Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 12
1.1. Апоптоз 12
1.1.1. Определение 12
1.1.2. Этапы апоптоза 12
1.1.3. Биохимическая характеристика апоптоза 13
1.1.4. Стадии апоптоза . 16
1.1.5. Апоптоз и клеточный цикл 21
1.1.6. Роль апоптоза 22
1.1.7. Апоптоз и заболевания , 23
1.2, Fas и Fas-L 24
1.2.1. Функция Fas рецептора 24
1.2.2. Структура Fas рецептора 24
1.2.3. Растворимая форма Fas рецептора... 25
1.2.4. Экспрессия Fas рецептора 25
1.2.5. Структура Fas литанда(РазЬ) 27
1.2.6. Экспрессия Fas лиганда 28
1.2.7. Fas-опосредованный апоптоз..., 29
1.2.8. Формы Fas-L ЗІ
1.2.9. Функция Fas-L 32
1.2.10. Fas может запускать пролиферацию 32
1.2.11. Патология системы Fas/Fas-L 33
1.3. Системная красная волчанка (скв) 35
1.3.1. Определение 35
1.3.2. Эпидемиология 35
1.3.3. Клинические проявления 36
1.3.4. Аутоантигены и аутоантитела при СКВ 39
1.3.5. Этиология. Причины появления аутоантител 40
1.3.6. Патогенез СКВ и антитела 42
1.3.7. Роль комплемента в патогенезе системной красной волчанки 43
1.3.8. АпоптозиСКВ 44
1.3.9. Факторы влияющие на апоптоз при СКВ 45
1.3.10. Лимфоциты и СКВ 49
1.3.11 НейтрофилыиСКВ 50
2. Материалы и методы 51
2.1.Использованные материалы и реактивы 51
2.2. Группы обследованных больных 52
2.3. Методика выделения мононуклеарных лейкоцитов, их фракций и гранулоиитов периферической крови человека 55
2.4.Исследование структуры ДНК прямым флуориметрическим методом 57
2.5.Методы определения количества апоптотических клеток 58
2.6. Методы определения Fas/FasL и растворимого s Fas 60
2.7.Метод определения ВсЬ2 61
2.8. Определение общей гемолитической активности комплемента 62
2.9.Статистическая обработка данных 63
3. Результаты исследований и их обсуждение 64
3.1. Повреждение структуры ДНК лейкоцитов периферической крови у больных
системной красной волчанкой и другими аутоиммунными заболеваниями как маркер
апоптогенной готовности 64
3.1.1. Исследование уровня повреждений ДНК иммунокомпетентных клеток при СКВ 65
3.1.2. Изучение апоптоза лимфоцитов и гранулоцитов при СКВ , 67
3.1.3. Исследование корреляции между титром аутоантител, уровнем повреждений ДНК и апоптозом клеток крови 74
3.1.4. Исследование уровня апоптоза лимфоцитов в зависимости от суточной дозы преднизолона у больных СКВ 77
3.1.5. Исследование динамического изменения повреждений ДНК в зависимости от терапии у больных СКВ 80
3.1.6. Анализ субпопуляций лимфоцитов у больных СКВ 82
3.2. Исследование роли системы Fas/Fas-L в регуляции апоптоза при СКВ 86
3.2.1. Оценка уровня экспрессии Fas/Fas-L в лейкоцитах периферической крови при СКВ 87
3.2.2. Исследование экспрессии CD95 (Fas) и оценка уровня апоптоза различных субпопуляций лимфоцитов 90
3.2.3. Определение растворимого sFas в плазме больных СКВ 94
3.2.4.Определение зависимости относительного содержания sFas/Fas от содержания активированных лимфоцитов 98
3.2.5. Изучение взаимосвязи уровня sFas и титра антиядерных антител 98
3.2.6. Изучение системы комплемента у больных СКВ 100
3.2.7. Изучение антифосфолипидного иммунного ответа 101
3.2.8.Определение экспрессии bcl-2 у больных СКВ 102
Заключение 104
Выводы 112
Список литературы 114
- Биохимическая характеристика апоптоза
- Факторы влияющие на апоптоз при СКВ
- Методика выделения мононуклеарных лейкоцитов, их фракций и гранулоиитов периферической крови человека
- Исследование уровня апоптоза лимфоцитов в зависимости от суточной дозы преднизолона у больных СКВ
Введение к работе
Актуальность проблемы. Системная красная волчанка (СЬСВ)
представляет собой системное аутоиммунное заболевание,
характеризующая широким спектром клинических и иммунологических нарушений. Этиопатогенез СКВ до настоящего времени неясен. [Herrmann M.etal., 1998].
СКВ характеризуется поликлональной активацией В-лимфоцитов и продукцией широкого спектра антител к ядерным и цитоплазматическим антигенам. Предполагается, что при СКВ пролиферация В-клеток является Т-клеточно-зависимой и антиген-опосредованной. Считается также, что персистенция аутореактивных В- и Т-лимфоцитов ответственна за гипергаммаглобулинемию и продукцию аутоантител [Dean GS. et al., 2000, Rose LM.,etal.,1997].
Одним из механгомов, благодаря которым осуществляется элиминация аутореактивных лимфоцитов, является апоптоз. Нарушения его регуляции может вносить определенный вклад в генез данного аутоиммунного заболевания [Mountz J D. et al., 1994]. Одним из главных путей, запускающих апоптоз, является путь, начинающийся с активации Fas-рецептора. Fas играет центральную роль в иммунном гомеостазе и опосредует передачу апоптотического сигнала в зрелых активированных лимфоцитах [Lynch DH. et al., 1995]. Перекрестное связывание Fas с лигандом FasL вызывает апоптоз с характерной цитоплазматической и ядерной конденсацией и фрагментацией ДНК [Itoh N et al., 1991].
Существует предположение о возможной роли апоптотических клеток в развитии СКВ [Andrade F. et al, 2000]. У больных СКВ показано возрастание уровня апоптотических лимфоцитов в периферической крови [Perniok A. et al, 1998]. Кроме того, было установлено, что в процессе апоптоза аутоантигены выносятся на поверхность внешней мембраны апоптотических клеток. Это может определять продукцию аутоантител непосредственно к внуриклеточно локализованным антигенам [Casciola-Rosen LA et al.,1994]. В эксперименте было показано, что введение большого количества апоптотических клеток животным вызывает у них аутоиммунную реакцию [Mevorach D et al, 1998].
Между тем, результаты исследований, посвященных апоптозу при СКВ, весьма разрозненны. С одной стороны, лимфоциты, полученные от людей, больных СКВ, проявляют увеличение уровня спонтанного апоптоза in vitro по сравнению со здоровыми донорами [Elmen W et al.,1994, Lorenz HM. et al, 1997]. Было выдвинуто предположение, что это обуславливается активацией мононуклеарных клеток периферической крови у больных СКВ, которая приводит к индукции клеточной гибели. Остается неясным, находится ли у больных СКВ уровень апоптоза в равновесии с возрастающим уровнем активированных лимфоцитов и с
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ і
БИБЛИОТЕКА I
СПетегйрг^ «- |
» ОЭ WHttrfc) I
иммунореактивностью организма больного в целом. Неизвестно также, какие еще факторы, вызывающие апоптоз и сопутствующие ему, могут играть роль в патогенезе заболевания. Из литературы известно, что у ряда больных СКВ происходит возрастание концентрации апоптоз-ингибирующих факторов, таких как растворимый Fas (sFas), Bcl-2, и антител против Fas-L [Cheng J ., 1994, Jodo S.et al, 1997, Rose LM, .et al., 1997, Tokano Y.et al, 1996, Van Lopik T.et al, 1999]. Апоптоз лимфоцитов может быть инициирован также использованием препаратов-иммуносупрессоров [Thompson СВ., 1995].
С другой стороны, на экспериментальных моделях мышей линий Ipr (лимфопролиферация) и gld (генерализованная лимфопролиферативная болезнь) показано, что развитие СКВ прямо связано с дефектами Fas-сигнального пути. У мышей обеих линий мутации в гене Fas и FasL приводят к развитию аутоиммунного синдрома с утратой Т-клеточной толерантности, В-клеточным нарушениям, гипергаммаглобулинемией и продукцией аутоантител [Rose LMet al, 1997]. MRL-lpr/gld мыши имеют мутацию в гене Fas, что приводит в экспрессии мутантного белка и нарушению сплайсинга мРНК, в то время как СЗН/HeJ-gld/gld мыши, дефицитны по функциональному лиганду FasL в результате одиночной мутации [Lorenz HM.et al, 1997]. Дальнейшие исследования СКВ у человека также привели к обнаружению аналогичных дефектов в функционировании Fas и FasL. Однако, до настоящего времени не определена степень участия системы Fas - Fas-L в развитии и регуляции апоптоза при СКВ у человека [Elmen W. Et al.,1994].
Поэтому целью настоящего экспериментального исследования
явилось изучение механизмов регуляции апоптоза в лейкоцитах периферической крови больных СКВ.
В связи с этим были сформулированны следующие задачи исследования:
Анализ иммунореактивности больных СКВ с количественным определением активированных лейкоцитов, основных субпопуляций лимфоцитов (CD3, CD4, CD8, CD20, CD25), индекса иммунорегуляции (CD4/CD8) и уровня общего комплемента.
Изучение зависимости количества различных субпопуляций лейкоцитов в состоянии апоптоза от степени активности заболевания.
Исследование уровня экспрессии Fas и Fas-L в различных субпопуляциях лейкоцитов и содержания sFas в крови пациентов в зависимости от степени активности заболевания.
Анализ изменений ДНК лейкоцитов в качестве раннего маркера апоптоза в зависимости от степени выраженности заболевания.
Научная новизна. Показано, что степень фрагментации ДНК на начальных стадиях апоптоза лейкоцитов периферической крови больных СКВ значительно превышает значения этого показателя у здоровых доноров. Увеличение числа повреждений ДНК при этом определяется стадией развития заболевания.
Доказана выраженная прямая зависимость между уровнем антител к ДНК и ее фрагментам и степенью повреждения ДНК в лейкоцитах. Показано также, что уровень антиядерных антител и антител к ДНК у больных системной красной волчанкой зависел от выраженности заболевания и активности системы Fas - Fas-L. Установлено, что уменьшение содержания В-лимфоцитов в периферической крови больных СКВ не является обязательным признаком.
Практическая значимость исследования. Информация о роли системы Fas - Fas-L в патогенезе СКВ, а также обнаруженная зависимость между уровнем антител к ДНК и ее фрагментам и степенью повреждения ДНК в лейкоцитах выражена в виде линейного уравнения регрессии, которое может быть использовано в клинической практике при планировании лечебных мероприятий и прогнозе исхода заболевания. Апробация работы. Результаты исследований были доложены на II Российской конференции молодых ученых «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (2001г., Москва), на VIII Международного конгресса по иммунореабилитации «Аллергия, иммунология и глобальная сеть» (21-24 апреля 2002., Канны, Франция), на FEBS Special Meeting 2003 on Signal Transduction (3-8 July2003., Belgium, Brussels). Апробация работы состоялась на научно-практической конференции кафедры биологической химии и лаборатории молекулярной биологии и биохимии НИИ молекулярной медицины ММА им. И.М. Сеченова г. Москва, 3 декабря 2003 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ. Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 132
страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исседований, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы, список цитированной литературы, включающий 246 источник, приложение. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 16 таблицами.
Биохимическая характеристика апоптоза
Для апоптоза характерно, что погибшие клетки мгновенно узнаются и фагоцитируются либо соседними клетками, либо макрофагами. [138], Распознание аполтотических клеток макрофагами и соседними клетками обусловлено специфическими поверхностными маркерами. В некоторых случаях, присутствующие на поверхности апоптотической клетки углеводородные молекулы могут связываться с лектинами фагоцитов. В других случаях, функцию связывания апоптотических клеток и фагоцитов выполняют молекулы тромбоспондина, коллектипа или комплемента (ІСЗЬ). Наиболее изучена в апоптозе последовательность изменений, происходящих на поверх ности клетки при воздействии фосфатидилсерина, сочетающаяся с потерей (утратой) асимметрии фосфолипидов. [225].
Асимметрия фосфолипидов (ФЛ, PL) липидного бислоя является характерной чертой клеточной мембраны. Фосфолипиды в мембране распределены асимметрично: фосфатидилсерин (ФС,РБ) и фосфатщщлэтаноламин (ФЭ,РЕ) находятся во внутренней части бислоя, а фосфатидилхолин преимущественно составляет наружный бислой. В нормальных клетках такая асимметрия поддерживается АТФ-зависимой транелоказой. В процессе апопотоза нарушается функционирование АТФ-транслоказы или же активируется другая ферментная сиситема (скрамблаза), в результате чего фосфатидилсерин распределяется в поверхностной части бислоя. Поверхностное положение фосфатидилсерина в апоптотических тельцах является сигналом к фагоцитозу для макрофагов и соседних «непрофессиональных» фагоцитов [49, 91]. 1,1.4. Стадии апоптоіа
Схематично всю картину апопотоза можно представить несколькими этапами: инициацию апопотоза, генетическую регуляцию (регуляцию данного процесса на генетическом уровне) и саму эффекторную стадию. (А) Инициация апоптоза Апоптоз может регулироваться различными внешними стимулами. Известны неспецифические сигналы, запускающие каскад реакций апоптоза: температура [219], свободные радикалы [28], ультрафиолетовое излучение [241], лекарственные препараты и синтетические пептиды [16, 193], токсины [184], лимфоцитарные ферменты - гранзимы [83]. Наибольший интерес представляют активаторы апоптоза, механизм действия которых зависит от экспрессии на поверхности соответствующих клеток определенных рецепторов. Данные индукторы представлены различными факторами роста (например, трансформирующий фактор роста Р[161]), цитокины, в том числе и фактор некроза опухоли (TNF) [194]. Во многих клеточных популяциях молекулы семейства ФНО играют важную роль в регуляции выживаемости клетки или ее апоптотической гибели [154, 164, 199]. К семейству рецепторов ФНО относится Fas (CD95/Apo-l) рецептор. Считается, что именно Fas является основным триггером агю птоза [53, 129, 130].
При активации рецепторов смерти на поверхности клетки, например Fas (CD95) или рецептора-1 ФНО (ФНСМ), происходит олигомеризация цитозольных протеинов (FADD, MORT, RIP, TRADD), что а свою очередь приводит к активации каскада протеаз семейства каспаз [44, 60]. (В): Генная регуляция апоптоза
Апоптоз является акти иной формой клеточной смерти и контролируется экспрсссиией высконсервативных генов, которые либо активируют, либо подавляют процесс клеточной гибели [57].
Существует ряд факторов, непосредственно регулирующих экспрессию каспаз, минуя рецепторныи механизм [26]. Каспазы являются составной частью каскада ннутриклеточных протеолитических реакций, которые регулируют в клетке многие этапы апоптоза, в том числе они активируют факторы транскрипции [88], Факторы транскрипции являются регуляторними белками, которые связываются со специфическими иниіширующимим сайтами ДНК и в свою очередь модулируют экспрессию генов, продукты которых регулируют образование проапоптотических. и антиапоптотических факторов. Данными важными апоптотическими генами являются семейство белков Вс1-2 [159], цитохром С[189], супрессоры опухолевых генов р53 и р2! (WAF 1) и многие другие [61]. Роль р53
Ген р53 кодирует белок регуляции транскрипции. Он активируется при гешлоксическом действии на клетку и ее повреждении. Гсотоксическими повреждающими агентами являются химиотерапевтические препараты, радиоактивное (ионизирующее) излучение, активные формы кислорода. Белок р53 регулирует транскрипцию ДНК, соединяясь непосредственно с ДНК, в случае, когда распознает ее повреждение (одно- или двунитевые разрывы). Как минимум два важных клеточных процесса регулируется данным белком: арест клеточного цикла на Gt-фазе и запуск апоптотической гибели. Если повреждение клетки может быть исправлено в ходе процесса репарации, то арест клеточного цикла белком р53 обеспечивает клетку достаточным временем для восстановления структуры ДНК. При этом происходит увеличение синтеза белка р53 и его фосфорилировапия (фосфорилироаанная форма р53 является более активной по сравнению с нефосфорилированай). Механизм р53 -зависимого ареста клеточного цикла связан с увеличением синтеза ингибитора СДК4 -Р2І, который препятствует фосфорилироваиию ретинобластомного протеина (Rb) комплексом циклин D/CDK4. Если дефект более существенный, для того чтобы предотвратить пролиферацию генетически неполноценной клетки и образование дефектных или злокачественных клонов (клетки с некомпенсированной ДНК-последовательностыо) р53 «направляет» клетку на путь апоптоза, индуцируя апоптоз клетки посредством белков семейства Ес1-2. [70, 105]. Роль Bcl-2/Bax
Важнейшая роль в регуляции сигнала апоптоза принадлежит семейству генов bcl-2/bax. Ныло открыто шестнадцать представителей данного семейства, некоторые белки - являются ингибиторами апоптоза (например Вс1-2 и ВСІ-XL), другие - индукторами апоптоза (Вах, Bad, Bid). Высокий уровень экспресии белков группы Вах делает клетку более чувствительной у апоптотическим стимулам, а белков группы Вс1-2 -предотвращает клеточную гибель. Возможно, р53 функционирует, изменяя количественное соотношение белков Bcl-2/Bax (рис.1).
Факторы влияющие на апоптоз при СКВ
Было выполнено несколько исследований, в которых был измерен sFas у больных с СКВ. Эти исследования продемонстрировали высокий уровень sFas у больных с СКВ и связь между уровнем sFas и активностью заболевания [21, 98, 168, 183, 221, 228]. Высокие уровни sFas были обнаружены перед рецидивом заболевания [228], и коррелировали с состоянием активации В-лимфоцитов [21],
В отличие от работ Cheng et al. [41], в которых было показано, что sFas ингибировал Fas-опосредованный апоптоз, присутствие sFas, не значительно блокирует Fas-опосредованный апоптоз у больных с СКВ. Активация лимфоцитов приводит повышению транскрипции мембранного Fas так же, как и альтернативной егшайе-формы sFas, и объясняет отношение, найденное между уровнями sFas и активностью заболевания. Это предполагает связь между уровнями sFas и повреждением органа, наблюдаемым у больных при обострении заболевания. Действительно, урошш sFas, коррелируют с повреждением органа, согласно шкале SLICC/ACR [7]. Однако гипотеза о том, что sFas является только отражением активации лимфоцита и поэтому неспецифична для СКВ, подтверждается наличием высоких уровней sFasy больных с ревматоидным артритом [49, 160].
Было показано, что активированные лимфоциты выделяют растворимые формы Fas-лиганда (sFas-L), который способен стимулировать апоптоз Fas позитивных клеток. Растворимый Fas -L, как известно, вызывает активацию ядерного фактора nB(NF-)tB) и/или секрецию IL-8 [211].
Семейство белка Bcl-2 состоит из 15 групп, разделенных на два подсемейстка [4]. Собственно Вс1-2 способствует продолжению жизни, тогда как Вах и ВНЗ подсемейства способствуют апоптозу. Существуют доказательства увеличения экспрессии bcl-2 пропорционально уровню периферических Т- клеток, но не В-клеток у больных с СКВ. Отмечают также полную корреляцию уровня экспрессии с активностью заболевания независимо от используемых критериев активности [182],
Отличия результатов воздействия на Т- и В-клетки в условиях in vivo могут быть обусловлены различием в нормальной продолжительности жизни этих клеток.. Т-клетки, предположительно, в условиях in vivo имеют период полураспада от месяцев до лет, в то время, как В-клетки живут 5-7 дней [153]. Белок Вс1-2 уникален среди других онкогенов, т.к. он увеличивает продолжительность жизни димфоидной клетки, скорее препятствуя апоптозу, чем стимулируя пролиферацию клеток [153].
Многие цитокины вовлечены в регулирование активности заболевания и в вовлечение различных органов у больных с СКВ [52]. Продукция цитокинов у больных с СКВ отличается и от контрольной здоровой группы и от больных с другими заболеваниями типа ревматоидного артрита. Кроме того, продукция цитокинов меняется у больных с различными фенотипами болезни СКВ. Баланс цитокинов более важен в определении формы проявления болезни или тяжести, а не в определении восприимчивости к болезни [52].
Действие Т-клеток, необходимых для продукции антител, опосредовано через цитокины. Поэтому, вероятно, цитокины играют роль в процессе нарушения толерантности и продукции аутоантител [52], Функциональные отклонения Т- и В-клеток были коррелировали с изменением продукции цитокинов, особенно, у больных с ревматической болезнью. Секреция Т-хелнерами типа 1 (Till) цитокинов, например, IL2, IFNY, и IL12], необходимых для сохранения классических Т-клеток, опосредующих иммунитет, уменьшена, в то время как продукция Th2 цитокинов, [например IL4, IL5, IL6 и ILI0], стимулирующих функцию В- клеток у больных с СКВ увеличена [222]. Интересно, что цитокины типа ТЫ предохраняют клетки от анолтоза, в то время как Th2 цитокины увеличивают апоптоз. Изменения в продукции цитокинов, подобные тем, что у больных с СКВ, сдвиг от ТЫ в сторону цитокинов типа Th2, были описаны в ходе развития ВИЧ ] инфекции [42]. Количество CD4 Т-клеток снижается в обратной зависимости с увеличением скорости апоптоза [145]. IL-10, присутствующий в повышенном количестве при активной СКВ, стимулирует апоптоз Т-клеток через Fas пути. Спонтанная гибель лимфоцитов, наблюдаемая in vitro у больных с СКВ [59], in vivo происходит путем активации Т-клетоКі активно стимулируется IL-10 и лигандом Fas, и отражает патофизиологически важные события in vivo. Прямые механизмы модуляции Т- клеточного апоптоза IL-10 могут включать ингибирование продукции Т-клетками IL-2, цитокинов, известных, как частично преодолевающих Т- клеточную анергию или апоптоз [135, 214]. Провоспалительные цитокины (IL6, ILI и TNFa), предположительно, стимулируют секрецию острофазных белков (С -реактивный белок и сывороточный амилоидный белок) в печени и так же могут увеличивать удаление циркулирующих аутоантлгенов. С- реактивный белок и сывороточный амилоидный белок, как полагают, связывают циркулирующие ДНК и РНК соответственно, делая их неиммуногенными. Поэтому, у пациентов с СКВ, у которых продукция TNFa снижена, с большей вероятностью развивается нефрит [52, 94], Было предположено, что относительно низкий уровень С- реактивного белка (CRP) способствует иммуногенности мРНК стать. Присутствие иммуногеннои мРНК может привести к продукции анти-мРНК антител, которые могут реагировать перекрестно с ДНК [115].
Методика выделения мононуклеарных лейкоцитов, их фракций и гранулоиитов периферической крови человека
Повреждение генетического материала иммунокомпетентных клеток может возникать при инфекционных заболеваниях, интоксикациях, экстремальных ситуациях, приеме лекарственных препаратов, что приводит к нарушению функционирования отдельных звеньев иммунной системы и, в конечном итоге, к развитию иммунологической недостаточности. В результате этого возникают осложнения, проявляющиеся инфекционными, аутоиммунными, аллергическими и онкологическими заболеваниями, В основе возникновения иммунодефицитных состояний лежит механизм апоптоза иммунокомпетентных клеток [2].
Основным морфологическим проявлением апоптотической гибели клеток является конденсация хроматина по периферии ядра с последующей деградацией ДНК. Происходящая в процессе апоптоза фрагментация ДНК может происходить последовательно: фрагментация на большие (50-300 тыс, пар нуклеотидов) фрагменты с последующим образованием более мелких фрагментов, размером с нуклеосому, т.е. 180 пар оснований [162]. Предшествующим событием фрагментации ДНК является появление однонитевых разрывов в двуспиральной цепи молекулы ДНК. Многочисленные однонитевые разрывы в ДНК были зафиксированы в течение ранней стадии апоптоза в межнуклеосомных областях [156]. Недавно было сделано предположение о том, что предшествующие фрагментации ДНК многочисленные однонитевые разрывы могут служить сигналом инициации апоптоза [24]. Экскреция нуклеосом из клеток при апоптозе будет приводить к появлению аутоантигеиов в крови человека, что может способствовать образованию аутоантител к ДНК при аутоиммунных заболеваниях и являться одним из звеньев патогенеза СКВ [59].
Целью данного раздела является определение уровня повреждений ДНК лимфоцитов и гранулоцитов периферической кропи больных СКВ, интенсивности повреждений ДНК клеток иммунной системы в зависимости от интенсивности агюптоза этих клеток, наличия аутоантител в сыворотке крови и результативности проводимой лекарственной терапией.
Структура ДНК больных СКВ была изучена в клетках лимфоцитов и гранулоцитов у 23 больных СКВ детей в возрасте от 5 до 16 лет с достоверным диагнозом по критериям американской ревматоидной ассоциации, получающих пзюкокортикоидную и/или цитостатическую терапию. Выборка сравнения включала в себя 11 больных детей системной склеродермией (ССД). В качестве контрольной группы исследовали аналогичные показатели у 33 здоровых добровольцев в возрасте от 18 до 35 лет.
Повреждения ДНК оценивали прямым флуоресцентным методом с использованием бромистого этидия. Бромистый этидий легче связывает крупные (50-300 тыс.п.о.) фрагменты ДНК, чем мелкие фрагменты (порядка 180-200 п.о.), в связи с чем его используют для количественной оценки фрагментации ДНК начальных стадий апоптоза клеток [24 ].
При обследовании здоровых добровольцев показатель поврежденной ДНК лимфоцитов периферической крови колебался от 7,3 до 30,7 %, составляя в среднем 20,1 +; 1,5%. Для гранулоцитов показатель неповрежденной ДНК периферической крови колебался от 1,4 до 21,1%, составляя в среднем 11,2 + 2,0% (табл.3). Эти данные свидетельствуют об отсутствии эндогенных повреждений ДНК в исследуемых клетках [22, 23].
Результаты исследования повреждений структуры ДНК при СКВ и ССД представлены в табл.3. Можно со всей определенностью заметить, что при этих заболеваниях нарушается структура генетического материала лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови. При этом при СКВ более значительные повреждения наблюдаются в лимфоцитах (55,5+15,7%,), но не в гранулоцитах (34,9+16,8%). Возникновение нарушений структуры ДНК лимфоцитов при СКВ может свидетельствовать о непосредственном вовлечении в патогенез заболевания генетического аппарата клеток иммунной системы. Это подтверждается увеличением повреждений ДНК лимфоцитов в зависимости от степени активности заболевания -при III, более активной стадии заболевания, наблюдается наиболее высокое повреждение структуры ДНК как в лимфоцитах, так и в гранулоцитах (табл.4).
для здоровых доноров. Суммарная доля повреждений генетического материала клеток лейкоцитарного звена при аутоиммунных заболеваниях намного выше, чем аналогичные показатели повреждений клеток лейкоцитарной системы здоровых доноров (рис. 3). Такое нарушение генетического материала клеток лейкоцитарного звена может определять патогенез аутоиммунных заболеваний.
Таким образом, в результате изучения степени повреждения ДНК было обнаружено, что имеет место большая степень фрагментации ДНК в лимфоцитах и гранулоцитах больных СКВ и ССД по сравнению со здоровыми донорами. Очевидно, что развитие аутоиммунного процесса у детей сопровождается повреждением генетического аппарата клеток крови. Было выдвинуто предположение, что степень фрагментации ДНК может служить маркером апоптогенной готовности клеток,
Исследование уровня апоптоза лимфоцитов в зависимости от суточной дозы преднизолона у больных СКВ
Правильное и своевременное удаление апоптозных телец - необходимое условие процесса апоптоза. Как было описано в обзоре литературы, распознавание апоптозных телец фагоцитами осуществляется за счет экспрессии на поверхности апоптотических клеток фосфатидилсерина. При наличии в крови антител к фосфолипидам, что имеет место при СКВ, происходит экранирование фосфатидилсерина и снижение фагоцитоза апоптотических клеток [85]. Антикардиолипин определялся при помощи иммуноферментного анализа с использованием антикардиолипиновых антител классов IgG и Ig М. Класс IgG антикардиолипиновых антител наиболее часто ассоциирует с осложнениями. Некоторые больные СКВ, имевшие высокий уровень антикардиолипиновых антител класса JgM имели в клинических проявлениях гемолитическую анемию, возникшую в результате аутоиммунной атаки на красные кровяные клетки. У 24 больных СКВ (64%) уровень антикардиолипиновых антител класса IgG составлял более 23 ME / мл (норма 0-23 ME/ мл в то время как у 13 больных СКВ (35,1%) этот показатель составлял менее 23 ME/ мл. У 12 больных СКВ (32,4%) уровень антикардиолипиновых антител класса IgM был выше 26 ME/ мл (норма 0-26 ME/мл). Таким образом, у двух третей больных развивался аутоиммунный ответ на собственные фосфолипиды. Возможно, что сходная картина изменений, происходящих в системе комплемента и аутоиммунного ответа на фосфолипиды связана с процессами распознавания клеток, находящихся в состоянии апоптоза. 3.2,8,Определение экспрессии Вс1-2 у больных СКВ. Считается доказанным, что высокий уровень аутоантител, наблюдаемых у больных СКВ, может быть результатом патологически длительной продолжительностью жизни поликлоналыных активированных В-лимфоцитов, что сопровождается повышенной экспрессией гена Вс]-2, который, в свою очередь, может повышать выживаемость лимфоидных клеток, регулируя процессы апоптоза. У трансгенных мышей, экспрессирующих белок Вс1-2 в В-клетках на высоком уровне, наблюдается развитие аутоиммунного синдрома, соответствующего клинической картине СКВ [182]. В данном исследовании была изучена экспрессия белка Вс1-2 в мононуклеарных клетках периферической крови больных СКВ, Мы изучали возможность гиперэкспрессии Вс1-2 в этих клетках. Белок Вс1-2 измерялся у 25 больных СКВ и L8 здоровых доноров. Только у трех больных обнаружили повышенный уровень этого белка по сравнению с нормальным. В целом статистически достоверных различий между контрольной группой и больными СКВ по этому параметру отмечено не было. Уровень ВЫ-2 не коррелировал с проявлениями заболевания у больных СКВ. У одного больного СКВ было обнаружено более высокое относительное содержание bcl-2+ лимфоцитов общего пула (91,4%) по сравнению с нормальным (82,7%), в связи с чем можно утверждать, что экспрессия белка ВсІ-2 у этого больного было повышенным по сравнению с нормой. У второго больного СКВ не было обнаружено достоверных различий в содержании Вс1-2 по сравнению с контролем (77,1% и 75,3% соответственно). У третьего больного СКВ был обнаружен более высокий процент содержания CD3+ клеток, экспрессирующих Вс1-2 (79,6%) по сравнению с контролем (44,7%); в то время как пул CD19+ клеток, экспрессирующих Вс1-2 составлял 37,9%. Таким образом, по нашим данным продукция белка Вс1-2 не является значимой а патогенезе СКВ. Патогенез СКВ до настоящего времени остается невыяснеи. Последнее время большое внимание уделяется роли апоптоза в патогенезе СКВ. Созданы экспериментальные модели СКВ на мышах линий MRL/lpr и gld. Роль апоптоза в патогенезе СКВ была изучена Emlen et al [59], описавших апоптоз в лимфоцитах больных СКВ по сравнению с лимфоцитами от здоровых людей in vitro. Наша работа, как указывалось ранее, посвящена изучению механизмов регуляции апоптоза в иммунокомпетентных клетках у больных СКВ. В ходе исследований подробно изучены некоторые аспекты программируемой клеточной гибели лейкоцитов периферической крови, а именно: фрагментация ДНК в ходе апоптоза; роль компонентов системы Fas- Fas-L и продуктов генов семейства ВсІ-2.
Поскольку фрагментация ДНК принята за биохимический признак апоптоза, мы исследовали повреждение ДНК у больных СКВ по сравнению со здоровыми донорами методом прямого флуоресцентного анализа. Мы обнаружили, что лимфоциты и гранулоциты больных СКВ имеют большую степень нарушений цепей ДНК. Более того, степень этих нарушения ДНК коррелирует с активностью протекания СКВ, Фрагментация ДНК позволяет говорить о том, что клетка находится в процессе гибели, в связи с этим мы полагаем, что разрывы ДНК могут рассматриваться как маркер готовности клеток к апоптозу у больных СКВ.
Мы изучали также повреждение ДНК у больного СКВ до и после лекарственного воздействия. В лимфоцитах и гранулоцитах этого больного с активной формой болезни (третья стадия) до начала лечения отмечалась высокая степень повреждений ДНК, в то время как после 30 дней применения преднизолона и циклофосфамида определялся более низкий уровень повреждений ДНК в этих же клетках. Снижение уровня повреждений ДНК сопровождалось снижением титра
