Введение к работе
Актуальность проблемы. Зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein - GFP), GFP-подобные флуоресцентные белки (ФБ) и их мутантные варианты стали популярными инструментами в клеточной биологии, биотехнологии и биомедицине для мечения белков, клеточных компартментов, клеток и тканей, в качестве маркеров, позволяющих следить за экспрессией белков, их локализацией, подвижностью и взаимодействиями. На основе ФБ созданы сенсоры на ионы Са2+, Cu2+, Zn2+, СГ, а также Н202, сАМР, активность клеточных киназ, протеаз, GTP-аз. Применение ФБ внесло огромный вклад в развитие методик, используемых в биомедицине для изучения молекулярных механизмов множества заболеваний, включая такие как рак, нарушения связанные с генными дефектами и т.д.
В большинстве случаев, практическое применение флуоресцентных белков требует разработки мономерных мутантных вариантов с эмиссией в дальне-красной области спектра, обладающих высоким квантовым выходом, высокой скоростью созревания хромофора и фотостабильностью. До. сих пор нет ясности относительно молекулярного механизма формирования хромофора и роли его аминокислотного окружения в проявлении спектральных свойств флуорофора. В этой связи, важно понять каким образом особенности стереохимии белка определяют его основные свойства, включая характеристики цветового спектра и установить ключевые остатки ответственные за формирование структуры мономера и олигомеризацию белка. Эти знания необходимы для разработки рационального подхода по созданию улучшенных вариантов белков, удовлетворяющих требуемым критериям. Фундаментальный и прикладной интерес для
1 \ і
дальнейшего развития этой области представляет детальное изучение пространственных структур новых флуорофоров и молекулярных процессов их посттрансляционной модификации с целью создания структурной основы для направленного воздействия на их фотофизические свойства.
Объекты настоящего исследования, зелёный (zGFP506), жёлтый (zYFP538) и красный (zRFP574) флуоресцентные белки (231 остаток; -26-27 kDa) из морского бутончатого полипа рода Zoanthus характеризуются хромофоробразующими последовательностями Asn-Tyr-Gly, Lys-Tyr-GIy, Asp-Tyr-Gly и резко отличающимися спектральными характеристиками с максимумами возбуждения/эмиссии 492/506 нм, 528/538 нм, 553/574 нм соответственно (Рис. 1). При общей величине -78% идентичности аминокислотных последовательностей выбранные белки являются прекрасными моделями для выявления стереохимических факторов, ответственных за переход от "зелёного" к "жёлтому" и затем к "красному" излучающим состояниям. Они обладают уникальными фотофизическими свойствами и их мономерные варианты были бы широко востребованы для технологий многоцветного мечения и резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).
a b с а е
Рис. 1 Кристаллы ZRFP574 дикого типа (a), zGFP506 дикого типа (Ь) и
мутантного варианта zGFP506 N66D в переходной "зеленой" (с) и зрелой "красной" (d) формах и ZYFP538 дикого типа (е)
Цели и задачи исследования. Целью настоящей диссертационной работы являются создание структурной базы для исследования
взаимосвязи между структурами и свойствами у серии флуоресцентных белков из морского бутончатого полипа рода Zoanthus. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Разработать условия получения монокристаллов серии
флуоресцентных белков, пригодных для рентгеноструктурного анализа и
получить экспериментальные наборы рентгеновских данных.
2. Установить на атомном уровне пространственные структуры красного
(zRFP574), зелёного (zGFP506) и жёлтого (zYFP538) флуоресцентных
белков из Zoanthus, а также генно-инженерного варианта zGFP506 с
заменой Asn66Asp (zGFP506_N66D) в переходной "зелёной" и зрелой
"красной" формах.
3. Провести детальный анализ структур хромофоров и
хромофорсодержащих областей и установить стереохимические
причины, ответственные за развитие посттрансляционной модификации
за пределы "зеленой" формы у zRFP574 и zYFP538.
4. На основе полученной структурной базы провести сравнительное
исследование пространственной организации функциональных
тетрамеров изучаемых объектов и составляющих их мономерных
субъединиц. Исследовать структурные аспекты, ответственные за
олигомеризацию и на этой основе внести предложения по генно-
инженерному дизайну мономерных вариантов.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые на атомном уровне установлены пространственные структуры красного zRFP574 и зелёного ZGFP506 флуоресцентных белков из Zoanthus, а также мутантного варианта zGFP506_N66D в двух флуоресцентных формах.
Открыт новый процесс посттрансляционной модификации хромофора у zRFP574, который, в отличие от всех известных флуоресцентных белков, завершается декарбоксилированием боковой цепи первого остатка хромофоробразующей последовательности Asp66. На основе стереохимического анализа хромофорсодержащих областей в zRFP574 и целенаправленно выбранных ближайших гомологов, zGFP506 и zGFP506_N66D, выявлен стереохимический фактор, инициирующий дополнительную цепь реакций, приводящую к декарбоксилированию Asp66 хромофора.
Определена пространственная структура желтого флуоресцентного белка zYFP538 с высоким разрешением 1.8А. На основе полученных структурных данных и спектральных характеристик целенаправленно сконструированной серии мутантов zYFP538 установлен инициирующий фактор дополнительной посттрансляционной стадии перехода от промежуточной "зелёной" к конечной "желтой" форме хромофора.
Изучены стереохимические факторы, ответственные за олигомеризацию исследуемых белков.
Полученные в настоящей работе результаты вносят вклад в создание общей структурной базы для изучения механизмов формирования хромофоров и разработки соответствующих мономерных вариантов флуоресцентных белков для технологий многоцветного мечения и резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).
Апробация полученных данных и публикации. Результаты диссертационной работы были представлены на VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю. А. Овчинникова (г. Москва-Пущино, октябрь 2006г.), III Российском Симпозиуме "Белки и Пептиды" (г. Пущино, сентябрь 2007 г.), XVIII Менделеевском Съезде по
общей и прикладной химии (г. Москва, сентябрь 2007 г.), Конференции "Флуоресцентные белки и биологические сенсоры" (г. Ашбурн, октябрь 2007г). По материалам диссертации опубликованы 3 печатные работы в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России. Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (одна глава), изложения и обсуждения результатов (пять глав), экспериментальной части (одна глава), выводов и списка цитируемой литературы, включающего 95 ссылок. Работа изложена на 96 страницах, содержит 29 рисунков и 8 таблиц.
