Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Взаимосвязь иммунной и нервной систем 7
1.1. Взаимная регуляция иммунной и нервной систем 7
1.1.1. Нервная регуляция иммунной системы 8
1.1.2. Иммунная регуляция нервной системы 9
1.1.3. Нейровоспаление 10
1.2 Глутамат в иммунной системе 12
II. Распространение и функции глутаматных рецепторов в организме 15
II. 1. Глутаматные рецепторы в мозге 15
II.1.1. Классификация глутаматных рецепторов 15
II.1.2. Взаимодействие глутаматных рецепторов разных классов 16
II.1.3. Экзайтотксичность 17
II.2. Глутаматные рецепторы в периферических тканях и органах 18
II.3. Глутаматные рецепторы при неопластических процессах 20
II.4. Глутаматные рецепторы лимфоцитов 23
III. NMDA-рецептор: структура и функции 27
III.1. Структура NMDA-рецептора: субъединичный состав и лигандная специфичность 27
III.2.Регуляция функционирования рецепторов 29
III.2.1. Десенсибилизация 30
III.2.2. Фосфорилирование 31
III.2.3. Встраивание в мембрану и формирование функционально активного рецепторного комплекса 34
IV. Механизмы клеточной активации 37
IV.1. Общие представления о механизмах клеточной активации 37
IV.2. АФК и их участие в механизмах сигнальной трансдукции 38
IV.2.1. АФК, источники их образования в организме, система антиоксидантной защиты 38
IV.2.2. Биологическая роль АФК и участие в сигнальной трансдукции 40
IV.3. Активация лимфоцитов 44
IV.3.1 Роль кальция в активации лимфоцитов 45
IV.3.2. УчастиеАФКв активации лимфоцитов.. 47
IV.4. NMDA-рецептор и механизмы внутриклеточной сигнализации 48
Цель и задачи исследования 55
Научная новизна и практическая ценность работы 55
Положения, выносимые на защиту 56
I. Материалы и методы исследования 57
1.1. Получение клеточных препаратов 57
1.1.1. Получение ткани мозжечка крыс и выделение гранулярных клеток 57
1.1.2. Отбор крови 57
1.1.3 Выделение лимфоцитов 58
1.1.4. Первичная культура периферических лимфоцитов 58
1.2. Определение уровня свободных радикалов хемилюминесцентным методом 58
1.3. Проточная цитометрия 60
1.3.1. Принцип метода проточной цитометрии 60
1.3.2.Определение внутриклеточного уровня АФК. 61
1.3.3.Определение доли мертвых клеток 63
1.3.4.Определение доли апоптотических клеток 63
1.3.5.Иммунофенотипирование 64
1.3.6.Определение экспрессии NRl-субъединицы 65
1.4. Определение экспрессии гена GRIN1 66
1.4.1. Дизайн праймеров для полимеразной цепной реакции 66
1.4.2. Выделение РНК и обратная транскрипция 66
1.4.3. Полимеразная цепная реакция 67
1.5. Статистическая обработка данных 67
II. Результаты исследования и их обсуждение 68
II.1. Влияние NMDA на хемилюминесценцию суспензии лимфоцитов периферической крови человека 68
II.2. Исследование действия NMDA на функциональное состояние лимфоцитов методом проточной цитометрии 72
II.3. Определение экспрессии мРНК к NR1 субъединице NMDA-рецепторного комплекса 78
II.4. Определение экспрессии субъединицы NR1 NMDA-рецепторного комплекса на поверхности лимфоцитов 81
II.4.1. Окраска клеток поликлональными антителами (ab6483) KNRI-субъединице 81
II.4.2. Окраска клеток моноклональными антителами (GTX30182) KNRJ- субъединице 82
II.4.3. Изменение экспрессии NR1 в результате инкубации клеток с NMDA 83
Заключение 87
Выводы 89
Благодарности 90
Список литературы 91
- Глутаматные рецепторы в периферических тканях и органах
- Встраивание в мембрану и формирование функционально активного рецепторного комплекса
- NMDA-рецептор и механизмы внутриклеточной сигнализации
- Влияние NMDA на хемилюминесценцию суспензии лимфоцитов периферической крови человека
Введение к работе
В современном естествознании сложилось устойчивое представление о взаимосвязи нервной и иммунной систем, совместную работу которых можно рассматривать как единый защитный механизм, обеспечивающий адаптационные реакции организма. Показано, что клетки иммунной системы человека экспрессируют ряд рецепторов, чувствительных к нейромедиаторам, что позволяет им воспринимать информацию, получаемую от клеток нервной системы. В частности, известно, что в поддержании гомеостаза лимфоцитов важную роль играет глутаминовая кислота, однако механизмы, опосредующие ее действие на клетки белой крови, до сих пор недостаточно изучены.
Необходимым условием для понимания процессов, лежащих в основе «диалога» между нервной и иммунной системами как в норме, так и при патологии, является изучение тонких механизмов их взаимодействия на клеточном и молекулярном уровнях. Проблема регуляции межклеточных взаимодействий такого рода до сих пор остается открытой, поэтому актуальность проведения подобных исследований трудно переоценить. Возможно, выяснение регуляторных взаимосвязей между нервной и иммунной системами позволит выявить новые подходы в лечении ряда заболеваний. В первую очередь это относится к патологическим состояниям, характеризующимся воспалительными процессами в ЦНС, в частности, ишемии головного мозга, рассеянному склерозу, болезни Альцгеймера и другим патологиям, протекающим на фоне выраженного окислительного стресса.
Общей чертой в развитии таких заболеваний является значительное повышение уровня глутаминовои кислоты, что приводит к неирональнои смерти вследствие развития экзайтоксических механизмов. Поскольку в процессе нейровоспаления активированные клетки белой крови проникают в ткани мозга, оказывая на них повреждающее воздействие, исследование механизмов воздействия глутаминовои кислоты на лимфоциты и другие клетки иммунной системы может способствовать лучшему пониманию патогенеза воспаления нервной ткани.
С другой стороны, уровень глутаминовои кислоты в плазме крови существенно повышается у больных с опухолевыми заболеваниями. Известно, что это коррелирует с
подавлением иммунной системы, в частности, со снижением числа лимфоцитов и подавлением их функциональной активности, однако механизмы, обусловливающие эти эффекты, еще не исследованы.
В связи с вышесказанным, изучение способов воздействия глутаминовой кислоты на клетки иммунной системы представляется весьма актуальной проблемой как для теоретической, так и для практической медицины.
Глутаматные рецепторы в периферических тканях и органах
С момента открытия сигнальной роли глутамата в ЦНС огромное число исследований было посвящено изучению глутаматергической передачи в синапсе, и лишь сравнительно недавно стало понятно, что, помимо этого, глутамат обладает сигнальной функцией в периферической нервной системе и в не-нейрональных тканях. На сегодняшний день имеются убедительные доказательства прямого участия L-глутаминовой кислоты и рецепторов к ней в функционировании эндокринной и иммунной систем (см. 1.2), что позволяет рассматривать глутамат не только как нейротрансмиттер, но и более широко - как распространенный цитокин, способный воздействовать на клеточную активность в различных типах тканей.
Хорошим подтверждением такой точки зрения является доказательство сигнальной функции глутамата в клетках костной ткани (остаокластах и остеобластах). Следует отметить, что в нервной системе для реализации действия глутаминовой кислоты необходим целый молекулярный аппарат, включающий в себя, помимо рецепторов, различные виды глутаматных транспортеров, ответственных за обратный захват медиатора из межсинаптического пространства (что позволяет терминировать передачу сигнала), а также везикулярных глутаматных транспортеров, отвечающих за высвобождение глутамата из внутриклеточных везикул. Обнаружение аналогичной системы в остеобластах и остеокластах млекопитающих позволило говорить о глутамате как эндогенном регуляторе, вовлекающемся во взаимодействие клеток костной ткани (Genever P.G., Skerry Т.М., 2001; Hinoi Е. et al., 2004). Действительно, различными методами была показана экспрессия функционально активных NMDA-рецепторов в остеобластах и остеокластах (Chenu С. et al., 1998; Patton A.J. et al., 1998; Espinosa L. et al., 1999;GuY.etal., 2002; Hinoi E.etal., 2003), AMPA и каинатных (Genever P.G., Skerry T.M., 2001), а также метаботропных рецепторов I и III группы в остеобластах (Gu Y., Publicover S.J., 2000; Hinoi E. et al., 2001). Также была продемонстрирована экспрессия мРНК различных глутаматных транспортеров в остеокластах (Hinoi Е. et al., 2004).
Как известно, остеобласты и остеокласты являются клетками, ответственными за образование и поддержание костной ткани, взаимодействие между которыми осуществляется путем как эндокринного (посредством эстрогена, паратиреоидного гормона), так и пара- и аутокринного контроля (интерлейкины, инсулиноподобный фактор роста IGF, фактор роста фибробластов FGF). Дисбаланс между этими клетками приводит к развитию различных метаболических костных заболеваний. Наличие транспортеров и рецепторов к глутаминовой кислоте позволяет рассматривать ее как еще один важный регулятор, участвующий в межклеточном взаимодействии клеток костной ткани.
Глутаматные рецепторы и транспортеры были обнаружены и в других тканях и органах, в том числе - ответственных за поддержание гормонального баланса в организме. Так, показана экспрессия как ионотропных, так и метаботропных глутаматных рецепторов в клетках островов Лангерганса поджелудочной железы (Bertrand G. et al., 1992; Inagaki M. et al., 1995; Molnar E. et al., 1995), где они участвуют в межклеточной сигнализации, осуществляемой глутаматом, регулируя секрецию глюкагона и инсулина. В
надпочечниках глутамат и агонисты как ионотропных (NMDA, АМРА, каинат), так и метаботропных рецепторов (1-аминоциклопентан-транс-1,3-дикарбоновая кислота, t-ACPD) стимулируют выброс катехоламинов (Gonzalez М.Р. et al., 1998). Методами гибридизации in situ и ПЦР показана экспрессия АМРА- и NMDA-рецепторов в клетках надпочечников (Kristensen Р., 1993; Watanabe М. et al., 1994), изменение экспрессии NMDA-рецепторов в условиях стрессорного воздействия (Schwendt М., Jezova, D., 2001; Pirnik Z. et al., 2001), и их участие в регуляции клеточной активации за счет изменения экспрессии транскрипционного фактора API (Hinoi Е. et al., 2002а).
Различные виды глутаматных рецепторов обнаружены и во многих других органах: сердце (Winter C.R., Baker R.C., 1995; Gill S.S. et al., 1998,1999,2000), печени (Storto M. et al., 2000b; Gill S.S., et al., 2000), легких (Said S.I. et al., 1996, 2001; Dickman K.G. et al., 2003; Sinclair P.B. et al., 2004), почках (Sinclair P.B. et al., 2004; Gill S.S. et al, 2000) и селезенке (Gill S.S. et al., 2000), семенниках (Storto M. et al., 2001; Gill S.S. et al., 2000). Интересным является факт обнаружения функционально активных NMDA-рецепторов в тромбоцитах (Franconi F. et al., 1996, 1998; Genever P.G. et al., 1999), и доказательство их участия в мегакариоцитопоэзе (Hitchcock I.S. et al., 2003).
Таким образом, глутамат играет важную роль в поддержании клеточного гомеостаза многих тканей организма. Тем не менее, функция глутаматных рецепторов в некоторых тканях и видах клеток, в частности, в лимфоцитах, остается неясной. Особенно интересным этот вопрос представляется в свете появившихся в последние годы сообщений об экспрессии глутаматных рецепторов в раковых клетках различных линий.
Как известно, в процессе развития нервной системы глутамат регулирует процессы пролиферации, миграции и выживания нейронов (Komuro Н., Rakic Р., 1993). Однако такие характеристики эмбриональных нейрональных клеток, как способность к пролиферации, миграция и регуляция инвазивного поведения посредством трофических факторов свойственны и другим клеткам организма, включая опухолевые (Welch D.R. et al., 1990). Поскольку различные компоненты глутаматной сигнальной системы обнаружены во многих тканях и органах, в науке формируется представление, что сигнализация, опосредуемая глутаматом, является важным биорегуляторным механизмом не только в ЦНС (Boldyrev А.А. et al., 2005). Учитывая, что исследования последних лет показали экспрессию глутаматных рецепторов и транспортеров в опухолевых клетках различного происхождения, можно предположить, что глутаматная система сигнализации также вовлечена и в процессы опухолевого роста (Kalariti N. et al., 2005).
В ряде работ показано, что антагонисты глутамата ингибируют пролиферацию опухолевых клеток (Rzeski W. et al., 2001; Yoo B.C. et al., 2004; Stepulak A. et al., 2005). Антагонисты AMPA- и NMDA-рецепторов оказывают концентрационно-зависимый антипролиферативный эффект на клетки опухолевых линий различного (в том числе, не-нейронального) происхождения (тиреоидной карциномы человека, карциномы легкого, аденокарциномы толстой кишки, карциномы молочной железы и т. д.), проявляемый в снижении темпов клеточного деления и увеличении процента мёртвых клеток. Более того, антагонисты ионотропных глутаматных рецепторов ингибируют миграцию и вызывают морфологические изменения опухолевых клеток, а также усиливают противоопухолевые действие цитостатических препаратов в довольно низких (микромолярных) концентрациях (Rzeski W. et al., 2001). Описанные эффекты антагонистов NMDA- и АМРА-рецепторов являются Са2+-зависимыми, поскольку опухолевые клетки оказались нечувствительны к действию лигандов в условиях кальциевой депривации.
Встраивание в мембрану и формирование функционально активного рецепторного комплекса
Считается доказанным, что усиление синаптических токов через NMDA-рецепторы, опосредуемое тирозин-киназами, играет важную роль в индукции LTP. Например, показано, что активация Src необходима для индукции LTP в СА1 пирамидальных нейронах: электрическая стимуляция, приводящая к развитию LTP, влечет за собой активацию Src, а снижение активации киназы в присутствии Src-блокирующего пептида ингибирует индукцию LTP (Lu Y.M. et al., 1998).
Показано, что эндогенные тирозиновые фосфатазы оказывают на NMDA-рецепторы влияние, противоположное действию, осуществляемому тирозиновыми киназами. Например, под воздействием ингибитора тирозин-фосфатазы наблюдается увеличение ионной проводимости канала (Wang Y.T. et al., 1996). Следовательно, тирозиновые киназы и фосфатазы изменяют активационные свойства NMDA-рецепторов, представляя собой дополнительные механизмы, обеспечивающие регуляцию активности ионных каналов в ответ на воздействие внешних стимулов. Таким образом, активность глутаматных рецепторов NMDA-класса, как и других клеточных рецепторов, находится под контролем различных внутриклеточных киназ и фосфатаз, оказывающих разнонаправленное (модулирующее) воздействие. Изменения в степени фосфорилирования белков NMDA-рецепторного комплекса, а также ассоциированных с ними (якорных и регуляторних) протеинов, в зависимости от степени синаптической стимуляции и определяемого ею притока ионов внутрь клетки, обеспечивает пластичные изменения в функционировании рецепторов и служит основой для регуляции длительности возбуждающих потенциалов.
Еще одним механизмом, регулирующим эффективность ответа NMDA-рецепторов, является модуляция процессов встраивания рецепторных субъединиц в плазматическую мембрану нейрональной клетки и формирования функционально активных рецепторов. Активация различных внутриклеточных ферментов (киназ и фосфатаз) приводит не только к описанным выше прямым изменениям активности рецепторов, но также к запуску либо, наоборот, блокированию процессов кластеризации и экстернализации рецепторных субъединиц на поверхности нейрональной клетки. Таким образом осуществляется регуляция плотности рецепторов в синапсе и, следовательно, обеспечивается пластичность нейротрансмиссии.
Как уже говорилось, под действием РКС происходит модуляция активности NMDA-рецепторов не только за счет увеличения проводимости канала, но и благодаря встраиванию новых молекул рецепторов в плазматическую мембрану (Lan J.Y. et al., 2001). Такая «косвенная» модуляция работы рецепторов посредством различных киназ, судя по всему, представляет универсальный механизм. В качестве примера можно привести модуляцию активности рекомбинантных NMDA-рецепторов под действием инсулина в экспериментах на Xenopus oocytes: стимуляция рецептора инсулина, представляющего собой тирозин-киназу, не приводит к непосредственному фосфорилированию тирозиновых остатков белков NMDA-рецепторного комплекса, однако стимулирует перемещение синтезированных рецепторных субъединиц посредством экзоцитоза и их встраивание в мембрану (Skeberdis V.A. et al., 2001b).
Удерживание в составе мембран эндоплазматического ретикулума (ЭР) является своеобразным «контролем качества» синтезируемых клеткой белков - механизмом, позволяющим блокировать экспрессию на клеточной поверхности протеинов, которые не были должным образом упакованы в процессе посттрансляционного фолдинга или не подверглись необходимой для формирования мультисубъединичного комплекса ассоциации с другими клеточными белками. Известно, что в случае одиночной экспрессии NR2, а также при экспрессии определенных сплайс-изоформ субъединицы NR1, они удерживаются в ЭР, что предохраняет от встраивания в мембрану не до конца сформированных рецепторных комплексов (Wenthold R.J. et al., 2003).
Существующие модели, описывающие процессы переноса субъединиц NMDA-рецепторов из эндоплазматического ретикулума к внешней мембране нейрональной клетки, строятся на основе общих представлений о биосинтезе и инсерции интегральных мембранных протеинов. После агрегации в эндоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи, трансмембранные белки упаковываются в транспортные везикулы, переносящие их к внешней мембране клетки, после чего везикулярные переносчики высвобождают свое содержимое путем слияния с плазматической мембраной (Craig A.M., Banker G., 1994). Далее переносимые белки могут быть стабилизированы в мембране за счет взаимодействий с якорными белками и белками цитоскелета, что предотвращает их эндоцитоз (Roche K.W. et al., 2001). В нейронах целый ряд внутриклеточных протеинов, включая белки семейства мембран-ассоциированных гуанилат-киназ (MAGUKs), х-актинин, кальмодулин и др., связываясь с С-концом субъединиц NMDA-рецепторного комплекса, опосредуют их встраивание в мембрану, связывание с цитоскелетом, стабилизацию рецепторного комплекса и процессы синаптической организации (Zheng X. et al., 1999; Prybylowski К., Wenthold R.J., 2004).
Исследования процессов экзо- и эндоцитоза в регуляции функций рецепторов в синапсе наиболее интенсивно проводились для ионотропных глутаматных рецепторов АМРА-класса. Множественные исследования подтверждают, что синаптические АМРА-рецепторы подвергаются постоянной рециркуляции, при этом активация эндоцитоза может способствовать развитию LTD (longerm depression), а усиление процессов встраивания в мембрану - индукции LTP (longerm potentiation) (Luscher С. et al., 1999; Noel J. et al., 1999; Shi S.H. et al., 1999).
Ранее считалось, что, по сравнению с АМРА-рецепторами, рецепторы NMDA-класса являются достаточно стабильными компонентами нейрональной мембраны, и их число в синапсе не подвергается значительным флуктуациям. Тем не менее, в ряде работ было продемонстрировано, что различные экспериментальные манипуляции могут изменять число NMDA-рецепторов, экспрессируемых на клеточной поверхности (Prybylowski К., Wenthold R.J., 2004), вследствие чего сложилось представление, что их экспрессия in vivo также является пластичной. Недавние исследования показали, что NMDA-рецепторы в нейронах действительно подвергаются активным циклам эндо- и экзоцитоза, и, по оценкам авторов, в определенных условиях характерное время этого процесса может быть достаточно мало, порядка нескольких минут (Washbourne P. et al., 2004; Nakamichi N., Yoneda Y., 2005).
Таким образом, в нейронах локализация глутаматных рецепторов не является стабильной, завися от двух основных факторов: фосфорилирования рецепторных белков и взаимодействия их с другими внутриклеточными протеинами. Динамичное регулирование транспорта рецепторов, процессов встраивания в синаптическую мембрану и эндоцитоза обусловливает процессы синаптической организации и обеспечивает различные формы синаптической пластичности (Carroll R.C., Zukin R.S., 2002).
NMDA-рецептор и механизмы внутриклеточной сигнализации
Как говорилось выше, рецепторы NMDA-класса известны как рецепторы, играющие ведущую роль в патогенезе многих неврологических заболеваний, опосредуя экзайтотоксическое действие глутамата, поскольку «перегрузка» ионами Са + вследствие чрезмерной активации NMDA-рецепторов приводит к гибели нейронов (Khodorov B.I., 2004). При этом процессы, вызванные гиперактивацией глутаматных рецепторов, такие, как нарушение ионного гомеостаза, деполяризация митохондрий и рост АФК внутри клетки, являются общим звеном при развитии различных нейродегенеративных заболеваний, ишемии и травмы головного мозга. Однако негативное действие NMDA-рецепторов на неирональные структуры и их участие в окислительном повреждении мозга выходят за рамки нормальной физиологической активности данных рецепторов. В норме их работа обеспечивает адаптивные ответы нейронов, необходимые для формирования синаптической пластичности (Bliss T.V., Collingridge G.L., 1993) и нормального синаптогенеза (Yen L.H. et al., 1993).
Известно, что необходимым и достаточным условием для формирования синаптической пластичности в различных отделах мозга является усиление постсинаптических кальциевых токов. При этом в подавляющем числе синапсов, поддерживающих LTP, постсинаптический рост кальция обеспечивается работой именно NMDA-рецепторов (Lynch М.А., 2004). В регуляции длительности возбуждающих потенциалов участвует огромное число внутриклеточных молекул, в том числе различные протеинкиназы и фосфатазы (Grant S.G., 2003). Это объясняет, почему активация NMDAR в синапсе способна вызывать диаметрально противоположные эффекты, приводя в некоторых случаях к развитию подавления (Long term depression, LTD), а не усиления (Long term potentiation, LTP) длительности возбуждающего сигнала (Lynch M.A., 2004).
Несмотря на сложность и огромное число внутренних связей, все эти процессы являются кальций-зависимыми. Ряд из них опосредован кальмодулином, небольшим кальций-связывающим белком, активирующим фосфатазу кальцинейрин, нейрональную NO-синтазу (nNOS), Са2+/кальмодулин-зависимую киназу САМК II типа и другие белки. САМК II типа представляет собой один из основных «downstream» эффекторов NMDA-рецепторов, роль которого в индукции LTP известна уже давно (Malenka R.C. et al., 1989). Активируясь вследствие притока кальция, САМК II типа опосредует дальнейшую передачу сигнала - фосфорилирование транскрипционного фактора CREB (cyclic АМР-responsive element-binding protein) и экспрессию генов раннего реагирования. Благодаря давно известному участию в синаптической пластичности и высокой степени экспрессии в мозге (1-2% всех нейрональных белков), этот фермент иногда даже называют «молекулой памяти» (Lynch М.А., 2004). Роль других кальций-зависимых ферментов, активирующихся вследствие активации NMDA-рецепторов, таких, как РКС, кальцинейрин, Src, в процессах синаптической пластичности в общих чертах также изучена (Dingledine R. et al., 1999; Lynch M.A., 2004). Обобщая имеющиеся литературные данные, можно заключить, что активация рецепторов NMDA-класса в нейронах приводит к запуску различных сигнальных каскадов и активации ряда митоген-активируемых киназ, МАРК (mitogen-activated protein kinase) -ферментов, действующих на множество субстратов в клетке и играющих критическую роль в процессах регуляции генов. Показано, что NMDA-рецепторы способны активировать разные типы МАРК в нейронах: ERK, JNK и р38-киназу (Xia Z. et al., 1996; Mukherjee P.K. et al., 1999; Rivera-Cervantes M.C. et al., 2004; Manabe S., Lipton S.A., 2003; Waxman E.A., Lynch D.R., 2005; Zhu D. et al., 2005). Считается, что ERK является важнейшим эффектором в сигнальных каскадах, активирующихся в ответ на митогенную стимуляцию и ведущих преимущественно к подавлению апоптоза, в то время как JNK и р38 активируются в ответ на различные стрессорные воздействия и участвуют в проапоптотических путях в различных типах клеток, в том числе в нейронах (Xia Z. et al., 1995). Действительно, в ряде работ показано, что активация ERK вследствие активации NMDAR обуславливает протекторное действие на нейроны (Manabe S., Lipton S.A., 2003; Zhu D. et al., 2005), в то время как активация стресс-чувствительных киназ (р38 и JNK) приводит к апоптозу и нейродегенерации (Mukherjee Р.К. et al., 1999; Rivera-Cervantes M.C. et al., 2004; Manabe S., Lipton S.A., 2003), хотя p38 также играет роль и в нормальной физиологической синаптической регуляции (Waxman Е.А., Lynch D.R., 2005).
Тот факт, что активация NMDA-рецепторов может оказывать протекторное, а не повреждающее, действие на нейрональные клетки, в последнее время обращает на себя особое внимание исследователей. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что NMDA-рецепторы участвуют в поддержании жизнеспособности незрелых нейронов in vitro (Balazs R. et al., 1988; Bhave S.V. et al., 1999; Marini A.M. et al.,1998; Rocha M. et al., 1999), при этом считается, что данный феномен имитирует глутаматергическую активацию нейронов in vivo, необходимую для их роста и развития. В ряде работ показано, что в основе анти-апоптотического действия NMDA на нейроны лежит усиление экспрессии нейротрофических факторов. В экспериментах, проводимых на гранулярных клетках мозжечка, показано, что аппликация NMDA приводит к усилению экспрессии нейротрофического фактора BDNF (brain derived neurotrophic factor), который оказывает аутокринное действие, ингибируя апоптоз (Bhave S.V. et al., 1999).
Более того, продемонстрировано протекторное действие NMDA при изучении устойчивости нейронов к экзайтотоксическому действию высоких (токсичных) концентраций возбуждающих аминокислот. Оказывается, что инкубация гранулярных клеток в присутствии субтоксических концентраций NMDA (Marini A.M. et al. 1998) или AMPA (Wu X. et.al., 2004) защищает нейроны от последующего токсического воздействия NMDA. При этом протекторное действие агонистов глутамата реализуется через усиление экспрессии BDNF. Аналогичная ситуация наблюдается в нейронах гиппокампа: инкубация с NMDA индуцирует секрецию BDNF, который, взаимодействуя с рецепторами к BDNF (TrkB, Tyrosine kinase В) на поверхности этих клеток, запускает каскады, ответственные за выживание клетки и усиление синтеза BDNF (Jiang X. et al., 2005). Таким образом, наблюдается аутокринная «петля», усиливающая начальный сигнал по принципу положительной обратной связи.
Протекторное действие NMDA-рецепторов в нейронах гиппокампа было подтверждено в экспериментах in vivo на моделях нейротоксичности, вызываемой другими экзайтотоксическими соединениями - каинатом (Ogita К. et al., 2003) и хинолиновой кислотой (Boeck C.R. et al., 2004). Более того, считается, что описанные модельные эксперименты in vitro в значительной степени отражают феномен прекондиционирования ишемии головного мозга, когда предварительное краткосрочное сублетальное ишемическое воздействие обеспечивает формирование резистентности к последующему ишемическому инсульту (Jiang X. et al., 2003). В экспериментах in vivo показано, что для реализации протекторного эффекта прекондиционирования необходимы активация NMDA-рецепторов (Kato Н. et al., 1992), ERK (Shamloo M. et al., 1999) и транскрипционного фактора NF-kB (Nuclear factor kappa B) (Blondeau N. et al., 2001; Ravati A., 2001).
Эти данные согласуются с результатами, полученными на гранулярных нейронах мозжечка, где протекторный эффект NMDA, как и BDNF, также реализуется через ERK-зависимый путь (Zhu D. et al., 2005) и активацию NF-kB (Lipsky R.H. et al., 2001). При этом под влиянием NMDA усиливается экспрессия антиапоптотических белков bcl-2 и ЬСІ-XL, что свидетельствует об участии NMDA-рецепторов в запуске сигнальных путей, ингибирующих апоптоз и сопутствующих выживанию нейрональных клеток (Zhu D. et al., 2005). Следует отметить, что описанные механизмы участвуют не только в подавлении апоптоза, но и в процессах регуляции длительности возбуждающих потенциалов в мозге (Haddad J.J., 2005). В пользу этой гипотезы говорят многочисленные данные об участии BDNF в синаптической пластичности, а также схожий характер распределения в мозге NMDA-рецепторов и рецепторов к BDNF (Jiang X. et al., 2005).
Влияние NMDA на хемилюминесценцию суспензии лимфоцитов периферической крови человека
Для объяснения столь явных функциональных различий авторы даже выдвинули гипотезу о существовании принципиально иных рецепторов к NMDA, возможно даже кодируемых неизвестными еще генами, нежели изученные NMDA-рецепторы в нейронах. Однако эта гипотеза не подтвердилась дальнейшими исследованиями, согласно которым NMDA-рецепторы, участвующие в мегакариоцитопоэзе, имеют такую же структуру и композиционный состав, что и в мозге (Genever P.G. et al., 1999). Наблюдаемые отличия касаются лишь степени гликозилирования рецепторного белка, которая в NMDA-рецепторах мегакариоцитов ниже, чем в мозге. Не исключено, что данная модификация играет важную роль в изменении рецепторных свойств: известно, что NMDAR, представленные в мозге, существенно различаются по своим фармакологическим свойствам и структуре, и чувствительность к коагонистам может быть снижена при определенном субъединичном составе рецептора, либо за счет посттрансляционных модификаций (Danysz W., Parsons C.G., 1998).
Десенсибилизация рецепторов также может быть причиной отсутствия чувствительности к глицину в исследуемой системе, поскольку глицин в довольно высоких концентрациях присутствует в плазме крови, и лимфоциты в норме постоянно находятся под действием этой аминокислоты.
Более того, явлением десенсибилизации могут объясняться довольно высокие концентрации NMDA (КґМ О" М в наших экспериментах), необходимые для активации клеток. Вполне возможно, что присутствие агонистов NMDA-рецепторов (глутамата и L-аспартата) в крови вызывает постоянную тоническую активацию рецепторов, и, как следствие, их десенситизацию. Как бы то ни было, вопрос о молекулярных механизмах, лежащих в основе наблюдаемых функциональных различий между NMDA-рецепторами, представленными на мембране тромбоцитов или лимфоцитов, и рецепторами в нейронах, требует дальнейшего изучения.
Следует также отметить, что полученные нами результаты позволяют предположить, что усиление люминол-зависимой люминесценции клеточной суспензии под действием NMDA, наблюдавшееся в предыдущей части работы, было опосредовано ростом продукции АФК внутри клеток. Это согласуется с данными, полученными при исследовании респираторного взрыва суспензии нейтрофилов (Caldefie-Che zet et al., 2002). Авторы цитируемой работы показали, что в их условиях усиление люминесценции в присутствии люминола хорошо коррелирует с ростом внутриклеточных АФК, измеряемых методом проточной цитометрии по интенсивности флуоресценции DCFH-DA.
Наличие корреляции в наших результатах, полученных при исследовании лимфоцитарной фракции с использованием двух независимых подходов -хемилюминесцентного анализа и флуоресцентного анализа методом проточной цитометрии - позволяет предположить, что в нашей системе люминол также является индикатором преимущественно внутриклеточного уровня свободнорадикальных соединений. Н.Э. Определение экспрессии мРНК к NR1 субъединице NMDA-рецепторного комплекса
Определение экспрессии мРНК, кодирующей субъединицу NMDA-рецептора, проводили методом обратной транскрипции (ОТ) и последующей ПЦР с нуклеотидными праймерами, специфичными к определенному участку искомой последовательности. Задачей проводимого исследования было обнаружение мРНК, кодирующей субъединицу NR1 NMDA-рецепторного комплекса в лимфоцитах человека. Поскольку NR1 является облигатной субъединицей NMDA-рецептора, ее экспрессия абсолютно необходима для формирования рецепторного комплекса. В качестве положительного контроля (ткани с высоким уровнем экспрессии NMDA-рецепторов) был взят мозжечок крысы. Такая постановка эксперимента накладывала определенные требования к дизайну праймеров: они должны быть универсальны, то есть в равной степени гомологичны к кДНК как крысы, так и человека. В связи с этим, выбор праймеров для ПЦР проводили на основании выравниваний различных сплайс-вариантов мРНК-NRl человека и крысы. Степень гомологии, определяемая как отношение числа парных совпадений к длине последовательности, для мРНК, кодирующей NR1, у данных видов составляет 89%.
Проведенный анализ показал наличие в пробах кДНК, полученной из лимфоцитов периферической крови человека, соответствующего продукта ПЦР длиной 282 п.о., что свидетельствует об экспрессии мРНК к NR1-субъединице (Рис. 16). Практически одновременно и независимо аналогичные результаты были описаны в литературе, где показали экспрессию мРНК к NR1 и №12-субъединицам в лимфоцитах человека (Miglio G. et al., 2005). Согласно этим данным, лимфоциты периферической крови конститутивно экспрессируют мРНК к субъединицам NR1 и NR2B, в то время как экспрессия мРНК к NR2A и NR2D детектируется только в активированных клетках, а мРНК к субъединице NR2C не обнаруживается. Поэтому, опираясь на их данные, мы не стали изучать экспрессию различных изоформ NR2-cy6ben,HHH4bi, хотя ее коэкспрессия с NR1 и является необходимым условием для формирования функционального рецепторного комплекса.
Поскольку функциональное значение экспрессии NMDA-рецепторов в лимфоцитах неизвестно, нас интересовало, изменяется ли уровень экспрессии мРНК к NR1 в результате активации клеток. Для этого клетки активировали растительным лектином ФГА (фитогемагглютинином), являющимся стандартным активатором лимфоцитов. Состояние ФГА-стимулированных лимфоцитов, а также клеток, инкубировавшихся в контрольных условиях, оценивали с помощью анализа ДНК методом проточной цитометрии. Для этого проводили фиксацию клеток 70% этанолом после 48 и 72 ч инкубации с последующей окраской йодидом пропидия.
Оказалось, что в процессе инкубации с ФГА (10 мкг/мл) наблюдается изменение морфологии клеток, о чем можно судить по изменению параметров светорассеяния («SS versus FS») в анализируемых пробах. Одновременно были обнаружены существенные изменения в содержании ДНК: сокращалось число клеток, находящихся в фазе Go/Gi клеточного цикла (диплоидная фракция, маркер М2 на Рис.14), и возрастал процент апоптотических клеток (маркер Ml). Увеличение по сравнению с контролем числа гиподиплоидных клеток в наших условиях является косвенным свидетельством их активации: стимуляция периферических мононуклеаров митогенами неизбежно приводит к запуску процесса апоптоза в части клеточной популяции, поскольку в обоих процессах задействованы общие внутриклеточные сигнальные системы.
