Введение к работе
Актуальность проблемы
Интактный мозг является иммунопривилегированным органом, где не обнаруживается лимфоузлов и не встречаются лимфоциты. Эта особенность мозга поддерживается за счет существования гематоэнцефалического барьера, который не дает клеткам иммунной системы мигрировать в мозг из кровотока. Более того, кроме астроцитов в ЦНС не встречаются другие клетки, способные презентировать молекулы МНС (Major Histocompatibility Complex) (Engelhardt, 1996; Sehgal and Berger, 2000). Однако, при развитии нейродегенеративных заболеваний это свойство, обеспечивающее стабильную работу ЦНС в нормальных условиях, грозит развитием аутоиммунных реакций (Gendelman, 2002).
Недавно в литературе появились данные о непосредственной регуляции функций иммунокомпетентных клеток со стороны нервной системы (Wrona, 2005). Эта регуляция может осуществляться как через эндокринную систему, включающую гормоны гипоталамуса (Munck and Guyre, 1991), так и через «симпатические пути» за счет иннервации лимфоидных органов (Shimizu et al., 1994). В осуществлении нормального «диалога» между нервной и иммунной системами большое значение имеют такие нейромедиаторы, как дофамин и ацетилхолин (Basu and Dasgupta, 2000; Pavlov et al., 2003; Saeed et al., 2005). В последнее время к ним относят и глутамат.
Глутамат является возбуждающим нейротрансмиттером мозга. Долгое время глутаматные рецепторы, в том числе и рецепторы NMDA-класса, обеспечивающие когнитивные процессы и память, считались специфическими маркерами нейрональной ткани. Однако в последнее время в литературе появились косвенные данные о том, что функционально активные NMDA-рецепторы могут присутствовать и в иммунокомпетентных клетках (Lombardi et al., 2001; Ganor et al., 2003). Вышеперечисленные факты поднимают вопрос о том, каким образом данный класс рецепторов может участвовать в функциональном ответе лимфоцитов и в их взаимодействии с нервной тканью.
В первую очередь это относится к патологическим состояниям, характеризующимся воспалительными процессами в ЦНС, к ишемии головного мозга, рассеянному склерозу, болезни Альцгеймера и гипергомоцистеинемии, -процессам, протекающим на фоне выраженного окислительного стресса. Общей чертой в развитии таких заболеваний является значительное повышение уровня свободного глутамата как в мозге и спинномозговой жидкости, так и в плазме крови, что приводит к нейрональной смерти вследствие развития
экзайтоксических механизмов (Carpenter, 2002), и привлечения лимфоцитов в очаг воспаления. В связи с вышесказанным, установление экспрессии NMDA-рецепторов в клетках иммунной системы и исследование их возможного участия в этих процессах является актуальной проблемой, имеющей значение для современной биохимии.
Целью данной работы явилось доказательство присутствия NMDA-рецепторов в лимфоцитах грызунов и человека и характеристика их функциональной активности.
Задачи исследования:
-
Используя ОТ-ПЦР, выявить экспрессию канальной NR1-субъединицы NMDA-рецептора в лимфоцитах.
-
Исследовать влияние N-метил-О-аспартата (NMDA) на уровень ионов кальция и продукцию активных форм кислорода (АФК) в лимфоцитах методом проточной цитометрии.
-
Выявить субпопуляции лимфоцитов, активируемых NMDA, с помощью флуоресцентно-меченых моноклональных антител к поверхностным маркерам (метод иммунофенотипирования) в сочетании с нагрузкой клеток флуоресцентным зондом на активные формы кислорода (АФК) - DCFH2-DA (2,7-дихлордигидрофлуоресцеин-диацетатом).
-
Оценить долю клеток в общей популяции лимфоцитов, презентирующих NMDA-рецепторы в норме и после их активации «in vitro» интерлейкином-2 (ИЛ-2) или фитогемагглютинином (ФГА).
-
Установить наличие NMDA-рецепторов на поверхности лимфоцитов, активированных «in vivo» в процессе спинномозговой травмы.
-
Исследовать влияние NMDA на продукцию интерферона-у различными субпопуляциями лимфоцитов, активированных «in vitro».
Научная новизна и практическая ценность работы
В настоящей работе охарактеризовано влияние агониста глутаматных рецепторов NMDA-класса, N-метил-О-аспартата, на лимфоциты периферической крови человека и крыс. В работе впервые установлено наличие в лимфоцитах периферической крови крыс мРНК, кодирующей основную белковую субъединицу NMDA-рецепторного комплекса (NR1). Методом проточной цитометрии было продемонстрировано, что под действием NMDA в Т-лимфоцитах и NK-клетках (natural killer cells) увеличивается уровень ионов Са2+, сопровождающийся возрастанием уровня АФК. Т-лимфоциты оказались
субпопуляцией, более чувствительной к NMDA по сравнению с NK-клетками, в то время как на продукцию АФК В-лимфоцитами NMDA действия не оказывал.
При помощи иммунофлуоресцентного окрашивания показано связывание
антител с внеклеточным доменом NMDA-рецепторного комплекса на мембране
лимфоцитов, а также усиление экспрессии этих рецепторов в результате
инкубации клеток, активированных интерлейкином-2 или
фитогемагглютинином в присутствии NMDA. В условиях индуцированного воспаления спинного мозга «in vivo» нами было показано, что Т-лимфоциты, мигрировавшие в очаг воспаления, презентируют NMDA-рецепторы на своей мембране. NMDA отрицательно влияет на реактивную способность лимфоцитов, препятствуя синтезу интерферона у (IFN-y) в субпопуляциях NK-клеток и Т-лимфоцитов.
Полученные результаты расширяют представления об экспрессии и функции NMDA-рецепторов в клетках иммунной системы, и позволяет предполагать участие этих рецепторов в регуляции иммунного ответа.
Апробация работы
Результаты исследований были доложены на XXI международном конгрессе "Молекулярные основы неврологических и психиатрических заболеваний" (Словакия, Мартин, 2006 г.), на XXIX ежегодном собрании Японского нейрохимического общества (Япония, Киото, 2006 г.), на Всероссийской нейрохимической конференции в Санкт-Петербурге (сентябрь 2008 г.). Апробация работы прошла в лаборатории клинической и экспериментальной нейрохимии Научного центра неврологии РАМН (февраль 2010 г.) и на кафедре биохимии МГУ имени М.В. Ломоносова (сентябрь 2009 г.).
Публикации
Материалы диссертации отражены в 8 публикациях.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, включающей описание материалов и методов (2 главы), результатов исследования и их обсуждения (7 глав), Заключения и Выводов. Диссертация изложена на 114 стр. печатного текста, содержит 32 рисунка и 3 таблицы. Список литературы включает 424 наименования.
