Введение к работе
Актуальность темы исследования. Нейромедиаторы традиционно рассматриваются в качестве молекул, секретируемых нервными окончаниями и влияющих на те или иные функции нервных клеток. Вместе с тем появляется все больше доказательств функционирования нейромедиаторной системы глутамата на периферии (Gill, 2001).
На сегодняшний день в клетках иммунной системы обнаружены оба класса глутаматных рецепторов - метаботропные и ионотропные (mGluR и iGluR), а также система транспортеров медиатора в клетку из внешней среды (Pacheco, 2007). Полагают, что глутамат играет определенную роль в иммунорегуляции в качестве нейро-иммуномедиатора (Levite, 2012). Считается, что глутамат, связываясь с метаботропными и ионотропными рецепторами на мембране иммунокомпетентных клеток, принимает участие в регуляции пролиферации (Lombardi, 2004), секреции цитокинов, в механизмах дифференцировки субпопуляций Т-хелперов (Gao, 2011), в контроле клеточного цикла и апоптоза (Lombardi, 2001), изменения мембранного потенциала клеток (Poulopoulou, 2005), в усилении образования свободных радикалов (Boldyrev, 2004), в интегрин - опосредованной адгезии к гликопротеинам экстраклеточного матрикса (Ganor, 2003). На наш взгляд, заслуживают внимания данные об участии iGluR и mGluR в регуляции кальциевого гомеостаза в активированных Т-клетках (Lombardi, 2001; Miglio, 2005). Между тем, на данный момент имеются лишь единичные работы, в которых показана экспрессия субъединиц NMDA-рецепторов в иммунокомпетентных клетках (Miglio, 2005; Kvaratskhelia, 2009; Mashkina, 2010). В основном авторы ограничиваются тем, что демонстрируют представленность только GluNl-субъединицы. Однако известно, что функционально-активные NMDA-рецепторы формируются в результате ассоциации GluNl-субъединицы с представителями GluN2- и/или GluN3-семейств. Таким образом, вопрос о субъединичном составе NMDA-рецепторов в Т-лимфоцитах человека на данный момент остается открытым. Кроме того, несмотря на накопленный экспериментальный материал, механизмы стимуляции и регуляции активности NMDA-рецепторов в Т-лимфоцитах остаются в значительной степени не изученными. Цель и задачи исследования. Цель данной работы - исследование структуры NMDA-рецепторов и их роли в регуляции функций Т-лимфоцитов человека. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Идентифицировать и локализовать субъединицы NMDA-рецепторов в Т- лимфоцитах человека;
-
Изучить возможное участие NMDA-рецепторов в механизмах депо -
9-І-
зависимого входа Са в Т-лимфоциты;
3. Изучить вклад NMDA-рецепторов в регуляцию пролиферации, прогрессии
клеточного цикла и апоптоза Т-лимфоцитов, активированных через Т-клеточный комплекс;
-
Исследовать вовлеченность NMDA-рецепторов в регуляцию процесса дифференцировки Т-лимфоцитов и секреции цитокинов;
-
Выявить пути сигнальной трансдукции, сопряженные с NMDA-рецепторами Т-лимфоцитов человека.
Научная новизна. В работе впервые проведено комплексное исследование субъединичного состава NMDA-рецепторов в Т-лимфоцитах человека. С применением трех методических подходов идентифицированы и локализованы субъединицы NMDA-рецепторов в этом типе клеток. Показано, что при активации Т-лимфоцитов происходит изменение субъединичного состава NMDA-рецепторов: GluNl/GluN2B и/или GluN2D в нестимулированных клетках на GluNl/GluN2A и/или GluN2B в TCR-стимулированных Т-лимфоцитах. Установлено, что NMDA-рецепторы
9-І-
являются компонентами депо - зависимого входа Са в Т-лимфоциты. Показано участие глутаматных рецепторов NMDA подтипа в регуляции апоптоза и клеточного цикла активированных Т-лимфоцитов. Впервые выявлена вовлеченность NMDA-рецепторов в регуляцию пролиферативного ответа Т-лимфоцитов при активации последних через Т-клеточный комплекс. Проведенные исследования дополнили имеющиеся сведения об участии NMDA-рецепторов в контроле секреции про- и противовоспалительных цитокинов и регуляции процесса дифференцировки Т-лимфоцитов. В работе впервые охарактеризованы протеинкиназные каскады, участвующие в передаче сигнала от NMDA-рецепторов в клетках иммунной системы. Научно-практическая значимость. Работа посвящена исследованию фундаментальной проблемы - изучению механизмов нейроиммунного взаимодействия. В ходе выполнения данной работы получены новые данные о структуре NMDA-рецепторов Т-лимфоцитов человека и их участии в механизмах регуляции ключевых функций иммунокомпетентных клеток, что позволяет, по крайней мере, частично, выявить общие закономерности взаимодействия нервной и иммунной систем. Расшифровка механизмов этого взаимодействия имеет как фундаментальное, так и прикладное значение, связанное, главным образом, с совершенствованием диагностики и формированием новых подходов к фармакотерапии воспалительных нейродегенеративных заболеваний. Кроме того, изучение механизмов активации и регуляции NMDA-рецепторов в Т-лимфоцитах человека позволяет расширить теоретические знания об особенностях сигнализации в электрически невозбудимых клетках.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на XIV Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - Наука
XXI века" (Пущино, 2010), II Всероссийской школе-конференции молодых ученых по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2011), Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011, 2013), III Съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2012), V Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Непостоянство генома» (Звенигород, 2012), IV Международной научно-практической конференции «Проблемы современной биологии» (Москва, 2012), XXV Международной зимней молодёжной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2013), VI Российском Симпозиуме «Белки и пептиды» (Уфа, 2013), 38-м Конгрессе Федерации европейских биохимических сообществ «Биологические механизмы» (Санкт-Петербург, 2013). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе, 1 статья в журнале из перечня ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (глава 3-6), заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 234 наименования, в том числе 229 работ иностранных авторов. Работа изложена на 152 страницах и содержит 27 рисунков и 7 таблиц.
Благодарности. Автор благодарит сотрудников лаборатории молекулярной фармакологии и иммунологии ИБГ УНЦ РАН к.б.н. Салимгарееву М.Х., аспирантов Фаткуллину У.Ш. и Кудоярова Э.Р. за помощь при выполнении и обсуждении работы.
