Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Общие представления о лектинах 8
1.1.1. Строение 13
1.1.2. Классификация 17
1.1.3. Локализация в организме млекопитающих 20
1.1.4. Биологическая роль 25
1.2. Молекулы клеточной адгезии и их роль в организме 31
1.2.1. Механизмы адгезии 32
1.2.2. Особенности структуры и функциональные категории . 37
1.2.2.1. Мембраноассоциированные молекулы адгезии 38
1.2.2.2. Растворимые факторы адгезии 41
1.3. Молекулярное моделирование взаимодействия «лектин - рецептор» 47
1.4. Основные направления практического применения лектинов 51
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 54
Глава 3. Результаты собственных исследований
3.1. Получение экстрактов головного мозга 60
3.2. Получение конъгогатов гликозаминогликанов с пероксидазой 63
3.3. Методика проведения углевод-ферментного анализа 66
3.4. Влияние реакции среды на активность взаимодействия гликозаминогликанов с лектинами головного мозга 67
3.5. Влияние натрия хлорида на взаимодействие гликозаминогликанов с белками экстрактов головного мозга 75
3.6. Влияние карбамида на взаимодействие гликозаминогликанов с бел-ками экстрактов головного мозга 82
3.7. Сравнение гепаринсвязывающих свойств сыворотки крови 93
3.8. Влияние натрия хлорида и карбамида на гепаринсвязывающую способность сыворотки крови 95
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 104
Выводы 108
Практические рекомендации 110
Список литературы 111
приложения 135
- Молекулы клеточной адгезии и их роль в организме
- Основные направления практического применения лектинов
- Влияние реакции среды на активность взаимодействия гликозаминогликанов с лектинами головного мозга
- Влияние натрия хлорида и карбамида на гепаринсвязывающую способность сыворотки крови
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Важной проблемой современной биологической и медицинской науки является изучение механизмов информационного взаимодействия между клетками нервной ткани. Большая роль в процессе белок-углеводного узнавания принадлежит лектинам, так как именно они, обладая углеводной специфичностью, являются наиболее активными эффекторами адгезии и обеспечивают согласованную работу органов и тканей в единой биологической системе.
Лектины представляют собой соединения, способные узнавать и специфически связывать сахара и углеводные компоненты сложных молекул, вызывая агглютинацию клеток или преципитацию полисахаридных конъюгатов; в свою очередь, поверхностные углеводы мембран принято рассматривать как детерминанты клеточного узнавания (I.J. Goldstein et al., 1986; S. Barondes, 1988; А.Д. Луцик и др., 1989; М.А. Пальцев и др., 1995; и др.). Патология в процессе межклеточных взаимодействий, возникающая при нарушении белок-углеводного узнавания, приводит к изменению эмбриогенеза, ослаблению местных и общих защитных реакций, развитию онкологических и инфекционных заболеваний.
В настоящее время накоплены многочисленные данные о лектинах, выделенных из почек, печени, сыворотки крови, определена их углеводная специфичность к моносахаридам. Биологически активные вещества - лектины - содержатся в любом живом организме, что открывает перспективы для дальнейшего изучения эволюционных процессов. Несмотря на многочисленность исследований о роли лектинов как углеводузнающих молекул, остается еще достаточно неизученных вопросов. В частности, отсутствие в литературе сведений об олигосахаридной специфичности и свойствах нейролектинов не позволяет в полной мере использовать их в биологии, гистологии и медицине. В связи с этим представляется важным выделение лектинов головного
6 мозга млекопитающих, изучение их углеводсвязывающих и биохимических свойств.
Цель и задачи исследования. Целью нашей работы явилось комплексное исследование по выделению и идентификации гликозаминогликансвязы-вающих лектинов головного мозга человека и кролика, изучение их биохимических свойств, а также разработка методов качественного и количественного определения гепаринсвязывающих лектинов в экстрактах мозговой ткани и сыворотке крови.
Поставленная цель реализовалась при решении следующих задач:
Изучить влияние различных способов получения экстрактов мозговой ткани на активность взаимодействия со следующими гликозаминогликанами: нефракционированным, низкомолекулярным и десульфатированным гепарином, гиалуроновой кислотой, хондроитинсульфатом.
Установить зависимость активности лектин-углеводных взаимодействий от реакции среды.
Исследовать влияние различных концентраций карбамида и натрия хлорида на взаимодействие нефракционированного гепарина с пектинами головного мозга и сыворотки крови при изменении реакции среды.
Сравнить биохимические свойства гепаринсвязывающих лектинов головного мозга и сыворотки крови.
Научная новизна. На основании комплексных исследований впервые выявлено наличие нейролектинов с общей олигосахариднои специфичностью к гликозаминогликанам у человека и животных. Впервые установлена углеводная специфичность нейролектинов человека и кролика к низкомолекулярному, десульфатированному гепарину, хондроитинсульфату, гиалуроновой кислоте. Изучено влияние реакции среды, натрия хлорида и карбамида на уг-леводсвязывающие свойства лектинов головного мозга.
Теоретическая и практическая значимость работы. Углевод-ферментный анализ позволил выявить нейролектины с общими биохимическими свойствами и углеводной специфичностью к гликозаминогликанам у
эволюционно удаленных классов млекопитающих (человека и кролика), что важно для понимания процесса эволюции нервной системы. Полученные данные вносят существенный вклад в изучение молекулярных механизмов межклеточного взаимодействия в нервной системе и могут использоваться в качестве нормативных показателей при лабораторной диагностике заболеваний нервной системы. Материалы исследования могут быть использованы для разработки научно обоснованных рекомендаций при изучении курсов биохимии, гистологии и цитологии в высших учебных заведениях. На защиту выносятся следующие положения:
Зависимость концентрации водорастворимых белков и гликозаминог-ликансвязывающей активности лектинов от способа получения экстракта.
Влияние реакции среды на активность связывания исследуемых экстрактов головного мозга человека и кролика с гликозаминогликанами (неф-ракционированным, низкомолекулярным и десульфатированным гепарином, хондроитинсульфатом, гиалуроновой кислотой).
Влияние натрия хлорида и карбамида на активность взаимодействия экстрактов головного мозга с нефракционированным гепарином.
Установленное сходство биохимических свойств гепаринсвязываю-щих лектинов экстрактов головного мозга человека и кролика,
Влияние реакции среды, натрия хлорида и карбамида на активность взаимодействия сыворотки крови человека и кролика с нефракционированным гепарином.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертации отражены в 5 научных публикациях. Результаты работы изложены в выступлениях на международной научно-практической конференции (Брянск, 2004), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (Белгород, 2004), межвузовской научно-практической конференции (Курск, 2004), научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава Курской государственной сельскохозяйственной академии имени профессора И.И. Иванова (Курск, 2004).
Молекулы клеточной адгезии и их роль в организме
Адгезия жизненно необходима для нормального функционирования организма млекопитающих. Благодаря процессам адгезии поддерживается работа отдельных органов и тканей в единой биологической системе, обеспечивается выполнение таких важных функций, как оплодотворение, эмбриогенез, иммунные реакции, клиренс белков, межклеточные взаимодействия и прикрепление клеток к экстрацеллюлярному матриксу (Н.ГТ. Королев, 1984).
По данным М.А. Пальцева (1995), взаимодействие между клетками, а также между клетками и межклеточным веществом обеспечивается несколькими семействами адгезивных молекул: интегринами, пектинами, суперсемейством иммуноглобулинов, кадгедринами, селектинами, хоминговыми рецепторами и др., причем каждая группа веществ выполняет определенные функции, например, кадгедрины обеспечивают кальцийзависимую межклеточную адгезию, селектины - прилипание свободно циркулирующих лейкоцитов к эндотелию, интегрины способствуют как межклеточной адгезии, так и адгезии клетки к субстрату.
По современным представлениям, в процессе адгезии важную роль выполняет внеклеточный матрикс, который представляет собой супрамолекулярный комплекс, образующий клеточное окружение, которое влияет на дифференцировку, пролиферацию, организацию и прикрепление клеток. Внеклеточный матрикс играет ключевую роль в органогенезе, эмбриогенезе, посттравматическом заживлении, канцерогенезе, опухолевой инвазии и хоминге метастазирующих опухолевых клеток.
Межклеточные взаимодействи, помимо фиксированных рецепторов, обеспечиваются различными растворимыми медиаторами, оказывающими преимущественно локальное действие. Среди них ведущую роль играют ци-токины и ростовые факторы.
Цитокины являются важнейшими факторами межклеточного сообщения и действуют либо мембраноассоциировано, либо в диффузной форме связываясь со специфическими рецепторами на клетке-продуценте или на соседних клетках.
Ростовые факторы продуцируются неспециализированными клетками, находящимися во всех тканях, и обладают эндокринным, паракринным и ау-токринным действием. Для ростовых факторов характерен широкий спектр биологического действия. Они стимулируют или тормозят митогенез и дифференцировку клеток. Различают эпидермальный, тромбоцитарный, нервный, гепаринсвязывающий и другие факторы роста (О.А. Гомазков, 2003).
Механизмы адгезии клетки к клетке. Высказывается предположение, что адгезия клетки к клетке обусловлена реакцией между комплементарными молекулами. Такие взаимодействия могут быть следующих двух типов:
1) реакция между углеводными цепями, аналогичная взаимодействиям цепей многих линейных полисахаридов;
2) реакция между углеводным компонентом и углеводсвязывающим белком, т. е. лектином (D.A. Rees, 1977). В последнее время отдается предпочтение межклеточным контактам с участием пектинов, поскольку прямые взаимодействия между гликанами и гликопротеинами не доказаны. В то же время обнаружены углеводсвязы-вающие белки необходимой специфичности и установлена их локализация на поверхности клетки. В ряде случаев эти белки появляются именно в то время, когда в ходе развития происходят определенные изменения, что подтверждает гипотезу о наличии белок-углеводных взаимодействий, происходящих между молекулами, интегрированными в мембраны клеточной поверхности реагирующих клеток, соединенных с факторами агрегации (лекти-нами) (Р. Хьюз, 1985).
В первых исследованиях факторов, участвующих в процессе межклеточной адгезии, были выделены лектины из инкубационных сред культивируемых клеток высших организмов, а также получены факторы агрегации, например, из первичных культур клеток сетчатки куриного эмбриона (А.А. Moscona, R.E. Hausman, 1977). Этот фактор вызывает агрегацию клеток сетчатки, но не действует на клетки других тканей.
В настоящее время факторы межклеточной адгезии, относящиеся к группе лектинов, выявлены во всех тканях организма человека. Эти лектины не являются интегральными компонентами клеточных мембран, так как со-любилизируются при выдерживании тканей в растворах простых галактози-дов, например, в растворе лактозы (S.H. Barondes, 1980; 1988).
Из нервной ткани млекопитающих первым был выделен галактозосвя-зывающий лектин из клеток мозга новорожденных крысят. Этот лектин появляется у 10-суточных крысят во время максимального образования синапсов, и возможно, что он играет важную роль в процессе синаптогенеза при развитии кортикального слоя (D.L. Simpson et al., 1978).
Механизмы адгезии клетки к субстрату. Все клетки, за исключением свободно циркулирующих, окружены или погружены в слой вещества, богатого углеводами. Этот слой обозначают как гликокаликс, базальную мембрану, экстрацеллюлярный матрикс. В работе мы будем придерживаться терми на «экстрацеллюлярный матрикс» (ЭЦМ). ЭЦМ различают по своей тонкой структуре в зависимости от типа образующих его клеток. Главным компонентом является коллаген с варьирующим количеством протеогликанов и различных гликопротеинов (Р. Хьюз, 1985). Углеводный компонент глико-конъюгатов играет важную роль в качестве посредника при адгезии клеток и межклеточного матрикса, в частности коллагена, и тем самым участвует в регуляции клеточного метаболизма и роста (М.Г. Гринфельдт и др., 1996). ЭЦМ является супрамолекулярным комплексом, образующим внеклеточное окружение, которое влияет на дифференцировку, пролиферацию, организацию и прикрепление клеток. Он участвует в органогенезе, эмбриогенезе, посттравматическом заживлении, а также в канцерогенезе, опухолевой инвазии и хоминге метастатических опухолевых клеток. Ведущими адгезивными молекулами ЭЦМ для клеток являются фибронектин, витронектин, лами-нин/нидоген, фибриллярные коллагены, коллаген БМ (IV типа) и протеогли-каны. Однако взаимодействие клеток с внеклеточным матриксом в условиях in vivo чрезвычайно сложное, и, помимо прикрепления к субстрату, адгезия клеток при некоторых процессах ослабевает. Описана группа секретируемых гликопротеинов (SPARS, тенасцин, тромбосподин), которая обладает антиадгезивными свойствами, приводящими к округлению клеток и частичному отделению их от субстрата. Хотя эти белки секретируются и располагаются в локальном микроокружении, где оказывают аутокринное или паракринное действие, они обычно не аккумулируются или функционируют как структурные компоненты ЭЦМ в нормальном взрослом организме.
Протеогликаны связываются с фибронектином, ламинином, коллагеном и другими компонентами ЭЦМ, а также с поверхностными рецепторами клеток к протеогликанам и служат основными рецепторами при сборке внеклеточного матрикса (S.H. Akiyama et al., 1990). Хотя у декорина (PG II) и некоторых других протеогликанов связывающие сайты расположены на ядре молекулы, большинство взаимодействий происходит с гликозаминогликано-выми цепями. Как и фибронектины, протеогликаны окаймляют коллагеновые фибриллы через одинаковые интервалы, что подтверждает наличие специфи чески связывающих сайтов (М.А. Пальцев и др., 1995). Протеогликаны уси ливают взаимодействие между другими матриксными белками. После добав ления протеогликанов усиливается связь фибронектина с коллагеном (В.В.Серов и др., 1981). Функция протеогликана как нативного рецептора для сборки ЭЦМ может объяснить причину неспособности некоторых транс формированных клеток формировать ЭЦМ. Эти клетки имеют биохимиче ский дефект в сульфатировании гликозаминогликановых цепей, что приводит к ослаблению связывания матриксных молекул между собой. Таким образом, протеогликаны обладают как бы двойной функцией: с одной стороны, спо собствуют клеточной адгезии, а с другой — ингибируют ее. Важными адге зивными молекулами ЭЦМ являются протеогликаны, которые облегчают клеточное прикрепление, используют RGD-последовательность интегрино вых рецепторов. Эти протеогликаны обычно богаты гепарансульфатом и располагаются преимущественно на клеточной поверхности. Их локализация свидетельствует о том, что фибронектин и ламинин участвуют в клеточной адгезии опосредованно, через эти белки (М.А. Пальцев и др., 1995; О.А. Че репанова, 2003). і Адгезия клетки к ЭЦМ или поверхности пластика включает три этапа: 1) связывание гликопротеинового фактора с поверхностью пластика или коллагена; 2) прикрепление клеток к фактору, присоединившемуся к поверхности; 3) умножение взаимодействий между поверхностью клеток и гликопро-теиновыми молекулами и реорганизация внутриклеточного цитоскеле-та, в частности микрофиламентов, с распластыванием клеточной цитоплазмы по субстрату.
Основные направления практического применения лектинов
Впервые лектины нашли свое практическое применение в гемотранс-фузиологии благодаря своей способности избирательно, в зависимости от группы крови, агглютинировать эритроциты человека (О.Е. Галанина, 1993). В результате развития лектинологии значительно расширился круг их использования человеком. Лектины употребляются в качестве лекарственных препаратов, молекулярных зондов в изучении закономерностей дифференци-ровки и функционирования клеток, выделении и исследовании многих биологически активных веществ, в качестве биоэффекторов, диагностических реагентов в изосерологии, клинико-лабораторных и патологоморфологиче-ских исследованиях, - вот далеко не полный перечень основных направлений использования лектинов в современной биологии и медицине (J. Roth, 1978; О.А.Хомутовский и др., 1986; G.N. Thomopoulos et al.} 1987). Растительные лектины нашли широкое применение в фармакологической практике как им-муномодуляторы (Е.Л. Голынская и др., 1997; М.В. Киселевский и др., 2002). Лектины стали важными диагностическими и лечебными средствами в медицинской практике. Так, определение уровня NCAM и L1 в сыворотке крови и спинномозговой жидкости больных применяется для уточнения постоперационного диагноза. Меченные радиоактивными изотопами, эти адгезивные молекулы применяются для терапии опухоли нервной ткани. Кроме того, результаты исследований ряда авторов позволяют рекомендовать определение уровня NCAM в амниотическои жидкости беременных в качестве метода ранней пренатальной диагностики дефектов развития нервной трубки (В.А. Березин и др., 1985; И.И. Шепелева и др., 1996; СО. Рогаткин и др., 1999). Доказаны повышение нейроспецифических антигенов в сыворотке крови при закрытой черепно-мозговой травме и возможность использования оценки количественных показателей для прогнозирования результатов лечения (Н.И. Лисяный и др., 1991). Определение концентрации лектинов и лек-тинсвязывающих белков нашло применение для диагностики ревматоидного артрита, аллергических воспалительных реакций, ЛОР-заболеваний, слабости родовой деятельности (A.M. Ященко и др., 1991; А.В, Тимошенко и др., 1995, 1998; А.А. Польнер и др., 1998; Е.Л. Насонов и др., 1999). Изучена возможность применения растительных лектинов для выявления повышенной активности агрегации тромбоцитов при стенокардии, разработана методика диагностики нестабильной стенокардии, позволяющая своевременно выявить активацию процесса тромбообразования и начать лечение по предотвращению развития такого грозного осложнения, как инфаркт миокарда (Д.Б. Уте-шев и др., 1997; В.Ф. Киричук и др., 2000, 2001).
Подводя итог работам как российских, так и зарубежных ученых по практическому применению лектинов, можно выделить ряд основных направлений:
1) применеие лектинов с целью гетерологичной агглютинации клеток крови в зависимости от видовой и групповой принадлежности;
2) использование для разделения и очистки углеводсвязывающих биомолекул, основанное на различиях в структуре их углеводных компонентов;
3) изучение структуры углеводной части биомолекул;
4) применение лектинов с целью изменения клеточного метаболизма и митогенной активности;
5) выявление патологически измененных клеток по изменению структуры и функции мембран, в том числе и опухолевых;
6) исследование функций лектинов в живых организмах;
7) использование лектинов в качестве диагностических реагентов. Таким образом, на основании вышеизложенных фактов представляется важным в научном и практическом плане изучение лектинов головного мозга с общей олигосахаридной специфичностью у эволюционно удаленных организмов. Полученная информация позволит в дальнейшем определить механизм влияния лектинов как биомолекул, участвующих в углевод-белковом узнавании на клеточном уровне. Недостаточная изученность биологической активности лектинов тормозит их использование в медицине, биологии и биотехнологии.
Влияние реакции среды на активность взаимодействия гликозаминогликанов с лектинами головного мозга
Механизм углеводного узнавания является эволюционно древним и универсальным для всех видов живых организмов способом межклеточных взаимодействий. Для выявления общих свойств у эволюционно отдаленных друг от друга отрядов млекопитающих провели исследование лектинов ГМ человека и кролика с общей олигосахаридной специфичностью.
В рамках задач настоящего исследования было проведено изучение изменения уровня активности лектин-углеводного взаимодействия в зависимости от реакции среды. В опыте исследовали три различных экстракта головного мозга человека: экстракт головного мозга, содержащий белки, растворимые в изотоническом растворе натрия хлорида (Si), экстракт головного мозга, содержащий белки, растворимые в 2М растворе натрия хлорида (S2), экстрактголовного мозга, содержащий белки, растворимые в 4М растворе карбамида (БД Одновременно исследовали экстракты ГМ кроликов, полученные экстрагированием изотоническим раствором натрия хлорида (Ki), 2М раствором натрия хлорида (К2) и 4М раствором карбамида (К4).
Со всеми исследуемыми экстрактами проводили углевод-ферментный анализ с гликозаминогликанами, конъюгированными с пероксидазой в соответствии с методикой, описанной в п. И.3.3. Использовали углевод-ферментные конъюгаты ГАГ: нефракционированный, низкомолекулярный и десульфатированный гепарин, хондроитинсульфат В, гиалуроновую кислоту, разведенные 1:80 буферными растворами с рН от 2 до 9. Буферные растворы готовили в соответствии с рекомендациями Ф.А. Калинина и др. (1971). Уровень рН проверяли на рН-метре «рН 300» (Испания).
В данном эксперименте было проведено две серии опытов: первая - с экстрактами головного мозга человека, вторая - с экстрактами головного мозга кролика. Далее проводили углевод-ферментный анализ со всеми исследуемыми ГАГ для каждого вида экстракта отдельно. Количество связавшихся с ГАГ лектинов оценивали по величине зарегистрированных показателей оптической плотности.
Анализ полученных результатов при изучении экстрактов ГМ человека показал следующее.
1. Все исследуемые ГАГ, за исключением десульфатированного гепарина, обладают способностью связываться с экстрактами головного мозга человека. Изменение реакции среды оказывает существенное влияние на пектиновую активность экстрактов (приложение 1).
2. На рис. 2 представлены результаты лектин-углеводного взаимодействия гепарина с исследуемыми экстрактами ГМ человека. Наибольшая лек-тиновая активность у экстракта Si зарегистрирована в кислом диапазоне при рН 5 (D = 0,792) и в щелочной среде при рН 9 (D = 1,445). Оптическая плотность при рН 5 ниже чем при рН 9 на 55%. В нейтральной среде при рН 7 отмечается незначительная тенденция к усилению связывания лектинов (D = 0,591). В присутствии буферных растворов с рН 2-4 связывание лектинов экстракта S, с гепарином происходило на самом низком уровне, показатели оптической плотности составили 0,135-0,209.
Экспериментальные данные, полученные при изучении гепаринсвязы-вающих свойств экстракта S2) имеют те же закономерности, что и лектины экстракта S(, но обладают большей активностью. Оптическая плотность $2 при рН 5 выше на 27 (D = 1,008), а при рН 9 - на 15% (D = 1,665).
У экстракта S4 отмечается более низкая по сравнению с двумя другими исследуемыми экстрактами активность лектин-гепаринового взаимодействия. Так, при рН 5 показатели оптической плотности относительно экстракта St ниже на 22 (D = 0,618), а при рН 9 -на 10% (D = 1,288). 3. В реакции с низкомолекулярным гепарином (рис. 2), в отличие от связывания с нефракционированным гепарином, наблюдали активность лектин-углеводного взаимодействия со всеми экстрактами в кислой среде при рН 2 и 3 (D = 0,627-1,147). В зоне рН от 4 до 9 лектиновая активность у всех видов экстрактов мозговой ткани сохранялась на минимальном уровне (D = 0,131-0,411). При рН 8 регистрировалась тенденция к усилению связывания, показатель оптической плотности при взаимодействии с экстрактом S1 составил 0,365 и с S2 - 0,535. При данном значении рН у экстракта S4 увеличения показателя оптической плотности зарегистрировано не было (D = 0,175).
Влияние натрия хлорида и карбамида на гепаринсвязывающую способность сыворотки крови
Для изучения влияния осмотического градиента на гепаринсвязываю-щие свойства сыворотки крови использовали растворы натрия хлорида с концентрацией от 0,2 до 4М. Натрия хлорид растворяли в 0,001М буферных растворах с рН от 2 до 9. В данном эксперименте проводили углевод-ферментный анализ в соответствии с методикой, применявшейся для изучения влияния NaCl на экстракты головного мозга человека и кролика (см. п. Ш.6.-ІІІ.9.). Далее было изучено воздействие высоких концентраций карбамида и одновременного добавления карбамида и натрия хлорида на гепаринсвязывающую способность сыворотки крови человека. С этой целью гепарин, конъюгированный с пероксидазой в соотношении 1:80, разводили буферными растворами с рН от 2 до 9. К разведенным конъюгатам добавляли: 1) натрия хлорид в концентрации от 0,2 до 4М; 2)карбамид в концентрации 5 и 7,5М; 3Одновременно карбамид (5 и 7,5М) и натрия хлорид (1; 3,8 и 4М).
Анализ полученных экспериментальных данных (приложения 7-10) показал следующее.
1. Влияние натрия хлорида на взаимодействие сыворотки крови чело века с гепарином зависит от концентрации раствора и реакции среды (при ложение 8). Так, в присутствии буферных растворов с рН 2—3 и 6-8, содер жащих от 0,2 до 4М NaCl, активизация связывания с гепарином не происхо дила, показатели оптической плотности были зарегистрированы на уровне 0,100-0,187. При рН 4 все исследуемые концентрации NaCl усиливали свя зывание с гепарином, но в присутствии 0,2; 0,3; 0,5 и 1М NaCl показатели оп тической плотности увеличивались до D = 0,195-0,325, а при более высоких концентрациях - до 0,991-1,325. При рН5 низкие концентрации NaCl не влияли на гепаринсвязывающую способность. Добавление 2; 3; 3,8 и 4М NaCl усиливали взаимодействие сыворотки крови с гепарином в 3,5 раза (D = 0,283-0,465). В щелочной среде при рН 9 зарегистрировано значитель ное усиление связывания с гепарином пропорционально увеличению концен трации NaCl. Так, в присутствии 0,2М раствора D было равно 0,946, а при добавлении 4М- 1,777 (рис. 22).
2. Анализ результатов, полученных при проведении углевод ферментного анализа гепаринсвязывающей способности сыворотки крови в присутствии 5 и 7,5 М карбамида (приложение 9), показал, что при всех ис следуемых концентрациях карбамида независимо от реакции среды отмеча лось супрессивное влияние на взаимодействие с гепарином белков сыворотки крови. Как видно на рис. 23, в присутствии 5М раствора карбамида при рН от 2 до 8 гепаринсвязывающая способность сыворотки крови человека сохраня лась на минимальном уровне (D = 0,0424),179). В щелочной среде при рН 9 отмечалось снижение показателей оптической плотности до 0,117. Добавле ние натрия хлорида не приводило к усилению связывания с гепарином. В присутствии 7,5М карбамида (рис. 24) также отмечалось подавление гепаринсвязывающей способности сыворотки крови человека независимо от присутствия натрия хлорида.
Сравнивая полученные при изучении гепаринсвязывающих свойств сыворотки крови человека данные с результатами проведенного в тех же условиях эксперимента с экстрактами ГМ человека, мы видим, что добавление карбамида полностью блокирует гепаринсвязывающую способность сыворотки крови. При добавлении натрия хлорида не зарегистрировано увеличение показателей оптической плотности.
3. Действие натрия хлорида на сыворотку крови кролика (рис. 25) сходно с влиянием на сыворотку крови человека. При рН 2-3 регистрируется незначительная тенденция к усилению лектин-гепариновых взаимодействий. При рН 4 добавление натрия хлорида в концентрации от 1 до 4М приводило к увеличению показателей оптической плотности. Так, в присутствии 1М NaCl D = 0,692, в присутствии 4М -1,104 (без добавления NaCl D = 0,091). При рН 5 также регистрируется усиление гепаринсвязывающей способности сыворотки крови кролика в присутствии более чем 0,5М натрия хлорида, но менее выраженное, чем при рН 4. При рН 6-8 добавление натрия хлорида не приводит к усилению гепаринсвязывающей способности сыворотки крови кролика. В щелочной среде при рН 9 в присутствии 0,2; 0,3 и 0,5М NaCl ге-паринсвязывающие свойства сыворотки крови не изменялись, при более высоких концентрациях отмечалось увеличение оптической плотности пропорционально нарастанию концентрации (см. приложение 10).
4. Добавление всех исследуемых концентраций карбамида независимо от присутствия натрия хлорида приводило к тому, что гепарин терял способность связываться с сывороткой крови кролика (рис. 26 и 27, приложение 11).
