Содержание к диссертации
Введение
1. CLASS Обзор литератур CLASS ы 9
1.1. Нейтрофил в защитных реакциях организма 9
1.1.1. Пути активации нейтрофила 9
1.1.2. Гранулярный аппарат нейтрофилов 12
1.1.3. Респираторный взрыв 14
1.1.4. Миграция активированных нейтрофилов 14
1.1.5. Фагоцитоз 16
1.2. Кислород-зависимые механизмы инактивации микробов нейтрофилами 17
1.2.1. Активные формы кислорода 17
1.2.2. МПО-система 20
1.3. Кислород-независимые механизмы инактивации микробов нейтрофилами 26
1.3.1. Катионные антимикробные пептиды 26
1.3.2. Лизоцим 28
1.3.3. Серпроцидины 34
1.3.4. Лактоферрин 38
1.4. Кооперативные взаимодействия антимикробных белков нейтрофилов 44
2. Методы исследования 48
2.1. Получение биологического материала 48
2.3.1. Получение экссудата 48
2.1.1. Получение кишечного сока 48
2.2. Выделение антимикробных белков из нейтрофилов экссудата собаки 48
2.2.1. Экстракция катионных белков из целых лейкоцитарных клеток 48
2.2.2. Ионообменная хроматография 49
2.2.3. Гель-фильтрационная хроматография 49
2.3. Электрофоретические методы 50
2.3.1. Электрофорез в кислой буферной системе 50
2.3.2. Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия 50
2.4. Секвенирование N-концевого фрагмента белков 51
2.5. Определение молекулярной массы белков 51
2.6 Определение углеводного компонента в белках 52
2.7. Спектрофотометрические исследования 55
2.7.1. Определение степени чистоты миелопероксидазы 55
2.7.2. Определение степени насыщения ЛФ железом 55
2.7.3. Установление спектров поглощения ЛФ и МПО в видимой области . 55
2.8. Изучение связывания ЛФ с железом 55
2.8.1. Получение апоЛФ 55
2.8.2. Получение холоЛФ 55
2.8.3. Диссоциация комплекса ЛФ-железо 56
2.9. Определение активности ферментов 56
2.9.1. Определение пероксидазной активности 56
2.9.2. Определение эстеразной активности эластазы 57
2.9.3. Определение эстеразной активности катепсина G 58
2.9.4. Определение активности лизоцима 59
2.9.5. Ингибиторный анализ 59
2.10. Иммунохимические исследования 60
2.10.1. Получение антисывороток к белкам 60
2.10.2. Выделение из сыворотки фракции белков, обогащенной иммуноглобулинами, методом высаливания 60
2.10.3. Иммуноаффинная хроматография 60
2.10.4. Конъюгация антител с пероксидазой хрена 61
2.10.5. Твердофазный иммуноферментный анализ 62
2.11. Определение антимикробной активности белков 64
2.12. Статистическая обработка результатов 66
3. Результаты исследования 67
3.1. Выделение антимикробных белков из нейтрофилов собаки 67
3.2. Определение N-концевой аминокислотной последовательности белков 70
3.3. Физико-химические свойства белков 77
3.3.1. Молекулярная масса белков 77
3.3.2. Определение углеводного компонента в белках 77
3.3.3. Спектрофотометрические исследования 78
3.3.4. Связывание ЛФ с железом 78
3.4. Энзимологические исследования 78
3.4.1. МПО 78
3.4.2. Эластазаи катепсин G 83
3.4.3. Лизоцим 87
3.5. Иммунохимические исследования 87
3.6. Изучение антимикробной активности белков 90
3.6.1. Определение минимальной ингибирующей концентрации белков 90
3.6.2. Изучение кооперативных взаимодействий белков 90
3.6.3. Изучение ферментативной активности белков в присутствии других белков 98
4. Обсуждение результатов 100
4.1. Выделение антимикробных белков 100
4.2. Свойства выделенных белков 102
4.3. Иммунохимические исследования 107
4.4. Антимикробная активность белков 108
5. Выводы 117
6. Список литературы 119
- Миграция активированных нейтрофилов
- Определение молекулярной массы белков
- Выделение из сыворотки фракции белков, обогащенной иммуноглобулинами, методом высаливания
- Иммунохимические исследования
Введение к работе
Актуальность проблемы
Выживание всех видов животных в среде, изобилующей потенциально патогенными микроорганизмами, стало возможным только благодаря формированию у них в процессе эволюции механизмов, обеспечивающих невосприимчивость к инфекционным болезням (иммунитет).
В настоящее время принято выделять системы врожденного и приобретенного (клонального) иммунитета. В работах прошлых лет использовали как синонимичные данным понятия неспецифического и специфического (или адаптивного) иммунитета, однако в последнее время эта терминология мало употребляема. Термин "приобретенный иммунитет" подразумевает формирование ("приобретение") в онтогенезе (в процессе соматической рекомбинации) генетических структур, отсутствовавших в половых клетках. Очевидно, что из двух рассматриваемых систем иммунитета, эводюционно более древней является система врожденного иммунитета. Также она первой появляется в онтогенезе и первой вступает в действие при проникновении инфекции в организм, поэтому о ней часто говорят как о первой линии защиты. Ряд эффекторных механизмов врожденного иммунитета были адаптированы в ходе эволюции системой приобретенного иммунитета.
Двумя основными способами защиты организма от инфекции являются поглощение микробных клеток путем фагоцитоза и выделение антимикробных веществ во внеклеточную среду организма, зараженную патогеном. У млекопитающих нейтрофилы (нейтрофильные гранулоциты, полиморфноядерные лейкоциты) способны выполнять функцию защиты организма обоими указанными способами. Нейтрофилы могут быть мобилизованы как системой врожденного, так и системой приобретенного иммунитета.
Теория, объясняющая морфофизиологические предпосылки формирования фагоцитарной функции клеток в эволюции, была разработана Мечниковым еще в позапрошлом веке (Мечников, 1892). Защитная функция фагоцитов возникла на основе способности простейших поглощать и инактивировать бактерии, используемые ими как объект питания. Таким образом, уже на заре развития животных перед ними стояла задача инактивации потенциально патогенных микроорганизмов, являющихся для них источником пластических веществ и энергии.
Помимо нейтрофилов, к профессиональным фагоцитам млекопитающих относятся моноциты и их тканевые формы - макрофаги, а также эозинофилы. Эти
клетки объединены в единый функциональный тип благодаря наличию у них ряда общих структурно-метаболических свойств и стереотипности поведения в фагоцитарном процессе. Морфобиохимическая специализация фагоцитов заключается в наличии у них развитого гранулярного аппарата, являющегося депо физиологически активных веществ антибиотического действия. Среди фагоцитов именно нейтрофилы играют ключевую роль в защите организма от инфекции. Об их огромной роли свидетельствуют некоторые количественные данные. Общий вес нейтрофилов у одного человека составляет около 1,5 кг (Siminiak et а!., 1995). В костном мозге 55-60% клеток являются предшественниками нейтрофилов (Bainton, 1999).
Функционирование нейтрофила в организме не исчерпывается лишь поглощением и умерщвлением микробной клетки, нейтрофил активно взаимодействует с другими компонентами иммунной системы и участвует в поддержании гомеостаза в самом широком смысле. Тем не менее, основное внимание исследователей привлекает именно микробоцидная функция нейтрофила, и особенно ее молекулярные основы. Изучение молекулярных механизмов микробоцидной функции нейтрофила представляет несомненный фундаментальный интерес и может быть полезно в прикладных целях, в частности в медицинской области.
Для понимания механизмов каких-либо явлений очень важную роль играют сравнительно-биохимческие исследования. Обнаруженное в таких исследованиях сходство позволяет делать вывод об универсальности тех или иных механизмов, и, следовательно, об их высокой функциональной значимости. Найденные различия, например, в структуре молекул, дают возможность судить о взаимосвязи структуры и функции, приводя таким образом к более глубокому пониманию механизмов. В лаборатории химии белка Санкт-Петербургского государственного университета уже на протяжении многих лет ведутся сравнительно-биохимические работы по изучению антимикробных белков и пептидов, являющихся компонентами гранулярного аппарата нейтрофилов.
Выбранный в данной работе объект исследования - нейтрофилы собаки -представляет интерес поскольку к настоящему времени ни один представитель отряда хищных не получил комплексную характеристику в отношении молекулярных факторов нейтрофилов, обеспечивающих защиту от инфекции. Между тем, представители этого отряда, в том числе и собака, являются традиционными объектами во многих областях биологических исследований, в первую очередь в физиологии. Поэтому изучение молекулярных основ иммунитета собаки
7 представляется важной задачей. Гранулярный аппарат нейтрофилов млекопитающих содержит целый ряд белков, выполняющих антимикробную функцию -миелопероксидаза, лактоферрин, эластаза, катепсин G, лизоцим (Кокряков, 1999; Levy, 1996; Elsbach et al., 1999). У собаки из перечисленных белков детально охарактеризована только миелопероксидаза (Agner, 1958; Ehrenberg, Agner, 1958; Harrison et al., 1977).
Несмотря на то, что свойства указанных белков, в частности, антимикробное действие, хорошо изучены для белков человека и других млекопитающих, малоизученными остаются механизмы их совместного действия на микробы, которое имеет место в естественных условиях. Между тем, антимикробная активность белка может существенно возрастать в присутствии других белков. Изучение кооперативного действия антимикробных белков несомненно является актуальной проблемой, требующей повышенного внимания.
Цели и задачи исследования
Целью работы явилось проведение сравнительного исследования молекулярных факторов нейтрофилов собаки и человека, обеспечивающих защиту от инфекции. Для выполнения цели были поставлены следующие задачи:
Совершенствование методической базы, обеспечивающей проведение сравнительных исследований антимикробных белков нейтрофилов разных видов животных, включая методы выделения белков, характеристики основных физико-химических и энзиматических (для ферментов) свойств, исследования антимикробной активности белков.
Выделение, очистка и характеристика свойств миелопероксидазы, лактоферрина, эластазы, катепсина G и лизоцим а из нейтрофилов собаки и человека.
3. Разработка тест-систем для количественного определения
миелопероксидазы и лактоферрина собаки методом иммуноферментного анализа,
измерение содержания указанных белков в биологических жидкостях собаки.
4. Изучение антимикробных свойств анализируемых белков, включая их
кооперативное действие на бактерии.
Научная новизна работы
В настоящей работе предложен ряд методических подходов для проведения сравнительных исследований антимикробных белков нейтрофилов. В частности, впервые описано одновременное выделение пяти белков (МПО, ЛФ, эластаза,
8 катепсин G, лизоцим) с использованием катионного детергента ЦТАБ в качестве экстрагирующего агента. Предложено использование ресазурина в опытах по определению антимикробной активности кооперативных систем белков.
Впервые выделен и охарактеризован по ряду физико-химических свойств ЛФ из нейтрофилов собаки.
Показано различие эластазы собаки и человека по константе Михаэлиса в реакции гидролиза синтетического субстрата (NBA).
Впервые разработаны системы иммуноферментного анализа для определения МПО и ЛФ собаки. Установлено наличие ЛФ в молоке собаки.
Показан сложный немонотонный характер зависимости антимикробной активности миелопероксидазной системы от концентрации МПО.
Впервые определены некоторые сочетания белков, проявляющие синергический эффект при совместном действии на бактерии in vitro. Показан синергизм действия миелопероксидазной системы и аполактоферрина по отношению к грамотрицательным бактериям, а также хололактоферрина и лизоцима. Впервые установлено, что МПО, помимо хорошо изученного ферментативного механизма, может проявлять свою антимикробную активность с помощью неферментативиому механизму, вступая в кооперативные взаимодействия с катепсином G и лизоцимом.
Основные положения, выносимые на защиту
Антимикробные белки нейтрофилов собаки (МПО, ЛФ, эластаза, катепсин G, лизоцим) сходны по основным физико-химическим и энзиматическим свойствам с гомологичными белками человека. Эластаза собаки отличается от эластазы человека по константе Михаэлиса в реакции гидролиза синтетического субстрата (NBA).
МПО, ЛФ, эластаза, катепсин G, лизоцим собаки и человека сходны по своим антимикробным свойствам.
При совместном действии на бактерии антимикробные белки нейтрофилов вступают в кооперативные взаимодействия, которые в ряде случаев носят синергический характер. Наблюдаемые эффекты в основном сходны для белков собаки и человека, за исключением эластазы собаки, которая проявляет синергические эффекты при кооперации с катепсином G и лизоцимом, в отличие от эластазы человека.
Миграция активированных нейтрофилов
Одним из стереотипных проявлений функциональной готовности клеток к фагоцитозу является состояние их обмена веществ, получившее в литературе название респираторного (дыхательного) взрыва (Baldridge, Gerard, 1933; Klebanoff, Clark, 1978). Термин отражает скоротечность и интенсивность мобилизации энергетических и пластических ресурсов нейтрофилами в ответ на стимуляцию разнообразными по химической природе соединениями: хемоаттрактантами, опсонинами, поверхностно-активными веществами (McPhail, Snyderman, 1984; Sandborg, Smolen, 1988). Респираторный взрыв характеризуется триадой признаков: усилением поглощения кислорода, повышенной утилизацией глюкозы через фосфоглкжонатный (пентозофосфатный) путь, гиперпродукцией активных форм кислорода (перекиси водорода Н2О2, супероксидного радикала Ог, сикглетного кислорода ]СЬ). Потребление кислорода нейтрофилами увеличивается в 50-100 раз. Специфичность дыхания нейтрофилов заключается в том, что кислород в данном случае используется не в качестве конечного акцептора митохондриальной цепи переноса электронов, а с целью генерации химически активных производных, обладающих сильным антибиотическим действием (Кокряков и др., 1981). Респираторный взрыв обычно сопутствует фагоцитозу, и генерируемые оксиданты оказываются внутри фагосомной вакуоли, хотя в начале фагоцитарного процесса они выбрасываются во внеклеточное пространство (Babior et al., 1973). В настоящее время установлено, что большая часть поглощаемого нейтрофилами кислорода восстанавливается до супероксидного радикала НАДФН-оксидазой. В ходе респираторного взрыва в нейтрофиле происходит сопряжение механизмов окисления НАДФН (НАДФН-оксидаза) и восстановления НАДФ+ (пентозофосфатный путь) с образованием активных форм кислорода.
Важным этапом реализации фагоцитарной функции нейтрофилов является их направленное движение (хемотаксис) к объекту фагоцитоза. Хемотаксис отражает способность клетки активно перемещаться в направлении стимулирующих агентов (хемоаттрактантов). Необходимое условие для направленного движения - градиент концентрации хемоаттрактанта. Хемоаттрактанты, равномерно распределенные в среде, усиливают ненаправленное амебоидное движение и скорость перемещения клеток по поверхности. Такая стимуляция получила название хемокинез (Маянский А., Маянский Д., 1989). Хемоаттрактанты представляют собой самые разнообразные соединения: бактериальные продукты (например, N-формилметионилпептиды), производное системы комплемента (С5а), секретируемые продукты стимулированного метаболизма фосфолипидов (фактор активации тромбоцитов, лейкотриен В4 и др.), большое число хемотаксических цитокинов и хемокинов (Uhing, Snyderman, 1999). В качестве хемоаттрактантов могут выступать и некоторые антимикробные белки и пептиды нейтрофилов (серпроцидины, дефенсины).
Нейтрофилы способны активно выходить из кровеносного русла в экстравазальное пространство на уровне венул и капилляров. Эта способность играет важную роль в участии нейтрофилов в защитных реакциях организма, позволяя им мигрировать в самые различные ткани и органы, пораженные бактериями. Миграция нейтрофилов в очаги воспаления включает три этапа (McEver, 1992):
1) Нейтрофилы прикрепляются к эндотелию и катятся вдоль стенки сосуда в результате адгезивных взаимодействий, опосредованных селектинами - белками, представленными на поверхности как нейтрофилов, так и эндотелиальных клеток.
2) Прикрепление нейтрофилов к эндотелиальным клеткам и взаимодействие их с некоторыми хемоаттрактантами способствуют экспрессии на поверхности нейтрофилов других адгезивных белков - интегринов. Взаимодействие интегринов с соответствующими эндотелиальными рецепторами приводит к более прочной адгезии и задержке нейтрофилов на эндотелии.
3) После задержки на эндотелии нейтрофилы мигрируют в субэндотелиальное пространство.
Переход с первого этапа на второй опосредован частичной дегрануляцией нейтрофилов - происходит экспрессия на поверхности клетки интегринов, а также рецепторов некоторых хемоаттрактантов, хранящихся в специфических и желатиназных гранулах (Simon et al., 1995). В регуляцию миграции нейтрофилов вовлечены высвобождаемые в процессе дегрануляции сиалидаза и эластаза (Nathan et al., 1993). Они вызывают отщепление поверхностного сиалопротеина CD43, что уменьшает отрицательный заряд нейтрофила, способствуя более прочному его прикреплению к эндотелию. Также эластаза и другие протеолитические ферменты (коллагеназа, желатиназа, катепсин G) участвуют в деградации внеклеточного матрикса, облегчая миграцию нейтрофилов через эндотелий (Sakata et al., 1989). Компоненты базальной мембраны (коллаген, ламинин, эластин), расщепляемые протеиназами лейкоцитов, становятся дополнительным источником хемоаттрактантов. 1.1.5. Фагоцитоз
Фагоцитоз является основной функцией нейтрофила, обеспечивающей защиту организма от инфекции. На этом этапе происходит опосредованное рецепторами связывание микробной клетки с ее последующим поглощением и инактивацией.
Для запуска фагоцитоза нейтрофил должен получить сигналы двух типов: во-первых, его поверхностные рецепторы должны распознать объект фагоцитоза, во-вторых, клетка должна находиться в адекватном функциональном состоянии, т. е. быть активирована. Стимуляция цитотоксических ответов происходит под действием тех же веществ, которые индуцируют миграционные ответы лейкоцитов (т. е. рассмотренных в п. 1.1.4 как хемоатграктанты), но в дозах на порядок более высоких (Uhing, Snyderman, 1999).
Две основные группы рецепторов, распознающих объект фагоцитоза, - рецепторы иммуноглобулинов класса G (FcyR) (Anderson et al., 1990) и рецепторы компонентов комплемента (CR1, CR3) (Ross, Lambris, 1982; Wright et al., 1983). Последние представляют собой (32-интегрины, участвующие также в адгезивных взаимодействиях (п. 1.1.4). Также имеются данные об участии в фагоцитозе FcaR (Weisbart et al., 1988) и pl-интегринов (Isberg, Leong, 1990). В фагоцитозе макрофагов принимает участие ряд рецепторов, которые, по-видимому, не экспрессируются на нейтрофилах.
Различают опсоническое и неопсоническое распознавание объекта фагоцитоза (Greenberg, 1999). Неопсоническое распознавание представляет собой связывание немодифицированных эпитопов на поверхности микробных клеток. При опсоническом распознавании рецепторы взаимодействуют с опсонинами - веществами, вырабатываемыми самим организмом и связывающимися с микробными клетками, стимулируя их связывание и/или поглощение фагоцитами. Опсонинами являются иммуноглобулины - взаимодействуют с Fc-рецепторами нейтрофилов, компоненты комплемента - СЗЬ, C3d, C4b - с CR1 и CR3. Опсонинами для макрофагов также выступают белок сурфактанта А и MBL - они связываются с общим рецептором, который также способен взаимодействовать с Clq компонентом комплемента (Nepomuceno et al., 1997). Непосредственно распознают микробные эпитопы (т. е. действуют неопсонически) pi-интегрины, а также маннозные рецепторы макрофагов. Помимо опсонического распознавания, CR3 участвует и в неопсоническом, связывая ЛПС оболочки грамотрицательных бактерий (Wright, Jong, 1986).
После включения сигнала фагоцитоза происходит поглощение микробной клетки путем эндоцитоза с образованием фагосомной вакуоли (фагосомы). Завершенность фагоцитоза, предполагающая инактивацию и умерщвление микроорганизмов, обеспечивается слиянием лизосомоподобных гранул нейтрофила с фагосомой, в результате чего микроорганизмы подвергается воздействию антимикробных белков и пептидов, хранящихся в гранулах (Кокряков, 1999). На первом этапе, по всей видимости, происходит собственно умерщвление микроба, затем, после понижения рН, начинают работать кислые гидролазы, переваривающие инактивированный микроб, но сами по себе не обладающие микробоцидной активностью. Среди молекулярных механизмов, участвующих в инактивации и умерщвлении микробов, принято выделять кислород-зависимые и кислород-независимые механизмы (Klebanoff, Clark, 1978). Рассмотрению этих двух типов механизмов посвящены главы 1.2 и 1.3. При этом особое внимание уделено веществам, являющимися предметом исследования данной диссертации.
Определение молекулярной массы белков
Ионообменную хроматографию проводили на колонке 25x2,4 см с КМ-целлюлозой СМ-52 ("Whatman", Англия), уравновешенной 0,05 М натрий-ацетатным буфером (рН 4,5), содержащим 0,05 М NaCI. Процедуры подготовки ионообменника, заполнения колонки, нанесения пробы, элюции проводили с учетом рекомендаций, изложенных в инструкции производителя матрицы и в руководстве Остермана (Остерман, 1985). Элюцию белков осуществляли 0,05 М натрий-ацетатным буфером (рН 4,5) с различным содержанием NaCI (0,1 М; 0,2 М; линейным градиентом концентрации NaCI 0,2-1,2 М) со скоростью 20 мл/ч. За ходом элюции следили фотометрически, измеряя оптическую плотность фракций при длине волны 280 нм (спектрофотометр Beckman DU50). Нанесение пробы и элюцию проводили при +4С.
Гель-фильтрацию проводили на колонке с сефадексом G-150 (для проб, содержащих МПО или ЛФ) или на колонке с сефадексом G-75 (для проб, не содержащих указанных белков) ("Pharmacia", Швеция). Процедуры подготовки матрицы, заполнения колонки, нанесения пробы, элюции проводили с учетом рекомендаций, изложенных в инструкции производителя матрицы и в руководстве Остермана (Остерман, 1985). Использовали колонки размером 75x2,5 см (сефадекс G-150) и 69x2,5 см (сефадекс G-75). Колонку уравновешивали 0,05 М натрий-ацетатным буфером, рН 4,5, содержащим 1 М NaCI. Пробы перед нанесением на колонку концентрировали до объема 3-5 мл на аппарате для ультрафильтрации ("Amicon", Голландия) на фильтре с номинальной отсекаемой молекулярной массой 10 кДа (YM-10) под давлением азота 4-5 атмосфер при +4С. При этом происходила очистка проб от компонентов с молекулярной массой менее 10 кДа. Элюцию белков осуществляли тем же буфером, которым была уравновешена колонка, со скоростью 16 мл/ч. За ходом элюции следили фотометрически, измеряя оптическую плотность фракций при длине волны 280 нм (спектрофотометр Beckman DU50). Нанесение пробы и элюцию проводили при +4 С
Спектр белков в различных фракциях, а также гомогенность полученных препаратов оценивали методом электрофореза в ПААГ в кислой буферной системе по методу Паньима и Челкли (Panyim, Chalkley, 1969). Гель готовили с концентрацией акриламида 12,5%, мочевины - 6,25 М. Для получения геля растворяли 2,4 г мочевины в 3,9 мл НгО, добавляли 1,17 мл раствора, содержащего
60% (вес/объем) акриламида и 1,5% (вес/объем) ї,М -метиленбисакршіамида в Н2О, затем добавляли 0,34 мл ледяной уксусной кислоты, 0,04 мл ТЕМЕД, 0,15 мл свежеприготовленного раствора 10% ПСА в НгО. Полимеризацию проводили в течение 1,5 ч при комнатной температуре.
Электрофорез проводили в пластинах толщиной 0,75 мм в приборе "Hoefer" (США). В качестве электродного буфера использовали 0,9 М раствор уксусной кислоты, рН 2,2. Преэлектрофореэ и электрофорез проводили при напряжении 150-170 В в течение 1-1,5 ч (-20 В на 1 см длины геля). В лунку вносили 1-3 мкг белка (на каждую полосу) в 15 мкл раствора для проб. Раствор для проб содержал З М мочевину и 5% уксусную кислоту. Для визуального наблюдения за ходом электрофореза в раствор для проб добавлялся метиловый зеленый.
Гели после электрофореза окрашивали в растворе 0,1% кумасси бриллиантового синего G250 в 25% изопропаноле и 7% уксусной кислоте в течение 30 минут. Несвязавшийся краситель отмывали в растворе 5% уксусной кислоты.
Молекулярную массу белков, а также гомогенность препаратов определяли электрофорезом в ПААГ в денатурирующих условиях в присутствии ДС-Na по методу Шаггера и Фон Джагова (Schagger, Von Jagow, 1987). Концентрация акриламида в геле составляла 16%, при определении молекулярной массы МПО и ЛФ - 8%. Раствор акриламида содержал 48% (вес/объем) акриламида и 1,5% (вес/объем) НК -метиленбисакриламида в НгО. Буфер для гелей представлял собой 0,3% раствор ДС-Na в З М трис-HCl буфере, рН 8,45. Для получения разделяющего геля смешивали 2,5 мл раствора акриламида, 2,5 мл буфера для гелей, 2,5 мл НгО, 0,95 мл глицерина, 0,004 мл ТЕМЕД, 0,04 мл свежеприготовленного раствора 10% ПСА в Н2О. При приготовлении геля для определения молекулярной массы МПО и ЛФ объем раствора акриламида составлял 1,25 мл, а НгО - 3,75 мл. Полимеризацию геля проводили в течение 1-1,5 ч при комнатной температуре. Для получения концентрирующего геля смешивали 0,25 мл раствора акриламида, 0,78 мл буфера для гелей, 2,1 мл НгО, 0,004 мл ТЕМЕД, 0,04 мл свежеприготовленного раствора 10% ПСА в НгО. Полимеризацию проводили в течение 3 ч при комнатной температуре.
Раствор для проб содержал 2% ДС-Na, 40 мМ дитиотреитол, 7% глицерин в 55 мМ трис-HCl буфере, рН 8,83. Перед проведением электрофореза пробы выдерживали в растворе для проб при +100С на водяной бане в течение 5 минут. Препараты сериновых протеиназ предварительно инкубировали с 0,5 М PMSF в течение 20 часов при комнатной температуре.
Катодный буфер содержал 0,1% ДС-Na, 0,1 М трис, ОД М трицин, рН 8,25. Анодный буфер содержал 0,2 М трис, рН 8,9 (доводили НС1). Электрофорез проводили в пластинах толщиной 0,75 мм в приборе "Hoefer" (США); сила тока - 30 мА на гель, длительность - 1,5-2 ч. В лунку вносили 1-3 мкг белка (на каждую полосу) в 15 мкл раствора для проб. Для визуального наблюдения за ходом электрофореза в раствор для проб добавляли 0,5 мкл раствора бромфенолового синего в смеси метанола и глицерина 1:1.
Гели после электрофореза окрашивали в растворе 0,1% кумасси бриллиантового синего G250 в 25% метаноле и 5,5% формалине в течение 20 минут. Несвязавшийся краситель отмывали в растворе 5% уксусной кислоты.
Аминокислотную последовательность N-концевого участка белков определяли методом автоматической деградации по Эдману. Секвенирование проводилось в Научно-Учебном Центре Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова (Москва) под руководством к. х. н. Т. В. Овчинниковой.
Молекулярную массу белков определяли двумя методами: электрофорезом в ПААГ в присутствии ДС-Na и гель-фильтрацией.
Электрофорез и гель-фильтрацию проводили как описано в п.п. 2.3.2 и 2.2.3. Для определения молекулярной массы использовали калибровочные наборы белков с известной молекулярной массой. Набор для электрофореза содержал а-лактальбумин (14,4 кДа), ингибитор трипсина (20,1 кДа), карбангидразу (30 кДа), овальбумин (45 кДа), БСА (66 кДа), фосфорилазу В (97 кДа) ("Serva", Германия). Для 16% геля не использовали БСА и фосфорилазу В, а для 8% геля исключали а-лактальбумин. Калибровочная смесь для гель-фильтрации ("Sigma", США) содержала голубой декстран (около 2000 кДа), а также следующие белки: рибонуклеаза А (13,7 кДа), химотрипсиноген А (25 кДа), овальбумин (45 кДа), БСА (66 кДа). Для калибровки сефадекса G-75 не использовали БСА.
После проведения электрофореза рассчитывали относительную электрофоретическую подвижность белков (Rf), находя отношение длины пробега белка к длине пробега бромфенолового синего. Строили калибровочный график зависимости Rf белков от логарифма их молекулярной массы. Молекулярную массу ЛФ и тяжелой субъединицы МПО рассчитывали по результатам электрофореза в 8% геле, а молекулярную массу эластазы, катепсина G, лизоцима и легкой субъединицы МПО - по результатам электрофореза в 16% геле.
Выделение из сыворотки фракции белков, обогащенной иммуноглобулинами, методом высаливания
Дія получения иммунных сывороток к МПО и ЛФ использовали схему иммунизации Призвански и др. (Pryzwansky et al., 1978). Кроликам трижды в течение недели вводили внутрикожно в область спины по 100 мкг очищенных препаратов белка в 0,2 мл 0,85% раствора NaCl в смеси с равным объемом полного адъюванта Фрейнда. Через три недели кроликов реиммунизировали тем же количеством антигена в неполном адъюванте Фрейнда. Сыворотки, получаемые таким методом, содержат преимущественно иммуноглобулины класса G.
Через 7-10 дней после реиммунизации из краевой вены уха кроликов собирали кровь в стеклянные пробирки, выдерживали ее сначала в течение 60 минут при температуре +37 С, а затем несколько часов при температуре +4С. После образования фибринового сгустка сыворотки центрифугировали в течение 10 минут при 500 g
Высаливание проводили, используя рекомендации, изложенные а соответствующих руководствах (Кэтти, РаЙкундалиа, 1991; Hornbeck, 1992). К сыворотке добавляли равный объем 4 М сульфата аммония и инкубировали 3-4 часа при температуре +4С. Затем пробу центрифугировали в течение 30-40 минут при 3000 g при +4 С, Осадок растворяли в дистиллированной воде, затем подвергали диализу против 0,01 М натрий-фосфатного буфера, рН 7,3, содержащего 0,15 М NaCl, и добавляли мертиолат до конечной концентрации 0,01 %.
2.10.3. Иммуноаффинная хроматография
Дальнейшую очистку антител осуществляли методом иммуноаффинной хроматографии, используя в качестве матрицы агарозу с иммобилизованным антигеном (МПО или ЛФ собаки). Процедуры иммобилизации белка на агарозе, заполнения колонки, нанесения пробы, элюции проводили с учетом рекомендаций, изложенных в инструкции производителя матрицы, и в соответствующих руководствах (Остерман, 1985; Кэтти, РаЙкундалиа, 1991).
Для приготовления матрицы сухую BrCN-агарозу ("Sigma", США) суспендировали в дистиллированной воде, декантировали 4-5 раз, промывали на фильтре Шотта № 160 1 мМ НО, затем - 0,1 М натрий-карбонатным буфером, рН 9,5, содержащим 0,5 М NaCl. Гель смешивали с белком, растворенным в том же буфере из расчета 1 г сухой BrCN-агарозы : 1 мг белка, смесь инкубировали в течение ночи на роторной мешалке при температуре +4QC, затем 3 часа при комнатной температуре. Гель отмывали на фильтре Шотта от несвязавшегося белка тем же натрий-карбонатным буфером, затем переносили в 1 М этанол амин, рН 8,0 (доводили НС1) и инкубировали 1 час на роторной мешалке при комнатной температуре, чтобы заблокировать активные BrCN-группировки носителя. Гель промывали на фильтре Шотта 0,01 М натрий-фосфатным буфером, рН 7,3, содержащим 0,15 М NaCl, затем 1 М NaCl, и снова натрий-фосфатным буфером. В пробу добавляли мертиолат до конечной концентрации 0,01%.
Аффинную хроматографию осуществляли на колонке 2,5x1 см. После нанесения фракции, обогащенной иммуноглобулинами (п. 2.10.2), колонку промывали 0,01 М натрий-фосфатным буфером, рН 7,3, содержащим 0,15 М NaCl, до нулевых значений оптической плотности. Элюцию антител осуществляли 0,1 М раствором глицина, рН 3,0 (доводили НС1), содержащим 0,15 М NaCl, со скоростью 20 мл/ч. За ходом элюции следили фотометрически, измеряя оптическую плотность фракций при длине волны 280 нм (спектрофотометр Beckman DU50). Концентрацию антител определяли по поглощению при длине волны 280 нм — 1 мг/мл дает значение оптической плотности 1,34 (Hornbeck, 1992). Пробу переводили в 0,01 М натрий-фосфатный буфер, рН 7,3, содержащий 0,15 М NaCl, на аппарате для ультрафильтрации ("Amicon", Голландия) на фильтре YM-10 под давлением азота 4-5 атмосфер при +4С. Препараты антител хранили при температуре -20С в аликвотах небольшого объема. Перед употреблением аликвоту размораживали при температуре +4С, затем хранили при этой температуре, повторно не замораживая.
Конъюгацию иммуноглобулинов G с пероксидазой хрена осуществляли периодатным методом (Кэтти, Райкундалиа, 1991). & мг пероксидазы растворяли в 1 мл воды, добавляли 2 мл 0,1 М раствора периодата натрия, перемешивали 20 минут и диализовали в течение ночи при +4С против избытка 1 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 4,4. К смеси прибавляли 20 мкл 0,2 М ЫагСОз, затем сразу же — раствор антител (5-10 мг/мл), предварительно диализованный против 0,05 М натрий-карбонатного буфера, рН 9,5. Смесь инкубировали 2 часа на роторной мешалке при комнатной температуре. Далее к смеси прибавляли 100 мкл 0,4% раствора боргидрида натрия и инкубировали 2 часа на роторной мешалке при +4С. Конъюгат подвергали диализу против 0,01 М натрий-фосфатного буфера, рН 7,3, содержащего 0,15 М NaCJ, и добавляли мертиолат до конечной концентрации 0,01%. Препараты конъюгата хранили при температуре -20С в аликвотах небольшого объема. Перед употреблением аликвоту размораживали при температуре +4С, затем хранили при этой температуре, повторно не замораживая.
Количественное определение МПО и ЛФ собаки проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа ("сэндвич" вариант):
1) поликлональные антитела к МПО или ЛФ собаки (5 мкг/мл в 0,2 М трис-НС1, буфере, рН 8,9) вносили в лунки 96-луночного планшета по 100 мкл и инкубировали 3-4 часа при +37 С.
2) лунки заполняли 0,8-1% БСА в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, рН 7,2-7,4, и инкубировали 1 ч при комнатной температуре.
3) добавляли по 100 мкл исследуемых образцов или стандартных проб с известной концентрацией антигена. Для разведения образцов (минимальное разведение - в 10 раз) использовали раствор БСА на натрий-фосфатном буфере. Планшет инкубировали 2 часа при температуре +37С.
4) в лунки вносили 100 мкл конъюгата антител с пероксидазой хрена, разведенного 1:1000 (для МПО) или 1:500 (для ЛФ) в растворе БСА. Планшет инкубировали 2 часа при температуре +37 С.
5) добавляли в каждую лунку по 100 мкл реакционной смеси, которая состоит из 2 % о-фенилендиамина и 0,015% перекиси водорода, растворенных в буфере, содержащем цитрат и фосфат натрия в концентрации 0,2 М и 0,1 М соответственно, рН 5,0. Реакция шла в темноте в течение 10-15 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали, добавляя серную кислоту до конечной концентрации 0,83 М (по 50 мкл 2,5 М H2SO4). Результаты реакции определяли колориметрически с помощью многоканального спектрофотометра Multiskan MS-353 ("Labsystems", Финляндия), измеряя оптическую плотность при длине волны 492 нм.
Иммунохимические исследования
На рис. 28 представлена зависимость активности лизоцима собаки и человека от значения рН буфера (0,1 М нитратно-фосфатный буфер, диапазон значений рН 4,4-7,5). Как видно, лизоцимы обоих видов имеют близкий рН-оптимум ферментативной активности. Характер зависимости для лизоцима человека выражается острым пиком с максимальной активностью при рН 6,0. В то же время лизоцим собаки имеет несколько более широкий рН-оптимум литической активности в диапазоне значений 6,0-7,0.
Разработанные нами системы ИФА для МПО и. ЛФ собаки были проверены на специфичность с помощью белков, которые могут содержать те же антигенные детерминанты. В системе для определения МПО собаки изучалась возможность неспецифического связывания с МПО человека и гемоглобином свиньи. МПО человека, внесенная в концентрации 10 мкг/мл, дает сигнал, аналогичный сигналу 4 нг/мл МПО собаки, (разница более: чем в 1000 раз). Сигнал, генерируемый гемоглобином (500 мкг/мл), соответствовал сигналу МПО собаки в концентрации 0,9 нг/мл (разница более чем в 10000 раз). В случае ЛФ белок человека в концентрации 10 мкг/мл давал сигнал, соответствующий 8,5 нг/мл ЛФ собаки (разница более чем в 1000 раз). Таким образом, использованные в работе системы ИФА для МПО и ЛФ собаки были высоко специфичны. Кроме того, результаты, полученные для гомологичных белков человека, дают представление о степени межвидового иммунологического родства белков.
Методом ИФА определяли содержание МПО и ЛФ в различных биологических жидкостях собаки: молоке, сыворотке крови, кишечном соке. В случае кишечного сока пробы отбирали через различные промежутки времени после приема пищи, чтобы выявить возможную зависимость содержания белков от стадии пищеварения. Результаты представлены в таблице 11. Во всех исследованных препаратах обнаружены МПО и ЛФ в различных концентрациях. Особенно велико было содержание белков в кишечном соке собаки, полученном с помощью открытой фистулы, наложенной на изолированную петлю тонкой кишки (п. 2.1.2). В ряде опытов значения концентрации обоих белков превышали 1 мг/мл. Однако какой-либо зависимости от стадии пищеварения при этом не наблюдалось. З.б. Изучение антимикробной активности белков
Результаты опытов по определению минимальной, ингибирующей концентрации (MIC) для апоЛФ, эластазы, катепсина G и лизоцима собаки и человека представлены на рис. 29-32 и в табл. 12. МПО в отсутствии Н2О2, а также холоЛФ не проявляли антимикробной активности в концентрациях вплоть до 70 мкг/мл (на рисунках и в таблице не показано).
В случае с МПО-системой (включающей МПО, Н2О2 и хлорид) был получен неожиданный результат. Оказалось, что зависимость антимикробной активности от концентрации белка имеет в данном случае более сложный немонотонный характер (рис. 33-34). В определенном диапазоне концентрации Н2О2 обнаруживается, что существует оптимальная концентрация МПО, и при ее увеличении антимикробная активность снижается. При этом перекись водорода сама по себе не проявляла антимикробной активности в используемых концентрациях (рис. 35). Как видно при сравнении рисунков 33-35 L. monocytogenes оказывается более устойчивой к действию Н2О2 по сравнению с Е. coli, но при этом более чувствительна к действию МПО-системы.
Источником хлорида для МПО-системы служил NaCl в концентрации 5 мМ во; всех опытах.
Для изучения кооперативных взаимодействий: были выбраны различные концентрации МПО и Н Ог для различных микробов, так как они различаются по чувствительности к МПО-системе. Концентрация МПО (и собаки, и человека) в опытах с Е. coli составляла 0,1 мкг/мл, а в опытах с L. monocytogenes — 0,0075 мкг/мл. Концентрация перекиси была 3 мкМ и 0,1 мкМ соответственно. В контрольных лунках оба этих компонента МПО-системы были взяты в двукратной концентрации. При таких концентрациях антимикробная активность МПО-системы не отличается достоверно от 0. Выбор концентраций был обусловлен необходимостью наличия монотонной зависимости антимикробной активности от концентрации фермента и перекиси водорода в ближайшей окрестности выбранных значений.
Белки, проявляющие антимикробную активность (табл. 12), для опытов по кооперативным взаимодействиям брали в концентрации 0,5 MIC. МПО (в отсутствии Н2О2 и NaCl) и холоЛФ брали в концентрации 35 мкг/мл, что соответствует половине максимальной концентрации, тестированной при изучении их индивидуального действия на микробы.
Результаты опытов представлены на рис. 36. Представлены только те сочетания белков, которые проявляют синергический эффект. Для белков собаки выявлено пять таких сочетаний против Е. coli (МПО-система и апоЛФ, МПО и лизоцим, апоЛФ и лизоцим, холоЛФ и лизоцим, эластаза и катепсин G, эластаза и лизоцим) и семь сочетаний против L. monocytogenes (те же, что и для Е. coli, а также МПО-система и катепсин G, МПО и катепсин G). В случае белков человека не обнаружено достоверного синергического эффекта для пар эластаза-катепсин G и эластаза-лизоцим для обоих микробов. Синергический эффект был достоверно выше для белков собаки в случае эластазы и лизоцима (для обоих микробов) и эластазы и катепсина G (только для L. monocytogenes). Достоверность оценивалась статистическими методами на уровне значимости 0,05.
