана расширенная характеристика изменений каталитических свойств ферментов при острой ишемии мозга. Продемонстрированы различия в реакции мембраносвязанных ферментов мозга на острую ишемию, вызванную двусторонним лигированием общих сонных артерий, которые определяются физиологическим состоянием животных.
Определены особенности регуляции фосфокиназ в динамике нарушения мозгового кровообращения. Установлено, что при длительной ишемии мозга регуляторные сдвиги в кинетических характеристиках ферментов направлены на усиление их взаимодействия с мембраной митохондрий.
Выявлено, что интервальное гипобарическое прекондиционирование стабилизирует мембраны митохондрий, формирует новые свойства ферментов.
Установлено, что предварительное введение пептида, индуцирующего дельта-сон («дельтаран»), предупреждает развитие стресс-индуцированных изменений каталитических свойств ферментов.
На основании полученных результатов исследования и литературных данных сформулирована концепция мембранной регуляции ферментов энергетического обмена мозга при ишемии и повышении устойчивости к кислородному голоданию.
Установлено, что метаболическая адаптация является управляемым процессом. Реализация адаптивного механизма связана с изменением свойств мембран, что приводит к формированию новых адсорбционно-каталитических характеристик фосфокиназ мозга.
Теоретическая и практическая значимость работы:
Полученные данные о существенных изменениях ряда каталитических свойств основных фосфокиназ энергетического обмена мозга расширили современное представление о механизмах регуляции метаболической адаптации при нарушении мозгового кровообращения, способствуя
10 пониманию молекулярных механизмов резистентности организма к экстремальным факторам окружающей среды.
Фундаментальное значение для понимания этого факта имеет выявленная нами зависимость свойств изучаемых ферментов от характера взаимодействия с мембранами митохондрий.
Результаты о влиянии интервального гипобарического прекондиционирования на мембранную регуляцию ферментов энергетического обмена мозга в комплексе с другими исследованиями могут служить для дальнейшего поиска методов и средств эффективной коррекции гипоксических изменений метаболизма мозга. Эти результаты могут быть также использованы для решения прикладных задач по разработке эффективных методов гипокситерапии.
Полученные данные показали результативность «дельтарана» по отношению к реакциям энергетического обмена в мозге и позволили дать характеристику метаболического эффекта лекарственного препарата на основе нейропептида при острой ишемии, что приобретает прямое практическое значение.
11 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Митохондриальная креатинкиназа
В 1964 году Jacobs Н. обнаружил значительную креатинкиназную активность в митохондриях мозга, сердца, мышц крыс и морских свинок. Специфическая электрофоретическая подвижность митохондриальной креатинкиназы по сравнению с другими ее изоформами, а также присутствие креатинкиназы в митохондриях в определенном соотношении с ферментами дыхательной цепи заставили исследователей предположить, что миКК является интегральной частью митохондрий и самостоятельным изоферментом. К настоящему времени митохондриальная КК обнаружена в митохондриях или экстрактах из тканей сердца человека (Kanemitsu et al., 2000), крысы (Eppenberger-Eberhardt et al.,1991;), цыпленка (Kaldis, Wallimann Т., 1995), морской свинки (Buderus et al., 1989), быка (Белоусова, 2004), мозга крысы (Kasparova et al., 1992), цыпленка (Wyss et al, 1990), кролика (Grossman et al., 1990); почек крысы (Walzel et al., 2002); фоторецепторных клеток цыпленка (Wegmann et al., 1991; Hemmer et al., 1993) и т.д.
Сакс В.А. с соавторами (1980) показали, что миКК в сердце соответствует 35% от общей активности гомогената. В скелетной мышце большая часть активности креатинкиназы принадлежит ММ изоферменту, митохондриальная креатинкиназа составляет всего 28%. Заметные количества миКК обнаружены и в митохондриях мозга - до 80%. В парафиновых срезах мозга крысы миКК найдена во всех нейронах Гольджи 1-го типа, в мозжечке, ретикулярной формации, красных ядрах, гиппокампе и коре головного мозга (Fridman, Roberts, 1994). Митохондрии из других исследованных органов и тканей содержат низкую активность КК или вообще лишены ее.
К настоящему времени опубликован достаточно обширный материал, посвященный сравнительному изучению свойств митохондриальной КК и свойств цитозольных изоформ, особенно ММ КК, имевший целью получение дополнительных доказательств того, что митохондриальная КК - это отдельный фермент. По своему аминокислотному составу миКК отличается от М и В субъединиц других изоферментов. Различия касаются в основном трех аминокислот: аргинина, лизина и цистеина. Содержание цистеина в миКК в 2 раза больше, чем в ММ КК (Липская, 1983). Также отмечается пониженное содержание лизина и повышенное содержание аргинина (Белоусова, Муйжнек, 2004). Лизин и аргинин относятся к классу гидрофильных аминокислот, играющих важную роль в формировании поверхности белков и выполнении их функции (Eriksson et al., 1998). Они также являются основными аминокислотами, которые при рН 7,0 заряжены положительно, и именно они могут быть ответственны за различия в изоэлектрической точке. ИЭТ миКК из сердца 9,2-9.6, у ВВ изофермента из мозга крысы ИЭТ 5,9, для ММ изофермента из мышц кролика ИЭТ 6,1 (Липская, 2001). Величина ИЭТ для миКК говорит о том, что в физиологических условиях глобула белка заряжена положительно (Липская, 1983). Обращает на себя внимание тот факт, что различия в аминокислотном составе касаются именно тех аминокислот, которые участвуют в формировании активных центров, расположенных по периферии молекулы ( Schnyderetal., 1995).
Блюм со авторами (Blum et al., 1983) сравнили последовательности 11 аминокислот на N-конце митохондриальной КК из сердца человека и ММ-КК: последовательности оказались различными. Перриман и соавторы (Perrymann et al.,1983) установили, что митохондриальная КК как и ММ-КК кодируется ядерным геномом, но, в отличие от ММ-формы, митохондриальный изофермент транслируется со своей м-РНК в виде предшественника с большой молекулярной массой. Авторы предполагают, что отщепление от предшественника полипептида с молекулярной массой бОООДа происходит во время транспорта КК через наружную мембрану митохондрий. Митохондриальная КК отличается от цитоплазматических форм и по времени своего появления в тканях, в сердечной мышце она обнаруживается только через несколько дней после рождения животного, в то время как в мозге экспрессируется большой группой нейронов при рождении (Shen et al., 2002; Boero et al., 2003). Рядом исследователей отмечается также температурная устойчивость ми-КК, а также зависимость термоустойчивости от рН и олигомерной организации изофермента.
Таким образом, митохондриальная КК отличается от цитоплазматических форм электрофоретической подвижностью, аминокислотным составом, особенностями процесса трансляции и посттрансляционного процессинга, степенью олигомеризации, изоэлектрической точкой, температурной устойчивостью и т.п. Вся совокупность приведенных результатов однозначно свидетельствует в пользу того, что митохондриальная креатинкиназа - самостоятельный изофермент.
В конце 80-х годов в лаборатории Валлимана (Wallimann et al.,1988) было доказано существование двух митохондриальных изоферментов -саркомерного, выделенного из сердечной мышцы цыпленка, и «вездесущего», выделенного из мозга цыпленка. Было установлено, что митохондриальная КК мозга отличается от КК сердца изоэлектрической точкой, способностью взаимодействовать с моноклональными и поликлональными антителами на ми-КК сердца, пептидными картами, полученными после обработки трипсином, N-концевой последовательностью аминокислот и кинетическими свойствами (Hossle, et al., 1988). В то же время Kanemitsu et. al. (2000) при сравнительном исследовании митохондриального изофермента из сердечной мышцы и мозга человека не установили существенных различий в изоэлектрической точке и каталитических характеристиках. Таким образом, в литературе отмечаются противоречивые данные о сходстве и различии s-CK и и-СК.
Получены первичные экспериментальные данные по изучению каталитических свойств креатинкиназы митохондрий. Джекобу с и Ленинджер (Jacobus, Lehninger, 1973) установили, что ми-КК из сердца крысы обладает специфичностью к АТФ и АДФ. Блюм и соавт. (Blum et al.,1983) показали на митохондриальной КК из сердца человека, что ГДФ, ЦДФ, УДФ или дТДФ не могут заменить АДФ в качестве субстрата обратной реакции, а ИДФ фосфорилируется со скоростью, составляющей 18% от скорости с АДФ и имеет Кт больше, чем на порядок превосходящую Кт для АДФ.
Особенности энергетического обмена мозга и состояние мембран при повышении устойчивости к кислородному голоданию
Самые разнообразные нарушения физиологического состояния организма сопровождаются гипоксическим синдромом. При этом вне зависимости от его происхождения возникает нарушение биологического окисления. Есть основание полагать, что именно энергетический дефицит изменяет функцию, субклеточную структуру и регуляцию метаболизма в динамике нарастающей гипоксии, а также адаптацию к ней (Береговская, 1993; Лукьянова, 2002; Дудченко, 2004). Нервная ткань и особенно кора больших полушарий характеризуются высоким уровнем энергетического обмена (Хватова, Мартынов, 1977). Энергетическому метаболизму головного мозга свойственен ряд особенностей: исключительно высокая скорость гликолитического и дыхательного этапов обмена глюкозы, компартментализация метаболических систем и широкие возможности метаболической альтерации. Возникающие нарушения биологического окисления и энергетический дефицит при гипоксии в первую очередь связаны с механизмами регуляции окислительных ферментов, которые до конца не раскрыты (Кометиани, 1980; Хватова Е.М., 1992; Гусев, 2001; Dos Santos P. et al., 2004).
Изменение каталитических свойств окислительных ферментов при гипоксии приводит к значительному увеличению восстановительных эквивалентов, что сопровождается уменьшением содержания АТФ, креатинфосфата и ростом количества продуктов их распада АДФ, АМФ, неорганического фосфата, аденозина (Хватова и др., 1987; Park, Thorn et al., 1985). Этот первичный комплекс нарушений приводит к активации гликолиза: повышается активность фосфорилазы и гексокиназы, далее высокая скорость процесса поддерживается за счет активации фосфофруктокиназы (Хочачка, Сомеро, 1977, Hochachka, 1986; Hoger et al., 1986, Lushchak et al., 1998).
По данным Грэй (Gray et al., 1994), краткосрочная ишемия мозга приводит к увеличению доли мембраносвязанной гексокиназы, что увеличивает скорость гликолиза. В тоже время хроническая гипоксия приводит к уменьшению гексокиназной активности (Lai et al., 2003), уменьшается доля митохондриального фермента (Игнатюк, 1977), что сказывается на уменьшении скорости гликолиза, несмотря на то, что в мозге сохраняется высокая концентрация глюкозы (Шлапакова, 1981). Аналогичные результаты получены Плакстоном (Plaxton, 1986), который показал, что при аноксии у животных относительное количество гексокиназы в связанном с мембраной состоянии в сердце уменьшается в 1,5 раза при соответствующем увеличении фермента в свободном состоянии. В литературе накоплены данные, что именно гликолитическая фракция АТФ играет важную роль в сохранении целостности и функционирования клеточных мембран, а ингибирование гликолиза во время длительной ишемии является фактором, потенциирующим их повреждение (Higgins et al., 1981; Bricknell et al., 1981; Vannuccii et al., 2005).
Стадия усиления гликолиза при кислородном голодании обусловлена активацией его ферментативной системы, однако, даже в период максимальной активности, когда гликолиз поставляет до 80% всей образующейся энергии, он удовлетворяет потребность основного обмена лишь на 1/3-2/3 и одновременно приводит к накоплению лактата и резкому снижению тканевого рН (Биленко, 1989). В процессе ишемии гликолиз проходит 3 стадии изменений Lutz, Nilsson, 1997a,b: 1. начальное быстрое усиление, 2. последующее ослабление, 3. прекращение. Одной из главных причин снижения активности полиферментной системы гликолиза, возможно, нарушение связи ферментов с мембранами органелл клетки, в результате нарушения их структурно-функциональной целостности под влиянием эндогенных гипоксических токсинов (Masters et al., 1987). По мнению авторов, цепь гликолитических ферментов может быть разделена на 4 сегмента, каждый из которых может адсорбироваться на структурных компонентах клетки и функционировать относительно самостоятельно. 1-й сегмент (энергопотребляющий) состоит из трех ферментов: гексокиназы, глюкозо-6-фосфат-изомеразы, фосфофруктокиназы - и расположен вблизи митохондрий, поставляющих АТФ, причем гексокиназа адсорбирована на наружной мембране митохондрий. 2-й сегмент (энергообразующий): альдолаза, триозофосфатизомераза, глицеральдегидфосфатдегидрогеназа, фосфоглицераткиназа; связь обеспечивают альдолаза и глицеральдегидфосфатдегидрогеназа. 3-й (энергообразующий) сегмент сходен со вторым и обеспечивается адсорбцией на актине пируваткиназы. 4-й сегмент состоит только из лактатдегидрогеназы. Взаимодействие сегментов друг с другом и структурными компонентами изменяется в зависимости от физиологического состояния клетки, а также стадии ее развития. Акопян (2006), используя метод молекулярной динамики, также продемонстрировал динамическое взаимодействие гликолитических ферментов. Особую чувствительньность головного мозга к недостатку кислорода Березовский (1978) рассматривает как результат невозможности в достаточной мере обеспечить ресинтез макроэргических фосфорных соединений за счет анаэробного гликолиза. Содержание АТФ в нервной ткани при высоком уровне его образования от 0,6 до 2,4 мкмоль/г в мин составляет 2,08 мкмоль/г, в то время как в поперечно-полосатых мышцах количество АТФ равно 5,0 мкмоль/г при гораздо более низком уровне его образования (Прохорова, 1979; Четверикова, Розанова, 1983). Не вызывает сомнения, что в процессе метаболической адаптации организма к кислородному голоданию важную роль играют ферменты, связанные с мембранами митохондрий (Хватова, 1992). Показано, что чем более в гипоксическом окружении находится животное, тем больше митохондрий в тканях. Именно многочисленность митохондрий позволяет животным с наибольшей эффективностью использовать то минимальное напряжение кислорода, которое ему доступно (Савина, 1992).
Каталитические свойства фосфокиназ и состояние свободно радикального окисления в головном мозге животных при острой ишемии
Выявлены изменения в общей активности митохондриальной креатинкиназы и активности фермента в субмитохондриальных фракциях при различных сроках нарушения гемодинамики мозга экспериментальных животных. Полученные результаты представлены в таблице 24.
При увеличении продолжительности ишемии мозга до 1,5 часов (90 минут) происходят изменения в распределении активности креатинкиназы в митохондриях и субмитохондриальных фракциях. Так общая активность фермента в митохондриальной фракции остается сниженной в 1,4 раза по сравнению с интактными животными, однако, в сравнении с контролем происходит рост общей активности креатинкиназы на 38%.
Существенные изменения выявлены в осадке митохондриальных мембран. Установлено значительное увеличение активности мембраносвязанной формы фермента в 1,9 раза по сравнению с контрольным уровнем и даже превышение на 27% по сравнению с тем же показателем у интактных животных. Для растворимой формы фермента значительных изменений в активности по сравнению с контрольным уровнем не установлено, ее величина остается несколько сниженной на 28% относительно интактных животных.
При дальнейшем увеличении экспозиции ишемии до 4 часов происходит положительная динамика в изменении активности митохондриальной креатинкиназы. В общей митохондриальной фракции выявлен дальнейший рост активности креатинкиназы в 1,8 раза по сравнению с острой 30 минутной ишемией, и ее величина приближается к значению интактных животных. Доля мембраносвязанного фермента также увеличивается в 2 раза по сравнению с острым ишемическим состоянием и на 44% превышает активность у интактных животных. Установлена положительная динамика в активности растворимой формы креатинкиназы, ее величина увеличивается на 30% по сравнению с контролем и приближается к значению интактных животных.
Дальнейшее увеличение продолжительности ишемии мозга до 18 часов приводит к некоторому снижению общей активности креатинкиназы в митохондриях и осадке митохондриальных мембран по сравнению с 4-часовой ишемией. Тем не менее, активность фермента в общей митохондриальной фракции и на мембране сохраняется повышенной на 42% и 55%о соответственно по сравнению с контрольным уровнем. При этом происходит снижение активности креатинкиназы в общей митохондриальной фракции в 1,4 раза относительно интактной группы, а активность мембранносвязанной формы фермента сохраняется на исходном уровне. Активность растворимой формы фермента соответствует норме, увеличиваясь в 1,4 раза по сравнению с острой 30 минутной ишемией.
Солюбилизация митохондриальной креатинкиназы с мембран митохондрий в динамике после острой ишемии мозга Ишемия различной продолжительности оказывает существенное влияние на взаимодействие креатинкиназы с мембранами митохондрий. Полученные результаты по солюбилизации фермента при нарушении гемодинамики мозга различной продолжительности представлены в таблице 25. Как видно из таблицы, увеличение продолжительности экспозиции до 18 часов при нарушении гемодинамики мозга проводит к постепенному росту активности прочносвязанной формы фермента. Так, если при 1,5 102 часовой ишемии активность существенно не увеличивается относительно контрольной группы животных, то при 4-часовой ишемии она возросла до 67% и сохранилась практически на этом уровне на протяжении 18 часов после перевязки общих сонных артерий. Изучение эффекта солюбилизации мембраносвязанной формы креатинкиназы показало, что при увеличении срока экспозиции до 1,5 часов происходит нарушение адсорбционных свойств фермента. Доля солюбилизированной креатинкиназы возрастает на 20% по сравнению с интактными животными и сохраняется практически на этом уровне, 103 несколько понижаясь, на протяжении 4-часовой ишемии мозга, существенно не увеличиваясь по сравнению с контролем. При увеличении срока ишемии до 18 часов дополнительная обработка митохондриальных мембран электролитом не приводит к дальнейшей десорбции фермента с мембраны, и доля солюбилизированного фермента составила всего 10%, что в 3,5 раза меньше, чем в группе интактных животных (рис.25). Таким образом, увеличение продолжительности ишемического воздействия приводит к увеличению активности прочносвязанной формы креатинкиназы и ослаблению десорбции фермента с мембран митохондрий. Кинетическая характеристика митохондриальной креатинкиназы в динамике острой ишемии мозга В общей митохондриальной фракции, осадке митохондриальных мембран до и после обработки фосфатным буфером, а также в растворимой фракции определяли показатели, характеризующие каталитические свойства креатинкиназы при ишемии различных сроков продолжительности (V0, Vmax, Кщ). Кинетические показатели определяли при фиксированной концентрации АДФ (2мМ). Установлены различия в кинетических характеристиках фермента в зависимости от его внутримитохондриальной локализации. Результаты изменения начальных скоростей креатинкиназной реакции при нарастающих концентрациях креатинфосфата у животных разных экспериментальных серий представлены в таблицах 26,27, 28, 29. Изучение кинетики при 1,5-часовой ишемии в общей митохондриальной фракции показало, что зависимость скорости реакции от концентрации креатинфосфата напоминает гиперболическую кривую, но отличается от нее (рис. 26).
Каталитическая активность митохондриальных креатинкиназы и гексокиназы мозга и состояние свободно радикального окисления при проверке устойчивости организма тренированных животных к ишемии
Таким образом, увеличение срока тренировки до 4-х дней приводит к ограничению активности ПОЛ в ткани мозга.
В целом, проведенное исследование состояния про- и антиоксидантных систем с параллельной регистрацией состояния функциональных характеристик мембран и связанных с ними ферментов - гексокиназы и креатинкиназы- позволяет определить роль основных фосфокиназ энергетического обмена мозга в метаболической перестройке, возникающей при повышении устойчивости к кислородному голоданию.
Установлены менее благоприятные сдвиги в метаболизме мозга при однократной тренировке, причем наибольшие изменения касались гексокиназы, связанной с наружной мембраной митохондрий. Отмечается снижение активности фермента почти на 40% по сравнению с интактными животными. Однократная солюбилизация гексокиназы раствором электролита приводит к ослаблению взаимодействия с мембраной, и доля солюбилизированного фермента составила около 50%. Выявлено также снижение начальной и максимальной скоростей гексокиназной реакции по сравнению с интактными животными при несущественном изменении константы Михаэлиса.
Менее значительные изменения выявлены в каталитических свойствах креатинкиназы, локализованной на наружной стороне внутренней мембраны митохондрий. Активность фермента в общей митохондриальной фракции снизилась всего лишь на 27%, практически не изменяется соотношение между ассоциированной формой креатинкиназы и активностью фермента на мембране после обработки электролитом. В то же время происходят скрытые изменения в свойствах фермента, о чем говорит изменение кинетического поведения креатинкиназы, появление аномального типа развития ферментативной реакции в общей митохондриальной фракции и осадке митохондриальных мембран. В осадке митохондриальных мембран для креатинкиназы характерно значительное увеличение начальной скорости при всех изученных концентрациях креатинфосфата в 1,5-2,5 раза по сравнению с интактными животными. Отмечается быстрое насыщение фермента субстратом, и при повышении концентрации креатинфосфата выше 0,7мМ мембраносвязанная креатинкиназа становится не чувствительной к увеличению концентрации субстрата.
При увеличении продолжительности интервального гипобарического прекондиционирования до 4-х дней происходит стабилизация метаболических реакций, что позволяет охарактеризовать данный режим тренировки как максимально способствующий сбалансированности энергетических процессов.
Происходит увеличение активности мембраносвязанных ферментов по сравнению с однократным режимом тренировки, и их величина практически соответствует интактным животным для креатинкиназы и несколько превышает даже для гексокиназы. Отмечается уменьшение доли солюбилизированных ферментов. Увеличивается доля связанной с мембраной формы креатинкиназы, также уменьшается степень солюбилизации гексокиназы и ее величина в более чем 4 раза меньше, чем у интактных животных. Установлен рост начальных скоростей, более выраженный для креатинкиназы, также увеличивается сродство фермента к креатинфосфату в общей митохондриальной фракции, что свидетельствует об адекватном потоке энергии из митохондрий в цитоплазму. Одновременно Хватова с сотрудниками (1979) показали, что содержание макроэргических соединений - АТФ и ГТФ сохраняется на неизменном по сравнению с интактными животными уровне при активировании дыхательных ферментов.Каталитическая активность митохондриальных креатинкиназы и гексокиназы мозга и состояние свободно радикального окисления при проверке устойчивости организма тренированных животных к ишемии
Метаболический ответ мозга на острую ишемию в значительной степени обусловлен подготовленностью ткани в результате предварительного интервального гипобарического прекондиционирования. В данной главе представлены результаты по проверке устойчивости организма животных к ишемии после краткосрочных тренировок. 3.5..1. Каталитические свойства митохондриальной креатинкиназы при проверке устойчивости животных к ишемии после однократной тренировки
Выявленные изменения в общей активности митохондриальной креатинкиназы и активности фермента в субмитохондриальных фракциях мозга при проверке устойчивости к ишемии после однократной тренировки представлены в таблице 46.
