Содержание к диссертации
Введение
2. Антикоагулянты прямого действия (Обзор литературы) 8
2.1. Гепарин и гепариноиды 8
2.2. Гирудин и гирудиноиды 22
2.3. Пептидные ингибиторы самосборки фибрина 24
2.4. Ингибиторы агрегации тромбоцитов 29
2.4.1. GP ПЫШа-рецепторы тромбоцитов 29
2.4.2. Моноклональные антитела 33
2.4.3. Непептидные ингибиторы IIb/Ша-рецепторов тромбо-цитов 36
2.4.4. Пептидные ингибиторы IIb/Ша-рецепторов тромбоци- тов 38
3. Материалы и методы исследования 43
4. Собственные исследования 47
4.1. Выделение эффекторов свертывания из экстракта сапропеля 47
4.2. Действие эффекторов из сапропеля на плазмокоагуляцию 53
4.3. Влияние эффекторов из сапропеля на агрегационную функцию тромбоцитов 74
4.4. Противосвертывающее действие экстракта из сапропеляв опытах на животных 82
4.5. Токсикологическая характеристика экстракта фракции сапропеля 87
5. Заключение 94
6. Выводы 109
7. Список литературы 110
- Гепарин и гепариноиды
- Моноклональные антитела
- Выделение эффекторов свертывания из экстракта сапропеля
- Противосвертывающее действие экстракта из сапропеляв опытах на животных
Введение к работе
Система гемостаза выполняет в организме ряд жизненно важных функций - поддерживает кровь в жидком состоянии, препятствует тромбообразованию и блокаде микроциркуляции в органах, предотвращает кровоточивость и обеспечивает купирование уже развившихся геморрагии, несет ограничительную и защитную функции, препятствуя распространению из очагов поражения микрофлоры, а также гетеро- и аутотоксинов (Кузник Б.И., Скипетров В.П., 1974; Гаврилов O.K., 1981; Баркаган З.С., 1988; Зубаиров Д.М., 2000). Нарушения в этой системе предопределяют развитие геморрагии, тромбогеморрагий, ишемических изменений в органах Создают предрасположенность к тромбозам. Все эти нарушения, как известно, являются промежуточным звеном патогенеза многих заболеваний, характеризующихся повреждением внутренней выстилки сосудов, нарушением взаимодействия эндотелия с клетками крови и плазменными ферментными системами, сдвигами реологии крови.
Независимо от этиопатогенеза тромбоэмболических осложнений одним из средств их предупреждения и коррекции являются антикоагулянты, введением которых достигается либо угнетение синтеза про коагулянтов (антибиотики, цитостатики), либо ограничение по-стрибосомального формирования прокоагулянтов (антивитамины К).
Эти группы антикоагулянтов (антикоагулянты непрямого действия) используются для создания медленно развивающейся стабильной гипокоагулемии. Однако практическая медицина нуждается, как правило, в быстром эффекте, который обеспечивается антикоагулянтами прямого действия. Среди них чаще других применяется гепарин, отличающийся сильным, но кратковременным эффектом (Кудряшов Б.А., 1992). Хотя гепарин и является средством выбора, он отличается рядом недостатков. К важнейшим из них можно отнести способность
вызывать агрегацию тромбоцитов (Bertele е.а., 1983; Cimo, 1979) и тромбоцитопению (Ansell J., Deykin D., 1980; Borg J.Y. e.a., 1986). Известны данные и о существовании гепаринорезистентности (Баркаган З.С. и соавт., 1982; 1988). Нередко отмечаются тромбоэмболические осложнения после отмены гепарина, связанные с так называемым "эффектом бумеранга".
К числу применяемых антикоагулянтов прямого действия относятся гирудин и гирудиноиды, выделенные из тканей сосущих животных (Ена ЯМ., 1992) и обладающие антитромбиновым действием (Markwardt, 1985; Kaiser, Markwardt, 1988). Практического применения гирудин и его производные не нашли из-за сложной технологии получения и дороговизны (Баскова И.П., 1986; 1991).
В отношении ограничения агрегации тромбоцитов общая картина выглядит еще более удручающей, поскольку истинных эффекторов агрегации тромбоцитов, имеющих практическое применение, не существует, а применяемые антагонисты этой функции тромбоцитов помимо агрегации изменяют многие другие параметры систем организма (Бышевский А.Ш. и соавт., 1996). К ним прежде всего относится ацетилсалициловая кислота, которая необратимо ингибирует циклоок-сигеназу тромбоцитов (Jaffe, Weksler, 1979), синтез тромбоксана А2 и простациклина (Vane, 1971; Burch e.a., 1978; Fuster, Jang, 1994). Однако поскольку эндотелиальные клетки способны к регенерации циклоокси-геназы, ингибирующее действие аспирина на эндотелиальный проста-циклин кратковременно, а агрегация тромбоцитов может происходить даже в присутствие аспирина, поскольку он мало влияет на другие важные активаторы тромбоцитов типа тромбина и АДФ. В то же время длительное применение аспирина в высоких дозах вызывает негативные явления - образование желудочных язв, внутричерепные и желудочно-кишечные геморрагии и др. Из экстракта сапропелевых грязей выделены эффекторы свертывания крови, влияющие, как это показано ранее, (Чирятьев Е.А. и соавт., 2001; Чирятьев Е.А., Калинин Е.П., 2001) на плазменный и тромбоцитарный гемостаз. Однако эти исследования не затрагивали подробного исследования тромбоцитарного компонента свертывания крови, хотя известно, что фибриноген - ключевой субстрат заключи тельной фазы свертывания, участвует в процессах агрегации и адгезии тромбоцитов, взаимодействуя с рецепторами тромбоцитарных мембран (Панченко Е.П., 1997). Кроме этого, не исследовалось наличие токсичности в эксперименте (белые беспородные крысы) изучаемых эффекторов и недостаточно исследовано их влияние на основные функции организма. _ Учитывая выше сказанное, и принимая во внимание неограниченность сырьевых запасов сапропелей, представляется интересным их изучение, как альтернативных источников антикоагулянтов прямого действия.
Цель исследования - изучить основные механизмы ограничения процесса плазмокоагуляции очищенными фракциями экстракта С, в частности, перехода ФГ в ФБ. Установить механизм влияния фракций на ТЦ-гемостаз. Определить острую и хроническую токсичность экстракта из С при введении разных доз лабораторным животным.
Задачи исследования. 1. Разработать способ получения из С индивидуальных соединений с антикоагулянтной активностью. 2. Изучить их механизм действия на плазмокоагуляцию. 3. Изучить влияние эффекторов из С на агрегационную функцию ТЦ in vitro и in vivo. 4. Дать общую токсикологическую характеристику экстракта в эксперименте на лабораторных животных.
Научная новизна. Из С выделены два высокоочищенных соединения, ограничивающих гсмокоагуляцию. Впервые установлено что
эффекторы из С тормозят ВР при использовании плазмы, дефицитной по ф. II, что свидетельствует о их влиянии на заключительный этап каскада свертывания крови - превращение ФГ в ФБ под действием ТР. Установлено, что полученные эффекторы из С угнетают АДФ- и адреналин-индуцированную агрегацию ТЦ in vitro, причем механизмы ограничения агрегации ТЦ различаются между собой. Установлено, что при внутримышечном и внутрибрюшинном введении эффекторов лабораторным животным проявлений токсичности не наблюдается. Установлены минимальная эффективная доза и доза, составляющая LD50,
Практическая ценность. Разработан способ получения антикоагулянтов из сапропеля - дешевого сырья с неограниченными запасами, позволяющий получать индивидуальные эффекторы свертывания — в количествах, достаточных для их изучения в лабораторных условияхГ
Эффекторы из сапропеля способны эффективно ограничивать как плазменный, так и тромбоцитарный компоненты гемостаза in vivo и in vitro, и не обладают острой и хронической токсичностью в эксперименте, что обусловливает их ценность, как перспективных средств коррекции гемостаза.
Полученные данные могут быть использованы научными учреждениями, занимающимися проблемами свертывания крови и поиском новых средств воздействия на гемостаз. Основные положения, выносимые на защиту.
1. В сапропеле содержатся эффекторы свертывания крови, которые могут быть получены в индивидуальном виде.
2. Механизм ограничения плазмокоагуляции исследуемыми эффекторами отличен от механизма известных прямых антикоагулянтов и реализуется преимущественно на заключительном этапе свертывания крови - коагуляционном превращении фибриногена.
3. Эффекторы из сапропеля способны ингибировать агрегацию тромбоцитов при ее индуцировании растворами АДФ и адреналина.
4. Эффекторы из сапропеля не обладают острой и хронической токсичностью при внутримышечном и внутрибрюшинном введении лабораторным животным, и отличаются широким терапевтическим диапазоном действия.
Апробация и публикации. Материалы работы опубликованы в журналах: «Медицинская наука и образование Урала», «Медицинская наука и образование Урала и Сибири», «Современные наукоемкие технологии», «Успехи современного естествознания», опубликованы на сайтах РАЕ.
Объем и структура работы. Материалы исследования, включая указатель литературы, изложены на 147 страницах машинописного текста. В работе содержатся 30 рисунков, 1 схема и 13 таблиц: Диссертация состоит из введения, обзора литературы (представленным 120 отечественными и 235 зарубежными авторми), главы (содержащей 5 подразделов), в которой изложены результаты собственных исследований, заключения и выводов.
Гепарин и гепариноиды
История гепарина началась в первой четверти нашего века, когда в 1916 г. McLean в лаборатории Хоуэлла впервые обнаружил гепарин в печени собаки. Через 20 лет он был выделен в виде мукополиса-харида, состоящего из глюкуроновой кислоты и глюкозамина и применен в чистом виде в клинической медицине (Маркосян А.А., 1966; Botiger, 1987). С тех пор, как указывают Stein, Press (1984), масштабы применения гепарина «увеличились взрывоподобно». И, на сегодняшний день в условиях клиники предпочтение отдается гепарину (Азаро ва Л.А., 1990; Кириченко Л.Л., 1986; Browse е.а., 1988). Гепарин быстро начинает действовать и дает мощный антикоагулянтный эффект. При внутривенном введении гепарина эффект наступает практически моментально и продолжается в зависимости от дозы от 1 до 6 ч. При внутримышечном или подкожном введении максимум действия препарата отмечен через 20-40 мин, продолжительность действия находится в пределах 6-12 ч (Белоусов Ю.Б. и соавт., 1993; Мазур Н.М., 1988; Engelberg, Brown, 1983). Действие гепарина на свертывание крови можно назвать поливалентным, поскольку он влияет на все основные фазы свертывания крови (Бышевский А.Ш., 1986; Бышевский А.Ш., Кожевников В.А., 1987), а сам гепарин - практически универсальным антикоагулянтом (Чазов Е.И., Лакин К.М., 1977; Smith, Green, 1987). Считается, что собственно гепарин обладает слабыми антикоагулянт-ными свойствами, которые значительно усиливаются белком плазмы, прежде носившем название «кофактор гепарина», а затем - «антитромбин III» (Бычков СМ., 1981; Ферстрате М., 1981; Cockar е.а., 1987). Этот ингибитор тромбина в избыточном количестве присутствует в нормальной плазме. Взаимодействие гепарина с антитромбином III строго специфично. Гепарин, присоединяясь к лизиновым центрам антитромбина III, изменяет структуру этой молекулы и позволяет быстрее соединяться с активным центром тромбина, активированным фактором X (Ха) и другими серииовыми протеазами (активированные формы факторов свертывания IX, XI, XII, калликреин и плазмин) (Малиновский Н.Н., Козлов В.А., 1976; Girdwood, 1985; Thomas, 1981). Гепарин в комплексе с антитромбином Ш оказывает антитромбопласти-новое, антитромбиновое и антипротромбиновое влияние, тормозит переход фибриногена в фибрин, снижает ретракцию сгустка, усиливает фибринолиз, увеличивает так называемый Z-потенциал тромбоцитов (Чазов Е.И., Лакин К.М., 1977; Кудряшов Б.А., 1975; МасЫп, 1980). В последнее время многими авторами выявлен ряд неспецифических эффектов этого препарата на различные звенья биохимических процессов. Сюда можно отнести его ингибирующее действие в отношении се-ротоиииа и гистамина, активирующее действие на фосфолипазу А2 (Barrowchiffe е.а., 1988; Daves, 1983), способность тормозить активность пепсина и трипсина, щелочной и кислой фосфатазы, гиалурони-дазы (Meraihi е.а., 1989), стимулировать процесс разрушения атероген-ных липидов (Mahadoo, 1981), ингибировать синтез альдостерона (Гер-бильский А.В. и соавт., 1983: Jaques, 1985). Гепарин усиливает процесс перехода кислорода из крови в ткани, что может являться как мерой профилактики, так и лечения гипоксических состояний (Хомутов А.Е., Орлов Б.И., 1987; Engelberg, 1975; 1983). Он тормозит воспалительный процесс благодаря способности угнетать тканевой протеолиз и оказывать антитрипсиновое действие, а также угнетать фагоцитоз (Хомутов А.Е., Орлов Б.И., 1987). Гепарин стимулирует угнетенное дыхание, увеличивая легочную вентиляцию (Валиев Б.Н., Сабирова Р.С, 1980; Зубаиров Д.М., 1987), является стимулятором адаптационных механизмов организма (Выгорская Я.И., Воробель А.В., 1975; Папонов В.Д. и соавт., 1985; Хомутов А.Е., Орлов Б.И., 1987). Многие из этих сторон влияния гепарина могли бы найти самостоятельное использование в клинической практике, но сильно превалирующий эффект угнетения свертываемости крови ограничивает возможность нестандартного применения традиционных препаратов антикоагулянта (Ефимов B.C., Румянцева А.Г., 1992).
Назначение гепарина показано при инфаркте миокарда, тромбозах и эмболиях легочной артерии, тромбозах периферических артерий, флеботромбозах и тромбофлебитах, тромбозах сосудов почек, селезенки, мезентериальных сосудов, тромбозах вен сетчатки, а также для устранения синдрома ДВС (Лычев В.Г., 1993), при остром, затянувшемся и хроническом гломерулонефрите, острых отравлениях уксусной кислотой, барбитуратами, комплексном лечении пневмонии и ряда других заболеваний (Валиев Б.Н. и соавт., 1980; Раби К., 1974; Нетяженко В.З. и соавт., 1982).
Однако, по мере накопления научных и практических данных о гепарине, постепенно появилась сдержанность в оценке его лечебных возможностей. Оказалось, что в природе нет гепарина строго определенного состава, а существует смесь моно-, ди- и трисернокислых эфи-ров гепарина. Гетерогенность гепарина определяется различной длиной цепи повторяющихся субъединиц дисахарида и проявляется поли-дисперсностыо молекулы с широким диапазоном молекулярной массы (обычно между 9 и 15, а иногда даже 4 и 40 кДа (Мазаев А.В., Саргин К.Е., 1986; Stein, Press, 1984). Химическая структура гепарина до сих пор однозначно не определена, из коммерческого гепарина, произведенного для продажи, с помощью методов биохимической очистки, например электрофореза, хроматографии методом молекулярного сита, можно выделить более 100 различных компонентов (Мазаев А.В., Саргин К.Е., 1986; Ефимов B.C., Румянцева А.Г., 1992). По-видимому, с указанной химической гетерогенностью связан ряд побочных эффектов и неудач при применении гепарина в клинической практике.
Самым опасным и наиболее распространенным побочным эффектом гепарина являются кровотечения, которые могут возникать из эрозирующих язв, травматических повреждений и хирургических ран, в местах внутрисосудистых инъекций (Ефимов B.C., Румянцева А.Г., 1992; Віск, 1985). Вместе с тем, даже при введении малых (профилактических) доз гепарина геморрагии возникают у 5-10% больных, при применении больших доз - в 10-30% случаев (Frohlish е.а., 1988).
LINK2 Моноклональные антитела LINK2 Прежде, чем перейти к этой части обзора литературы, необхо-димо отметить следующее. Адгезия тромбоцитов и последующая агрегация активированных тромбоцитов - важные процессы в формировании окклюзирующих тромбов, которое является одной из главных причин сердечно-сосудистых и цереброваскулярных нарушений типа нестабильной стенокардии, инфаркта миокарда, реокклюзии после рева-скуляризационной терапии и ишемических приступов и т.д. (Turner е. а., 1995; Coller, 1997; Sandercock, 1997). В то же время современная медицина не располагает средствами фармакологической коррекции гемостаза, избирательно ограничивающими процесс адгезии и агрегации тромбоцитов, т.е. антиагрегантами. Чаще всего, так называемые «тромбоцитактивные» средства оказывают влияние и на сосудистую стенку, и на состояние других клеток крови, активность которых вторично отражается на функциях тромбоцитов (Wehmeier, Schneider, 1989). Так, Аспирин - широко используемый антитромбоцитарный препарат способен сократить риск артериального тромбоза при состояниях типа постоянной ишемии и ишемическом приступе (Sandercock, 1997). Однако, большое количество больных не реагирует на терапию аспирином (Grotemeyer е.а., 1993; Schulman е.а., 1996) из-за ограничен ного антиагрегантного действия, достигнутого ингибированием цикло-оксигеназного пути (Patrono, 1994).
Формирование тромба инициализируется связыванием фибриногена с гликопротеидом ПЬ/Ша, который является заключительным общим этапом агрегации тромбоцитов при действии всех известных агонистов (Phillips е.а., 1988; Coller, 1995). Поэтому антагонисты гли-копротеида ПЬ/Ша, являются потенциально наиболее полезным терапевтическим инструментом для лечения тромботических осложнений, и в последние годы процесс создания и изучения антиагрегантов, направленных на этот этап агрегации, резко активизировался. В настоящее время он идет преимущественно по трем основным направлениям:-!— Ограничение агрегации посредством моноклональных антител" против GP ИЬ/Ша-рецепторов тромбоцитов; 2. Исследование непептидных прямых ингибиторов ИЬ/Ша-рецепторов; 3. Создание пептидных антиагрегантных препаратов на основе RGD-последовательности.
В 1983 г. Coller е.a. (Coller е.а., 1983) впервые показали, что мышиные моноклональные антитела против GP ПЬ/Ша-рецепторов тромбоцитов ингибируют связывание фибриногена с тромбоцитами и тем самым блокируют агрегацию тромбоцитов. В настоящее время созданы «химерные антитела», состоящие из Fab-фрагментов мышиных антител к Ilb/IIIa и константного участка иммуноглобулина чело-века, получившие название СІ0Е5 и с7ЕЗ. Оказалось, что " І-СІ0Е5 связываются почти одинаково быстро как с покоящимися, так и с акти-вированными тромбоцитами, в то время, как " 1-с7ЕЗ слабо взаимодействуют с покоящимися тромбоцитами и намного сильнее с активированными (Coller, 1985). При введении животным или человеку с7ЕЗ ингибирует АДФ-индуцируемую агрегацию тромбоцитов и удлиняет время кровотечения (Gold е.а., 1990). На их основе создан препараты «ReoPro» и «Abciximab» (Coller, 1985), проходящие клинические испытания. При внутривенном введении болюсом с7ЕЗ больным с нестабильной стенокардией отмечалось увеличение времени кровотечения (но не развитие спонтанного кровотечения), нормализующееся через 24 ч; обратимое уменьшение деблокированных GP НЬ/Ша-рецепторов; уменьшение АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов и компенсируемое уменьшение общего числа тромбоцитов (Gold е.а., 1990, Berkowitz е.а., 1997).
Как показали более подробные клинические наблюдения, у больных с нестабильной стенокардией, подвергшихся коронарной баллонной ангиопластике, и получавших дополнительно к аспирину и гепарину с7ЕЗ, реже развивались инфаркт миокарда и другие тромботи-ческие_осложнения (CAPTURE-Study, 1997)ги-ситуациигтребовавшие повторной ангиопластики и др. (EPIC Investigation, 1994). В то же время, у больных, получавших с7ЕЗ-антитела, чаще встречались геморрагические изменения, преимущественно в местах пункций сосудов (EPIC Investigation, 1994), но меньше была смертность (на 35%) и реже возникала необходимость инвазивного вмешательства на коронарных артериях (Topol е.a., 1994., Ferguson, 1996). Несомненным достоинством этих препаратов является возможность и снижения и коррекции по весу больного дозы гепарина, обладающего рядом побочных эффектов (тромбоцитопения, эффект бумеранга и т.д. (Баркаган З.С., 1993, Lincoff с.а., 1997; EPILOG Investigators, 1997; Liem е.а., 1997).
Kleiman N.S. (Kleiman е.а., 1993) в 1993 г опубликовали результаты исследований по клиническому применению других мышиных антител ш7ЕЗ Fab у больных с острым инфарктом миокарда после тромболитической терапии тканевым активатором плазминогена совместно с аспирином и гепарином. Они убедительно показали, что т7ЕЗ подавляли функцию тромбоцитов (результаты лечения в опытной группе больных почти на 50% превосходили таковые в контрольной) без изменения количества геморрагических осложнений. Исследователи констатируют перспективность краткосрочного парэнтерального применения вышеуказанных антител в клинической практике в случаях угрозы тромбообразоваиия и тромбоцитопении (Schror, 1995), однако внедрение требует дальнейших исследований, связанных с дозами препаратов, а также тем, что эти препараты являются синтетическими человеческо-мышиными белками, а это может повлечь за собой иммунный ответ (Leung. е.а,1998; Liem е.а., 1997).
Выделение эффекторов свертывания из экстракта сапропеля
Для выделения эффекторов свертывания крови мы воспользовались способом, предложенным Е.А. Чирятьевым и соавт., (2001) в нашей модификации. Первичный экстракт из сапропеля мы получали настаиванием цельного сапропеля с дистиллированной воды в соотношении 1:3 при постоянном перемешивании в течение 3 ч. Смесь оставляли для отстаивания на 2 суток и отделяли надосадок. Для полноты извлечения - эту операцию повторяли еще 2 раза. Объединенный экстракт экстракт упаривали в 10 раз с помощью ротационного испарителя под вакуумом при температуре 48-50С и твердые частицы удаляли центифугирова-пием (10 000 g, 30 мин). Для освобождения от солей концентрированный экстракт диализовали против дистиллированной воды через гид-ратцеллюлозную мембрану Т-100 в соотношении 1:150 в течение суток. Диализирующуюся фракцию концентрировали на кипящей водяной бане до получения вязкой массы и разбавляли ее водой дистиллированной в соотношении 1:3.
Для определения количества эффекторов мы стандартизовали реакцию взаимодействия тромбина с фибриногеном, используя для этой цели 0,1 мл раствора коммерческого фибриногена (4 мг/мл) и 0,1 мл раствора тромбина (активность 15 с) в 0,05 М Трис-HCl буферном растворе (рН 7,6) и 0,1 мл Трис-HCl буфера. Определяли время образования фибринового сгустка (контроль). В опыте вместо 0,1 мл Трис-НС1 буфера вносили равный объем эффектора.
Основываясь на ранее полученных данных о термостабильности эффекторов из сапропеля (Н.В. Яковлева, 1998), концентрат подвергали заморозке при -20С в течение 24 ч с последующей размороз кой под струей водопроводной воды (18 - 20С). При этом выпадает хлопьевидный осадок, легко отделяемый центрифугированием (3 000 g, 30 мин). Осадок высушивали, растворяли в минимальном объеме Трис-НС1 буфера (0,05 М, рН 7,6) и определяли влияние полученного раствора на время свертывания фибриногена тромбином. При этом инги-биторной активности обнаружено не было. Известно, что водные экстракты из сапропеля содержат гуматы и свободные гуминовые кислоты (И.Д. Комиссаров, Л.Ф. Логинов, 1971), от которых невозможно было освободиться вышеописанными приемами. Поэтому следующей задачей стояло разработка приема раз деления носителей ингибиторов свертывания и примесей - производ _ ных-пуминовых-кислот. " " Данные литературы свидетельствуют, что гуматы из водных растворов осаждаются сульфатом аммония (И.Д. Комиссаров, Л.Ф. Логинов, 1971). Поэтому мы прибегли к их высаливанию данным реактивом.
Для этого к полученной нами фракции сапропеля на холоду (ледяная баня) добавляли насыщенный раствор сульфата аммония. При этом наблюдали выпадение осадка гуминовых кислот, наличие которых подтверждается качественной реакцией (при добавлении 1Н серной кислоты и нагревании до кипения выпадает хлопьевидный осадок), проведенной после центрифугирования и растворения осадка в дистиллированной воде. Одновременно, нами получены сведения, что гуминовые кислоты не обладают антикоагулянтной активностью (растворы гуминовых кислот не изменяют ни время рекальцификации, ни реакцию взаимодействия тромбина с фибриногеном). Наименьшая степень насыщения сульфатом аммония фракции экстракта (40%), при которой гуминовые кислоты начинают выпадать в осадок, соответствует значению рН 7,25. В связи с этим, получаемый нами концентрат фракции сапропеля приводили к рН 7,25 (исходное значение рН концентрата 5,31), создавали 50% насыщение сульфатом аммония и образующийся осадок гуминовых кислот отделяли центрифугированием. Получаемый надосадок концентрировали в 2 раза выпариванием на водяной бане, создавая таким образом 100% насыщение сульфата аммония. Выпадающий при этом осадок также удаляли центрифугированием.
Получаемый нами раствор с антикоагулянтной активностью содержал значительное количество солей (сульфат аммония), поэтому следующим этапом явилась разработка способа отделения этой соли от антикоагулянта. Общепринятым и простейшим приемом обессоливапия являет ся.диализ, однако в нашем-случае он-оказался-не пригодным:-как соли, так и значительная часть (до 70%) носителя ингибиторной активности оказались в диализирующей жидкости. Другой известный прием - хроматография на колонке с сефадексом - хотя и была эффективной, но сопровождалась большой (до 95%) потерей антикоагулянтной активности.
Поскольку носители ингибиторной активности хорошо растворимы в этиловом спирте (Калинин Е.П., 2000), а используемая для высаливания соль в спирте не растворима, мы прибегли к способу замены растворителя. Для этого к раствору, содержащему эффекторы и сульфат аммония, прибавляли равное количество 96% этанола, экспонировали при температуре -4С в течение 30 мин и удаляли выпавший осадок солей центрифугированием. Водно-спиртовую смесь упаривали (до появления кристаллов соли) и повторяли указанную операцию. Полученный раствор выпаривали на водяной бане и сухой остаток растворяли в 96%) этаноле. Смесь выдерживали на холоду (-4С, 30 мин) и выпавшую в осадок оставшуюся соль удаляли. Этанол отгоняли, а сухой остаток, содержащий эффекторы, растворяли в 0,14 М растворе хлорида натрия и определяли их содержание и присутствие сульфатов пробой с бария хлоридом. Содержание эффекторов составило на 56% меньше от исходной, но примесь гуминовых кислот отсутствовала полностью.
Далее мы подвергли очищенный концентрат фракции экстракта из сапропеля гель-фильтрации на колонке с Сефадексом G-25 (10x300 мм, элюент - 0,075 М аммонийно-ацетатный буферный раствор, объем фракций - 2 мл, внешний объем колонки - 15 мл, скорость протока - 1 мл/мин) (рис. 1). Во фракциях элюата определяли ингибиторную активность
Противосвертывающее действие экстракта из сапропеляв опытах на животных
Настоящую часть работы начали с уточнения эффективной, но не вызывающей кровоточивости, дозы экстракта. Животным вводили раствор экстракта (объединенные фракции I и II) внутривенно в яремную вену (контрольным животным - соответствующие объемы 0,85% раствора хлорида натрия) в дозах 5, 10, 30, 50 мг/кг массы. Пробы крови отбирали из аналогичной вены противоположной стороны через 30 мин, 1, 3, 6, 9, 12, 24 и 36 ч, оценивая антикоагулянтную активность экстракта по его влиянию на неактивированное время рекальцифика-ции, тромбиновое и протромбиновое время. Результаты влияния экс-тракта на показатели гемокоагуляции представлены в таблице 6Т
Из данных таблицы видно, что при введении животным изотонического раствора хлорида натрия существенных изменений показателей гемокоагуляции на протяжении 36 ч не наблюдается.
Внутривенное введение экстракта в дозе 5 мг/кг массы приводило к подавлению системы гемокоагуляции в течение 2-х часов, с последующей нормализацией ее активности. Так, время рекальцифика-ции через 30 мин после инъекции раствора экстракта увеличивается на 10%, протромбиновое время - на 3% , тромбиновое время - на 15%, а через 1 ч - на 14, 13 и 18% соответственно.
Введение экстракта в дозе 10 мг/кг привело к более интенсивному росту отличий в показателях гемокоагуляции, уже через 30 мин время рекальцификации увеличилось на 24,7%), протромбиновое время - на 21,6%, тромбиновое время - на 18,3%, а через 1 ч - на 41, 30,1, 26,6% соответственно. В течение 6 часов свертывающая активность остается подавленной по тесту "время рекальцификации" - на 35,9%, "протромбиновое время" - на 15,9%), "тромбиновое время" - на 12,6%). В последующие часы гипокоагулемия уменьшается, хотя достоверные отличия от контроля выявляются и через 9 часов после введения экстракта (таблица 6).
Введение экстракта в дозах 30 и 50 мг/кг массы привело к еще более интенсивному росту отличий в показателях гемокоагуляции. Через 1 ч свертывающая активность по тесту "время рекальцификации" подавлена соответственно на 116 и 284%, через 3 ч - показатели остаются приблизительно прежними, через 6 ч - на 52,8 и 193,8%, через 12 ч - на 8,5 и 50,4%. Выраженная гипокоагулемия сохраняется и через 24 ч после введения экстракта в дозе 50 мг/кг (время рекальцификации остается увеличенным на 24,3%). Тромбиновое время через 1 ч после введения экстракта увеличилось на 75,1 и 164,2%, через 3 ч - на 73,4 и Л60%, через-6-ч-- на-24,2-и 12054%гчерез-1-2-ч-- на-3,7 и 9,2% соответ ственно.
Через 24 ч тромбиновое время остается увеличенным только после инъекции экстракта в дозе 50 мг/кг массы тела (на 7%). Показатель "протромбиновое время" также подвергается значительным изменениям после введения экстракта в дозах 30 и 50 мг/кг массы. Так, через 1 ч протромбиновое время увеличивается на 112,8 и 230,7%) соответственно, через 3 ч - показатели приблизительно прежние, через 6 ч - на 31,2 и 159,5%, через 12 ч - на 5,2 и 12,8%. Изменение показателя "протромбиновое время" через 24 ч наблюдается только после введения экстракта в дозе 50 мг/кг массы, он увеличен на 7,4%. Независимо от использованных доз, через 36 ч от момента введения экстракта происходит нормализация изучаемых показателей. Таблица 6
Считается, что эффективной дозой прямых антикоагулянтов должна быть такая доза, которая удлиняет время рекальцификации в 1,5-3 раза. В нашем случае это 10-50 мг/кг массы тела. В экспериментах следующей серии мы изучали состояние ге-мокоагуляции в течение 14 дней при ежедневном однократном введении экстракта и отборе проб крови.
Экстракт вводили внутривенно в дозе 50 мг/кг массы (экстракт вводили в 8-9 ч утра, кровь отбирали через 6 ч после введения экстракта, для отбора проб крови на каждом этапе опыта использовалась отдельная группа животных). Данные представлены в таблице 7.
