Введение к работе
Актуальность темы.
В настоящее время достигнут значительный прогресс в исследовании эегуляции клеточного метаболизма. В то же время, механизмы регуляции и ізаимодействия многих важных метаболических систем в клетке остаются не існьши. Это относится даже к такому важному внутриклеточному параметру, сак концентрация аденозин 5'-трифосфата (АТФ). Концентрация АТФ останавливается в результате взаимодействия энергетического метаболизма и метаболизма аденилатов. Энергетический метаболизм обеспечивает ізаимопревращение между АТФ, аденозин 5'-дифосфатом (АДФ) и аденозин 5'-юнофосфатом (АМФ), определяя энергетический заряд клетки АТФ+0,5АДФ)/(АТФ+АДФ+АМФ). За счет регуляции энергетического іетаболизма достигается хорошая стабилизация энергетического заряда во всех глетках. Метаболизм аденилатов определяет величину пула аденилатов -АТФ+АДФ+АМФ) - и концентрацию АТФ, уровень которого в клетках разных 'ішов сильно различается. Более того, у разных индивидуумов концентрация ^ТФ в клетках одного типа также может значительно различаться. Причины тих различий до сих пор не ясны, более того, до конца не известна роль іетаболизма аденилатов в регуляции внутриклеточной концентрации АТФ. Таким образом, изучение регуляции метаболизма аденилатов имеет важное начение для понимания общих принципов регуляции энергозависимых іроцессов в клетке.
Человеческие эритроциты являются удобным объектом для изучения іетаболизма аденилатов, который в эритроцитах млекопитающих не связан с интезом и гидролизом нуклеиновых кислот. Весьма вероятно, что его задачей івляется исключительно регуляция внутриклеточных концентраций аденилатов, і в первую очередь, АТФ. Метаболизм аденилатов в эритроцитах человека строен довольно просто. Он включает два пути синтеза АМФ (из аденина и іденозина) и два пути разрушения АМФ (через АМФ-дезаминазную и пурин 5'-іуклеотидазную реакции). Перераспределение между АМФ и другими щенилатами (АДФ и АТФ) катализируется высокоактивной аденилаткиназой.
Имеющиеся теоретические данные (Атауллаханов и др., 1996, Комарова 996) указывают на важную роль ферментов, катализирующих разрушение АМФ і регуляции пула аденилатов в эритроцитах. Результаты, полученные на
4 выделенных из эритроцитов АМФ-дезаминазе и пурин 5'-нуклеотидазе демонстрируют сложную кинетику этих ферментов, однако, могут не отражать реального их поведения в целой клетке. Во-первых, в процессе очистки свойства ферментов могут меняться, во-вторых, при исследовании выделенного фермента может быть не учтено влияние каких-либо эффекторов, присутствующих в целом эритроците. Подтверждением этому может служить то, что, скорость работы выделенной АМФтдеЗаминазы при физиологических концентрациях АМФ, в присутствии всех известных эффекторов (Almaraz L. et al 1988, Вис Н. A. et al 1986, Ogasawara N. et al 1986, Yun, S.-L. et al 1978), оказывается в несколько раз выше, чем скорость разрушения АМФ, наблюдаемая в нативных эритроцитах (Bontemps F. et al. 1986, Marlewski M. et al 1991, Paglia D.E. et al 1986, Van den BergheC.etal 1988,1990).
Таким образом, представляет интерес исследование кинетики разрушения АМФ в условиях, наиболее приближенных к внутриклеточным.
Цель работы.
Экспериментальное и теоретическое исследование механизмов регуляции метаболизма аденилатов в эритроцитах человека, а так же принципов взаимодействия метаболизма аденилатов и энергетического метаболизма клетки.
Задачи работы.
-экспериментальное исследование взаимосвязи между метаболизмом аденилатов и энергетическим метаболизмом в интактных эритроцитах человека и в эритроцитах с измененным энергетическим зарядом;
-изучение кинетики ферментов разрушающих АМФ (АМФ-дезаминазы и пурин 5'-нуклеотидазы) в гемолизатах эритроцитов человека;
-исследование влияния известных низкомолекулярных эффекторов на кинетику разрушения АМФ в гемолизатах эритроцитов;
-построение математической модели метаболизма аденилатов, опирающейся на полученные экспериментальные данные о кинетике ферментов, разрушающих АМФ.
Научная новизна.
-показано, что за счет активации метаболизма аденилатов при увеличении проницаемости клеточной мембраны для катионов улучшается стабилизация концентрации ионов в эритроците;
-получена зависимость скорости разрушения АМФ от концентрации АМФ в гемолизате эритроцитов человека, причем эта скорость при физиологических концентрациях АМФ, соответствует литературным данным о скорости работы этого фермента в нативных эритроцитах;
-показано существование продуктной активации АМФ-дезаминазы инозин монофосфатом (ИМФ), причем эта активация пропадает при диализе гемолизата;
-показано, что ИМФ способен, по крайней мере частично, снимать ингибирующее действие ортофосфата на АМФ-дезаминазную реакцию;
-с помощью математического моделирования показано, что введение продуктной активации АМФ-дезаминазы за счет ИМФ практически не влияет на метаболизм эритроцита при нормальных условиях, однако, значительно ускоряет гибель клетки при нагрузках на энергетический метаболизм, превышающих предельно допустимые значения;
-разработана новая методика хроматографического определения иуклеотидов, нуклеозидов и оснований, позволившая проводить одновременное измерение концентраций этих компонентов в метаболической смеси.
Научно-практическая ценность.
Исследование системы метаболизма аденилатов позволяет лучше понять механизмы регуляции уровня АТФ в клетке. Это может иметь практическую ценность при разработке новых методов хранения донорской крови. Результаты работы найдут применение в биохимии, биофизике и клеточной физиологии. Кроме того, они могут пригодиться в медицине при диагностике заболеваний, :вязанных с нарушением нормального функционирования АМФ-дезаминазы и іурин 5'-нуклеотидазы. Результаты работы используются в курсе лекций 'Регуляция клеточного метаболизма", читаемом на физическом факультете МГУ трофессором Ф.И.Атауллахановым.
Предложенная методика хроматографического определения концентраций іуклеотидов, нуклеозидов и оснований в перхлорных экстрактах позволяет :низить материальные затраты на проведение подобного измерения.
Апробация работы состоялась 9 октября 1997 г. на заседании проблемной сомиссии "Консервирование клеток крови, ее компонентов и костного мозга; іиохимия, биофизика крови" в Гематологическом научном центре РАМН.
Материалы диссертации докладывались на конференциях: Bio Thermo Cinetics of The Living Cell (1996, Лувьян-Ла-Нев, Бельгия), XI Meeting of the Eur.
Assoc, for Red Cell Research (1997, Гозд-Мартулек, Словения), 2-ой Биохимический конгресс (1997, Москва, Россия), Purines (1997, Нью Орлеан, США).
Публикации. Материалы диссертации изложены в 4 публикациях.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на f2 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 - обзора литературы, главы 2 - описания материалов и методов исследования, глав 3, 4, основного текста), обсуждения результатов, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего 112 источников.
