Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА 1.ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ И
АНТИОКСИДАНТЫ (обзор литературы) 14
Теоретические основы перекисного окисления липидов 14
Фракционный и жирно-кислотный состав липидов биомембран.... 20
Физико-химические закономерности окисления липидов в зависимости от состава 30
Методы контроля интенсивности перекисного окисления липидов. 37 Заключение по главе 1 40
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 42
Используемые модели липидов возрастающей сложности 42
Методика волюмометрических измерений 46
Расчет физико-химических параметров ПОЛ 48
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ГЛАВА 3. КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПЕРЕКИСНОГО
ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В ПРИСУТСТВИИ
АНТИОКСИДАНТОВ 53
Влияние фенолов на кинетику автоокисления метиллинолената, метиллинолеата в зависимости от концентрации и природы анти-оксидантов 53
Влияние скорости инициирования на кинетику окисления мети-лолеата, метиллинолеата, метиллинолената в зависимости от концентрации и природы фенолов 59
Влияние природы субстрата на эффективность антиоксидантов.... 81
Влияние тиосоединении и аминов на кинетику окисления метило-леата, метиллинолеата в зависимости от концентрации
антиоксидантов 86
Заключение по главе 3 92
ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ПРОДУКТОВ ПЕ-РЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ КРОВИ СПЕКТРОФО-ТОМЕТРИЧЕСКИМ И ФЛЮОРИМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДАМИ 95
Изменение спектров поглощения гептановых растворов липидов в зависимости от способа активации перекисного окисления и глубины окисления 95
Влияние эффективности экстракции на величину оптической плотности гептановых растворов липидов крови 104
Фотоколориметрический метод контроля концентрации липидов крови 113
Использование спектрофотометрического и флюориметрического
методов определения концентрации продуктов ПОЛ крови 117
Заключение по главе 4 121
ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ УСЛОВИЙ ПРИМЕНЕНИЯ КИНЕТИ
ЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ДЛЯ КОНТРОЛЯ АНТИОКСИДАНТ-
НОЙ И РАДИКАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИПИДОВ 123
Влияние добавок липидов на кинетические закономерности окисления гомогенного раствора метилолеата в зависимости от скорости инициирования, состава субстрата 124
Особенности кинетики окисления гетерогенных растворов метил-линолеата и этилолеата в зависимости от природы и концентрации антиоксидантов 134
Влияние а-токоферола и ионола на кинетику окисления эфиров.. 135
Характер действия некоторых тиосоединений и аминов на кинетику окисления эфиров 139
5.3. Возможности совместного использования физико-химических
способов контроля перекисного окисления липидов крови 146
Заключение по главе 5 157
ГЛАВА 6. АНАЛИЗ ИНФОРМАТИВНОСТИ, КОРРЕЛЯЦИОННОЙ
ЗАВИСИМОСТИ КИНЕТИЧЕСКИХ И ХИМИЧЕСКИХ ПАРА
МЕТРОВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ КРОВИ В
БИОЛОГИЧЕСКОМ ЭКСПЕРИМЕНТЕ 158
Изменение параметров при активации и угнетении перекисного окисления липидов крови при описторхозе, воздействии тетра-хлорметана 158
Влияние а-токоферола на параметры перекисного окисления липидов крови 166
Заключение по главе 6 170
ГЛАВА 7. ОСОБЕННОСТИ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ЗАКОНО
МЕРНОСТЕЙ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ КРО
ВИ В НОРМЕ И ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМАХ АКТИВАЦИИ 171
7.1. Влияние географических условий проживания на характер изме
нения параметров перекисного окисления липидов плазмы крови
в зависимости от возраста, длительности проживания 172
Особенности изменения параметров перекисного окисления липидов плазмы крови при пневмонии 175
Влияние артериальной гипертонии на параметры перекисного окисления липидов крови 182
Характер влияния гипертонической болезни на изменение параметров перекисного окисления липидов тромбоцитов, эритроцитов в зависимости от возраста, стадии заболевания, вида терапии... 190 Заключение по главе 7 201
ВЫВОДЫ 204
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 206
ПРИЛОЖЕНИЕ 250
Список сокращений
ПОЛ - перекисное окисление липидов
ЖК - жирные кислоты
ЖКС - жирно-кислотный состав
ВНЖК - высшие ненасыщенные жирные кислоты
RH - субстрат окисления
МО - метилолеат
МЛ - метиллинолеат
МЛН - метиллиноленат
ФЛ - фосфолипиды
ФХ - фосфотидилхолин
ФС - фосфотидилсерин
ФЭА - фосфатидилэтаноламин
СМ - сфингомиелин
ФИ - фосфатидилинозитолы
ФК - фосфатидные кислоты
ХС - холестерин
ЭХС - эфиры холестерина
АО - антиоксиданти
АОА - антиоксидантная активность
а-ТФ - а-токоферол
[InH] - ингибитор, обозначение АО в формулах расчета
кинетических параметров [InHJmin - минимально эффективная концентрация АО
W3 - экспериментальная скорость окисления
WT - теоретическая скорость окисления
W„ - начальная скорость окисления
Wj - скорость инициирования
т - период индукции, время достижения максимальной скорости
окисления
1Т - теоретический период индукции
тэ - экспериментальный период индукции
ФВР - фосфорно-ванилиновый реактив
ТБК - тиобарбитуровая кислота
ИБС - ишемическая болезнь сердца
МФО - 4,4 -димеркаптодифенилоксид
МФМ - 4,4 -димеркаптодифенилметан
Введение к работе
Повышение перекисного окисления липидов приводит к изменению морфо-функциональной структуры клеточных мембран, сопровождающемуся, как правило, снижением концентрации антиоксидантов, изменением фракционного и жирно-кислотного состава фосфолипидов, инактивацией и трансформацией ферментов [24,39,104,282]. Существующая взаимообусловленность между скоростью окисления и изменением состава липидов рассматривается как физико-химическая основа гомеостаза процесса перекисного окисления липидов [18,31,35,61].
Показана взаимосвязь между гемостазом и уровнем перекисного окисления липидов и доказана возможность взаимоусиления этих процессов. Большая роль в этом отводится антиоксидантам [17,35,38,41,58,66,74,85].
Преимущественным субстратом перекисного окисления липидов биомембран являются жирные кислоты, среди которых олеиновая, линолевая и линоленовая относятся к самым распространенным. Показано увеличение активности взаимодействия жирных кислот с активными формами кислорода при повышении степени ненасыщенности [87,296,402]. Однако, имеющиеся данные взаимодействия активных радикалов кислот с антиоксидантами носят противоречивый характер, отсутствуют системные исследования зависимости этого процесса от механизма и скорости инициирования окисления в липидах различной сложности. Для ос-токоферола установлена высокая антирадикальная активность в углеводородах, снижение активности и даже прооксидантныи эффект в липидных субстратах [32,33].
Низкая антиоксидантная активность ct-токоферола стимулирует поиск новых веществ или синергетических композиций в ряду природных или синтетических соединений [7,34,42,52,106,123,178,183]. Ограничивающим фактором в решении теоретических и практических вопросов регуляции процесса перекисного окисления липидов является несовершенство способов контроля протекания этого процесса. Данные об интенсивности перекисного окисления липидов биомембран базируются на исследовании концентрации сопряженных диенов, карбонильных соединений хемилюминесцентным или фотометрическим методами [95,96,115,128,142,145], отличающихся низкой корреляцией за счет использования для анализа разных субстратов, существенной зависимостью результатов от условий анализа и изменения количества исследуемых продуктов перекисного окисления липидов в результате метаболизма или в процессе выделения из объекта [62,156,218,221,240].
Установленная многофакторная зависимость процесса перекисного окисления липидов требует более детального изучения физико-химических закономерностей окисления жирно-кислотных компонентов липидов для расширения возможностей дезактивации процесса окисления в моделях липидов возрастающей сложности, выявления эффективных концентраций ан-тиоксидантов для использования их в клинической практике.
Цель работы:
Изучение механизма влияния природы антиоксидантов в системном исследовании физико - химических закономерностей перекисного окисления моделей липидов возрастающей сложности, для теоретического и экспериментального обоснования использования комплекса кинетических и химических параметров оценки перекисного окисления липидов.
Для достижения поставленной цели исследования необходимо было ре
шить следующие основные задачи: ^ 1... , q і. і/ с г, і f
1. Изучить современное состояние вопроса о влиянии различных факторов на физико - химические закономерности перекисного окисления липи-
дов и выбрать методы, позволяющие наиболее эффективно контролировать
этот процесс. /Цо<Л ^
(] 2. Провести отбор программного обеспечения для компьютерной об-
I
1 работки результатов анализа, моделирования механизма действия антиокси-
дантов и выявления корреляционной связи параметров перекисного окисления липидов.
Определить кинетические закономерности перекисного окисления гомогенных и микрогетерогенных растворов основных жирно - кислотных компонентов (метиловых эфиров олеиновой, линолевой, линоленовой кислот) волюмометрическим методом в зависимости от природы, концентрации антиоксидантов, скорости инициирования.
Оценить возможность использования волюмометрического метода и изучить условия для анализа кинетических параметров перекисного окис-
; ЛЄНИЯ ЛИПИДОВ КрОВИ.
Исследовать образование продуктов перекисного окисления жирно - кислотных компонентов липидов методами спектрофотометрии и флюори-метрии, изучить условия для анализа химических параметров перекисного окисления липидов крови.
Проанализировать чувствительность, информативность, корреляционную связь исследуемых параметров при активации и угнетении процесса перекисного окисления липидов плазмы крови, эритроцитов в биологическом эксперименте.
Изучить физико - химические закономерности перекисного окисления липидов крови в зависимости от различных факторов: возраста, пола, адаптации к новым условиям проживания, различных патологических со-
^ стояниях.
Научная новизна:
1. Впервые установлено, что а-токоферол при окислении гомогенных растворов метилолеата, метиллинолеата, метиллинолената проявляет высокую антиоксидантную активность (АОА) в узком интервале концентраций
(10-10 моль/л), который уменьшается с повышением степени ненасыщенности субстрата и увеличивается с повышением скорости инициирования. При концентрации а-токоферола более 10"6 моль/л в гомогенных и всех концентрациях в гетерогенных растворах проявляется его прооксидантная активность. Увеличение концентрации а-токоферола приводит к изменению характера кинетических кривых во всех окисляющихся субстратах.
Показано, что в природных липидах концентрация а-токоферола в 100-10000 раз превосходит концентрацию, необходимую для проявления высокой АОА.
Установлено, что ионол при окислении гомогенных растворов проявляет только АОА, величина которой зависит от концентрации и не зависит от скорости инициирования. Определена константа скорости реакции обрыва цепей на молекулах ионола в гомогенных растворах метилолеата, метилли-нолеата, метиллинолената и микрогетерогенном растворе метиллинолеата.
Исследованы кинетические закономерности окисления гомогенных растворов метиллинолеата, липидов эритроцитов, тромбоцитов и микрогетерогенных растворов метиллинолеата в присутствии тиолов ( капотен, 4,4 -димеркаптодифенилоксид, 4,4 -димеркаптодифенилметан), фенолов (а-нафтол, бис-ионол) и аминов (сантохин, коринфар, эмоксипин, ренитек). В микрогетерогенных растворах установлено повышение АОА, уменьшение скорости окисления с увеличением концентрации всех соединений, при этом для 4,4 -димеркаптодифенилоксида (МФО), 4,4 -димеркаптодифенилметана (МФМ) показано значительное усложнение характера кинетических кривых.
Впервые использован волюмометрический метод для оценки анти-оксидантной и радикальной активности липидов эритроцитов, тромбоцитов, плазмы крови, на основе установленного оптимального соотношения концентраций инициатора, антиоксидантов, липидов.
Определены эффективные условия экстракции липидов эритроцитов, плазмы крови 100-500- кратным избытком экстрагента (гептан-2-пропанол), позволяющие анализировать в одной пробе концентрацию про-
дуктов перекисного окисления спектрофотометрическим и концентрацию липидов флюориметрическим методами.
Предложена совокупность способов, определения физико-химических параметров перекисного окисления липидов в гептановом растворе. Установлена положительная корреляционная связь кинетических параметров с концентрацией липидов и противоречивый характер зависимости с химическими параметрами. Показан фазный характер изменения физико -химических параметров в зависимости от возраста, пола, способа и длительности активации или угнетения перекисного окисления липидов в эксперименте и клинике.
Изучен механизм действия антиоксидантов при окислении моделей липидов различной сложности, обоснован физико-химический смысл исследуемых параметров, выявлен индивидуальный характер изменения уровня перекисного окисления липидов крови при антиоксидантотерапии некоторыми препаратами.
Практическая значимость работы.
В процессе выполнения исследований разработаны:
Способ определения антиоксидантной активности липидов (авторское свидетельство № 1051428, 1983 г., соавторы - В.Н. Ушкалова, В.Е. Соловьев).
Способ выделения метилолеата из смеси метиловых эфиров жирных кислот оливкового масла (авторское свидетельство № 1162785, 1985г.- соавторы - В.Н. Ушкалова).
Способ определения продуктов перекисного окисления липидов крови (авторское свидетельство № 1303938, 1987г., соавторы - В.Н. Ушкалова).
Способ количественного определения липидов крови (рационализаторское предложение, № 80, 1990г., соавторы - В.Н. Ушкалова, С.Н. Ибрагимова).
Материалы исследований использованы для написания монографий:
« Контроль перекисного окисления липидов» (Новосибирск, 1993г., соавторы - В.Н. Ушкалова, Н.В. Иоанидис, З.М. Деева), «Свободнорадикальное окисление липидов в эксперименте и клинике» (Тюмень, 1997г., соавторы -В.Н. Ушкалова, Н.В. Иоанидис, З.М. Деева и др.). Внедрение результатов исследований.
Способы фотоколориметрического, флюориметрического, волюмомет-рического анализа продуктов перекисного окисления, антиоксидантной и радикальной активности липидов крови апробированы и внедрены в: практику НИИ клинической и профилактической кардиологии СО РАМН, г. Тюмень;
работу клинико-диагностических лабораторий первой и второй городских больниц г. Тюмени, ЦНИЛ Красноярской медицинской академии; научные исследования и учебный процесс кафедр биохимии, клинической фармакологии и патологической физиологии Тюменской государственной медицинской академии.
По материалам исследований написаны методические рекомендации «Анализ пероксидной активности липидов крови кинетическим и спектрофо-тометрическим методами», рекомендованы к использованию учебно-методическим кабинетом Минздрава Российской федерации (соавторы - В.Н. Ушкалова, Н.В. Иоанидис).
Апробация и публикации.
Основные положения диссертации доложены на Всесоюзной конференции «Проблема здоровья человека в Западно-Сибирском территориальном промышленном комплексе» (Тюмень, 1982г.), «Современные проблемы биоорганической химии» (Алма-Ата, 1984г.), «Фармакологическая коррекция гипоксических состояний» (Гродно, 1991), VI симпозиуме по биохимии липидов (Москва, 1992), IV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1997 г.), Всесоюзных конференциях «Биоантиоксидант» (Москва, 1992, 1993, 1998), Международной конференции «Фармация в XXI»
(Санкт-Петербург, 1999), Международном симпозиуме «Медицина и охрана здоровья» (Тюмень, 1996,1999, 2001),
По материалам диссертации опубликовано 41 печатная работа.
Объем и структура работы.
Диссертация изложена на 271 странице компьютерного текста, состоит из введения, семи глав, выводов, списка литературы, включающего 407 источников, из них 158 зарубежных авторов. Работа содержит 45 таблиц и 94 рисунка. В диссертации имеется приложение, в котором приведены список опубликованных научных работ автора, материалы, подтверждающие внедрение и новизну разработанных теоретических положений.
Основные положения, выносимые на защиту:
Действие а-токоферола на кинетику окисления метиллинолеата, ме-тиллинолената, метилолеата зависит от концентрации антиоксиданта, способа и скорости инициирования процесса, степени ненасыщенности субстрата окисления.
Антиоксидантная активность а-токоферола проявляется в интервале концентраций, определяемом скоростью инициирования и ненасыщенностью субстрата окисления.
Кинетические параметры и антиоксидантная активность ряда тйолов (капотен, МФМ, МФО), фенолов (ионол, а-нафтол, бис-ионол) и аминов (сантохин, эмоксипин, ренитек, коринфар), определяются их концентрацией, способом и скоростью инициирования ПОЛ.
Результаты определения концентрации сопряженных диеновых пе-роксидов, карбонильных соединений и концентрации липидов экстракционно - фотометрическим способом существенно зависят от условий анализа и эффективности экстракции.
Концентрация антиоксидантов и степень ненасыщенности субстрата, имеют базисное значение для проявления антиоксидантной и радикальной активности липидов.
6. Одновременное использование кинетических (скорость окисления, период индукции) и химических (концентрация сопряженных диенов, продуктов, реагирующих с ТБК и общих липидов) параметров окисления липидов в одном субстрате с большей достоверностью характеризует их взаимозависимость в условиях разных форм активации и угнетения перекисного окисления липидов крови.
![Влияние половых стероидов (этинилэстрадиола и левоноргестрела) на взаимодействие тромбин-фибриноген в кровотоке (экспериментальное исследование) [Электронный ресурс]](/i/i/4500/209024.png "Влияние половых стероидов (этинилэстрадиола и левоноргестрела) на взаимодействие тромбин-фибриноген в кровотоке (экспериментальное исследование) [Электронный ресурс] Матейкович Елена Александровна")