Введение к работе
Актуальность темы. Обеспечение различных видов движений у живых организмов, включая человека, является одной из наиболее важных белковых функций - двигательной. Эта функция ярко проявляется сокращением различных видов мышц, а также способностями у подавляющего большинства клеток к изменениям своей формы и движению в различных средах, окружающих эти клетки [Зенгбуш П. 1982; Поглазов Б.Ф., Левицкий Д.И. 1982; Schiaffino S., Reggiani, С. 1996; Шишкин С.С. с соавт 2004; Murphy D.A., Courtneidge S.A. 2011 и др.]. К настоящему времени, благодаря многолетним усилиям биохимиков, а также ученых смежных специальностей накоплен большой объем сведений о белках человека, как непосредственно участвующих в мышечном сокращении, так и о тех белках, которые обеспечивают клеточную подвижность. В частности, в ходе исследований по международному проекту «Геном человека» было установлено, что у человека имеется, как минимум, 376 так называемых моторных генов («motor»), непосредственно обеспечивающих двигательные функции, а также 1453 гена, кодирующих цитоскелетные белки и белки клеточной адгезии, которые имеют прямое отношение к клеточной подвижности [Venter С.J. et al. 2001]. Соответственно, для системного изучения белков указанных групп во многих странах ведутся работы по созданию и поддерживанию специальных информационных ресурсов, предназначенных для обеспечения разнообразных биомедицинских исследований. В этом отношении на фоне информационных ресурсов, созданных например, в Ирландии (UCD-2DPAGE, ) и в Индии («Human Proteinpedia», ), достижения отечественных исследователей выглядят пока весьма скромными.
С началом постгеномной эры в биохимии для изучения белков человека, непосредственно участвующих в мышечном сокращении, активно привлекаются протеомные технологии [Шишкин С.С. с соавт 2004; Urbonavicius S. et al. 2009; Gelfi С. et al. 2011 и др.]. Как объекты для протеомного изучения мышечные ткани и органы, содержащие по массе существенную часть белков организма человека, представляют значительный интерес по ряду причин. Известно, что при формировании и функционировании мышечных тканей и органов происходят закономерные изменения генной экспрессии, которые находят отражение в так называемых белковых профилях и протеомный анализ позволяет прецизионно характеризовать эти процессы [Торро S. et al. 2003; Urbich С. et al. 2011]. Существует достаточно много заболеваний мышечных тканей и органов, и протеомные исследования открывают путь к выяснению патогенеза этих заболеваний, а также способствуют выявлению диагностически значимых молекулярных маркеров [De Palma S. et al. 2006; Celegato B. et al. 2006; Polkinghorne V.R. et al. 2009; Pilop С et al. 2009]. В связи с различиями в дифференцировке мышечных клеток и особенностями морфологии мышечных органов, включая отдельные скелетные мышцы, с помощью протеомных технологий создаются условия для поиска ткане- и органо-специфичных белков, среди которых могут находиться новые белковые изоформы или новые белки [Schessl J et al. 2008; Jedrychowski M.P. et al. 2010; Hammer E. et al. 2011].
Протеомные технологии активно применяются также для изучения различных белков человека, обеспечивающих клеточную подвижность, в отношении клеток с различными ти-
пами дифференцировки, а также клеток злокачественных опухолей, в связи с тем, что в основе и инвазивности, и метастазирования лежат особые нарушения клеточной подвижности, в которых принимают участие ряд актин-связьшающих белков (АСБ), а также цитоскелетные и мембранные белки [Weaver A.M. 2008; Albiges-Rizo С. et al. 2009; Shankar J. et al. 2010]. Выявление таких нарушений, с одной стороны, открывает пути к развитию представлений о молекулярных основах раковой трансформации клеток и роли в этом определенных представителей (изоформ) различных белковых семейств [Giubellino A. et al. 2007; Albiges-Rizo С. et al. 2009 и др.], а с другой, может расширить список потенциальных биомаркеров опухолевых заболеваний. Например, в качестве биомаркеров рака простаты изучаются некоторые изо-формы семейства Р-тимозинов, относящегося с АСБ, и семейства аннексинов, участвующих в обеспечении взаимодействий цитоскелетных и мембранных белков [Hutchinson L.M. et al. 2005; Schostak M. et al. 2009]. Интерес к последним (с учётом того, что простата рассматривается как мышечно-эпителиальный орган) обусловлен весьма интенсивным ростом заболеваемости раком простаты в России (2 место в структуре онкопатологии у мужчин) [Чиссов В.И. с соавт. 2011]. ив ряде стран Запада. На особую актуальность подобных исследований указывает целый ряд авторов, подчеркивая существующие потребности в надежных молекулярных маркерах рака простаты [Stamey ТА. et al. 2004; Allioli N. et al. 2011 и др.].
Цель и задачи исследования. Основной целью данной диссертационной работы стало сравнительное протеомное изучение некоторых белков человека, участвующих в обеспечении двигательных функций, создание отечественного биоинформационного ресурса о белках скелетных мышц, а также поиск потенциальных биомаркеров миогенеза и малигнизации. В соответствии с целью исследования в работе решались следующие задачи:
Провести протеомное изучение мажорных белков в образцах скелетной мышцы человека и использовать полученные результаты для создания соответствующего биоинформационного ресурса, оформленного как отдельный модуль для отечественной базы данных «Про-теомика мышечных белков человека».
Провести сравнительное изучение отдельных групп белков в различных биоматериалах (биоптатах и аутоптатах некоторых мышечных тканей и органов, а также в культивируемых клетках) и оценить проявления полиморфизма этих белков.
Изучить средне- и низкокопийные ядерные белки в культивируемых нормальных мышечных клетках человека с использованием предварительного выделения ядер и с применением протеомных методов.
Построить 3D-модели протеомного распределения гистонов и провести сравнительных анализ их микрогетерогенности в культивируемых клетках, включая клетки злокачественных и доброкачественных опухолей простаты.
Провести с помощью протеомных методов поиск потенциальных белковых био маркеров рака простаты в культивируемых клетках человека.
Научная новизна работы. Сформирован новый биоинформационный модуль в отечественную базу данных «Протеомика мышечных белков человека» на основе протеомного изучения 89 «мажорных» белков из биоптатов и аутоптатов т. vastus lateralis человека.
Установлено, что в культивируемых скелетномышечных миобластах человека присутствует новый белковый продукт гена кальдесмона (CALD1), который по результатам проте-омного анализа обладает меньшей молекулярной массой по сравнению с известными изо-формами кальдесмона человека.
При сравнительном протеомном анализе трех препаратов ядерных белков (суммарные ядерные белки, гистоны, постгистоновые ядерные белки) полученных из культивируемых мышечных клеток человека, а также из некоторых опухолевых клеток, удалось выявить ряд средне- и низкокопийных белков. Построены новые ЗБ-модели протеомного распределения гистонов, которые свидетельствуют о микрогетерогенности этих белков, вероятно, связанной с изменениями пролиферативного потенциала изученных клеток.
Научно-практическая значимость работы. Созданная двумерная карта белков скелетной мышцы человека стала основой для формирования биоинформационного модуля «Белки скелетных мышц». Подготовлены методические рекомендации по применению компьютерных программ из пакета ImageMaster 2D Platinum, версий 6 и 7 («GE Healthcare») для решения задач, связанных с анализом распределения белковых фракций на двумерных электрофо-реграммах.
Показано, что серпин HI (белковый продукт гена SERPINH1) можно рассматривать как потенциальный биомаркер опухолей эпителиального генеза по результатам сравнительного протеомного анализа белков клеточных линий, моделирующих рак и гиперплазию простаты.
Апробация работы. Материалы данной работы докладывались на международных и российских конференциях, в том числе: Конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы лучевой диагностики и онкологии» (Москва, 2008), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), I международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Москва, 2010), V Российского симпозиума «Белки и пептиды». (Петрозаводск, 2011) и др.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, включая 5 статей в профильных рецензируемых российских и международных журналах (из них 1 в зарубежной печати), 2 статьи в сборниках, 1 информационно-методическое письмо и 7 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 126 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа содержит 12 таблиц и 25 рисунков, а также приложение «Методические разработки по проведению компьютерного анализа изображений двумерных электрофореграмм с помощью специализированного пакета программ ImageMaster 2D Platinum версии 6 и 7 («GE Healthcare»)».
