Введение к работе
Актуальность работы
Перспективным направлением биотехнологии является разработка электрохимических биосепсоров и экологически чистых источников электроэнергии (биотопливных элементов). При разработке таких систем широко используется способность некоторых соединений с обратимыми окислительно-восстановительными свойствами (медиаторов электронного транспорта) к быстрому переносу на электрод электронов, генерируемых ферментами или ферментными системами целых клеток микроорганизмов в процессе окисления субстратов.
Использование целых клеток микроорганизмов в качестве биокатализаторов по сравнению с ферментами имеет ряд преимуществ: микроорганизмы дешевле очищенных ферментов, что позволяет создавать недорогие приборы для экологического контроля и мониторинга биотехиологических процессов; микроорганизмы обладают каталитической активностью по отношению ко многим субстратам, что является преимуществом при экспресс-определении степени загрязнения водных объектов органическими соединениями (индекса биохимического потребления кислорода (БПК)); биосенсоры на основе целых клеток во многих случаях характеризуются повышенным сроком эксплуатации.
Способность микроорганизмов взаимодействовать с медиаторами электронного транспорта определяется доступностью ферментных систем для этих соединений. Известно, что уксуснокислые бактерии Gluconobacter имеют мембранную локализацию основных ферментов катаболизма углеводов и спиртов -PQQ-зависимых альдоз - и алкогольдегидрогепаз, что облегчает их взаимодействие с медиаторами электронного транспорта. Кроме того, различные штаммы бактерий Gluconobacter oxydans широко используются в качестве биокатализаторов во многих биотехнологических процессах получения пищевых и биологически активных соединений. Биохимической особенностью штамма Gluconobacter oxydans subsp. industrius BKM B-1280 является эффективное окисление этилового спирта, что можно использовать при разработке биосепсоров для экспресс-определения содержания этанола в биотехнологических средах.
Наиболее перспективными медиаторами при разработке биосенсоров являются соединения ферроценового ряда. Пара ферроцен - катион ферроцения представляет собой высоко обратимую окислительно-восстановительную систему. Ферроцены в сочетании с биокатализаторами на основе ферментов широко используют при разработке электрохимических биосенсоров, в то же время взаимодействие ферроценов с биокатализаторами на основе бактерий мало изучено. Представляется актуальным исследование закономерностей электрокаталитического окисления этанола целыми клетками бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius BKM B-1280 в сравнении с выделенной из них мембранной фракцией в присутствии медиаторов электронного транспорта ферроценового ряда как основы при разработке медиаторных биосенсоров.
Работа выполнялась в рамках проектов РНП.2.1.1.7789 (2006-2008 г.; ВП «Развитие научного потенциала высшей школы»), ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (2009-201 Зг.), госкоитракт № 02.740.11.0296, госкоитракт № П 551, РФФИ 09-03-97528 (2009 г.). Автор работы
является лауреатом стипендии Президента РФ на 2009/2010 учебный год, а также победителем конкурса Программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса», реализуемой Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в 2009 г. (г. Казань), госконтракт № 7282 р/10122.
Цель работы:
Выявление закономерностей электрокаталитического окисления этанола целыми клетками бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius BKM В-1280 и выделенной из них мембранной фракцией в присутствии медиаторов электронного транспорта ферроценового ряда как основы при разработке медиаторных биосенсоров.
Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
Охарактеризовать биокаталитические свойства бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius BKM B-1280 и ферментных фракций спектрофотометрическим методом.
Провести анализ кинетических параметров электрокаталитического окисления этанола ферментными системами бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius BKM B-1280 в присутствии медиаторов ферроценового ряда в рамках модели двухсубстратной ферментативной реакции, протекающей по механизму «пинг-понг».
Определить эффективность медиаторов электронного транспорта ферроценового ряда в реакциях электрокаталитического окисления этанола целыми клетками и мембранной фракцией бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius BKM B-1280 и выявить влияние заместителей ферроцена на медиаторные свойства соединений.
Разработать макет медиаторного биосенсора. Определить рабочие параметры функционирования (рН, концентрация солей буферного раствора, концентрация медиатора, масса биокатализатора на электроде) биосенсоров на основе медиаторов электронного транспорта ферроценового ряда.
Выявить спектр окисляемых субстратов мембранной фракцией бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius BKM B-1280 в присутствии медиаторов ферроценового ряда. Апробировать разработанный макет биосенсорного анализатора.
Научная новизна
Впервые проведен сравнительный анализ процессов электрокаталитического окисления этанола целыми клетками Gluconobacter oxydans subsp. industrius BKM B-1280 и выделенной из них мембранной фракцией в присутствии медиаторов электронного транспорта ферроценового ряда.
Установлено, что окисление в биоэлектрокаталитических системах «этанол -мембранная фракция или целые клетки бактерий Gluconobacter oxydans — медиаторы ферроценового ряда - электрод» можно рассматривать как двухсубстратную ферментативную реакцию, протекающую по механизму «пинг-понг», что обусловлено функционированием мембранлокализованных ферментов. Эта модель позволяет провести количественную оценку эффективности медиаторов электронного транспорта и биокатализаторов в медиаторных биосеисорах. Установлено, что мембранная фракция бактерий является более эффективным
катализатором в системах окисления этанола в присутствии медиаторов ферроценого ряда.
Впервые определены индексы эффективности медиаторов электронного транспорта ферроценового ряда в электрокаталитических системах окисления этанола на основе целых клеток уксуснокислых бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius ВКМ В-1280 и мембранной фракции этих бактерий, которые увеличиваются в ряду: 1,Г-ферроцсндикарбоновая кислота<этилфсрроцен<1,Г-диметилферроцен<ферроцен<1,Г-ферроцендиметанол<ферроценмонокарбоновая кислота. Показано, что эффективность медиаторов - производных ферроцена, зависит от электронных эффектов заместителей в циклопентадиенильных кольцах ферроцена: электропоакцепторные заместители увеличивают индекс эффективности медиатора, а электронодонорные - уменьшают.
Впервые показана возможность применения медиаторного биосенсора на основе биокатализатора - мембранной фракции бактерий для определения индекса БПК в отходах бродильных производств.
Практическая значимость работы
Выявленные в работе закономерности функционирования медиаторных биосенсоров на основе бактерий Gluconobacter oxydans и мембранной фракции бактерий могут быть использованы в качестве научной основы при разработке электрохимических биосенсоров для экологического контроля и мониторинга биотехнологических процессов.
Разработан макет биосенсорного анализатора на основе мембранной фракции бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius ВКМ B-1280 и медиатора ферроцена для экспресс-определения индекса БПК отходов бродильных производств. Полученные результаты показывают возможность применения действующего макета биосенсорного анализатора как прототипа опытных образцов приборов для серийного освоения и применения.
Результаты работы внедрены в учебный процесс: поставлены две новые лабораторные работы «Определение рабочих параметров функционирования микробного медиаторного биосеисора» и «Определение индекса БПК отходов спиртового производства с помощью биосенсора на основе ферроцена и мембранной фракции бактерий Gluconobacter oxydans» по курсам «Биосенсоры» и «Биотехнология защиты окружающей среды» для студентов специальностей 020100 Химия и 240901 Биотехнология.
Апробация работы и публикации
Результаты работы докладывались на Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» в 2007 г. и 2010 г. (диплом, медаль конкурса); Российской школе-конференции молодых ученых «Экогоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии», (Пущино) в 2006 г. (диплом лауреата конкурса) и 2009 г.; Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино), 2008 г. (диплом победителя); 2-ой Биотехнологической выставке-ярмарке «РосБиоТех - 2008 г.» (Москва), 2008 г. (диплом, медаль выставки); Международной конференции «Molecular and nanoscale systems for energy conversion (MEC-2007)» (Москва), 2007 г.; Международном конгрессе по аналитическим наукам «ICAS-2006» (Москва), 2006 г.; IV Международной научной конференции
«Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Томск), 2006 г.
По теме диссертации опубликовано 6 статей, 10 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций.
Структура и объем работы
