Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Функциональная активность эритроцитов в различных физиологических и патологических состояниях (обзор) 11
1.1. Эритроцитарные популяции в условиях гипоксии и лактоацидоза 11
1.2. Действие условий окислительного стресса и реоксигенатдии. 15
1.2.1. Окислительное повреждение эритроцитарной мембраны 19
1.2.2. Окислительное повреждение гемотрбина 21
1.2.3. Система антирадикальной защиты эритроцитов 23
1.3.Метаболическое состояние эритроцитов в условиях гипо- и гипергликемии 28
1.3.1. Метаболические системы эритроцитарных клеток 28
1.3.2. Состояние эритроцитов в условиях гипогликемии и хранения крови 30
1.3.3. Гипергликемия. Состояние эритроцитов в условиях гипергликемии 31
1.4. Воздействие химических соединений и лекарственных препаратов на эритроцитарные клетки 33
1.4.1. Действие нитританионов и лекарственных препаратов, содержащих нитрогруппировки , .34
1.4.2. Действие других лекарственных и химических веществ на эритроциты 37
1.5. Механизмы разрушения эритроцитов в норме и патологии 38
1.5.1. Внутрисосудистый гемолиз эритроцитов 38
1.5.2. Апоптоз эритроцитов млекопитающих 39
Глава 2. Материалы и методы 42
2.1. Материалы исследований 42
2.2. Методы исследований 44
2.2.1. Модельные исследования in vitro 44
2.2.2. Методы определения показателей 52
Глава 3. Процессы дестабилизации эритроцитарных популяций в условиях лактоацидоза и действия различных химических и лекарственных препаратов 63
3.1. Воздействие избытка молочной кислоты на эритроциты 63
3.2. Действие нитротанионов на эритроциты в условиях лактоацидоза и без него 68
3.3. Функциональная активность эритроцитарных популяций в условиях лактоацидоза на фоне гипо- и гипергликемии 75
3.4. Состояние эритроцитов в условиях действия р-блокаторов, антагонистов кальция в сочетании с лактоацидозом 90
3.5. Действие триметазидина на эритроциты в условиях лактатной модели и хранения крови 98
3.6. Действие доноров SH- групп в условиях энергодефицита, лактоацидоза и действия нитритов 106
3.7. Действие М-(2-оксиэтил)амид-цис-9-октадеценовой кислоты (олеоилэтаноламина) на цельную кровь и эритроциты человека 114
3.8. Действие олеоилэтаноламина на эритроциты в условиях умеренного лактоацидоза 117
3.9. Влияние N-адамантаноил- и N-адамантиламинокислот 119
Глава. 4. Механизмы дестабилизации популяций эритроцитов в условиях гипоксии и лактоацидоза in vivo 123
4.1. Состояние эритроцитарных популяций при ишемической болезни сердца 123
4.2. Состояние эритроцитарных популяций в условиях анемии 125
4.3. Процессы дестабилизации клеток в ходе физических нагрузок у практически здоровых и больных ИБС 128
Глава. 5. Состояние эритроцитарных популяций в условиях окислительного стресса и реоксигенации 137
5.1. Влияние окислительного стресса in vitro на эритроциты 137
5.2. Действие М-(2-оксиэтил)амид-цис-9-октадеценовой кислоты (олеоилэтаноламина) в условиях окислительного стресса 142
5.3. Обнаружение коротких пептидов в эритроцитах в условиях окислительного стресса 146
5.4. Изучение влияния условий реоксигенации на состояние эритроцитов in vivo 147
Глава. 6. Механизмы дезинтеграции эритроцитов человека в различных условиях функционирования (обсуждение результатов) 155
6.1. Механизмы дезинтеграции эритроцитов в условиях гипоксии и лактоацидоза 155
6.2. Механизмы повреждения эритроцитов в условиях действия лекарственных и химических препаратов 166
6.3. Механизмы дезинтеграции эритроцитов в условиях гипс- и гипергликемии 170
6.4. Дестабилизация эритроцитов при действии р-блокаторов и антагонистов кальция в условиях гипоксии, лактоацидоза, энергодефицита и гиперадреналинемии 175
6.5. Влияние триметазидина и Ы-(2нэксиэтил)амид-цис-9-октадеценовой кислоты на скорость дестабилизации эритроцитарных клеток в условиях гипоксии и лактоацидоза 178
6.6. Механизмы дезинтеграции эритроцитов в условиях окислительного стресса и реоксигенации 183
6.7. Действие Ы-(2-оксиэтил)амид-цис-9-октадеценовой кислоты на фоне окислительного стресса 189
6.8. Генерация коротких пептидов в условиях гипоксии и окислительного стресса 192
Заключение 195
Выводы 204
Практические рекомендации 207
Список литературы 209
Приложения .235
- Система антирадикальной защиты эритроцитов
- Воздействие избытка молочной кислоты на эритроциты
- Процессы дестабилизации клеток в ходе физических нагрузок у практически здоровых и больных ИБС
- Механизмы дезинтеграции эритроцитов в условиях окислительного стресса и реоксигенации
Система антирадикальной защиты эритроцитов
Компоненты нативной эритроцитарной мембраны эффективно защищены от неферментативного ПОЛ самой структурной организацией мембраны, наличием в ней антиоксидантов, а также ферментными системами, регулирующими концентрацию активных форм кислорода (АФК) [11,20,37,65,153]. Особенностями структурной организации мембраны, обеспечивающими некоторую защиту от АФК и продуктов ПОЛ следует считать расположение в поверхностном монослое трудноокисляемых фосфолипидов и большей части холестерина, а так же возможность быстрого обмена окисленных липидов с липидами плазмы крови. К ферментам антиоксидантной системы эритроцитов относятся ферменты, утилизирующие АФК и восстанавливающие гидроперекиси. Количество эритроцитарной СОД в 10 раз превосходит концентрацию, достаточную для полной дисмутации супероксида [303]. Такое количество фермента (как впрочем и многих других) может быть объяснено низкой стабильностью ферментного белка с одной стороны [72,129,257,303] , невозможностью обновления из-за отсутствия систем синтеза, с другой. Образующаяся при дисмутации , а также в других процессах перекись водорода, подвергается разложению с помощью эритроцитарной каталазы и глутатионпероксидазы. Из эритроцитарных ферментов каталаза занимает первое место по количеству и активности. Роль такого количества и высокой каталитической активности эритроцитарной каталазы в клетках, не имеющих значительного уровня оксигеназных процессов, еще далеко не выснена [124,132]. Известно, что эндогенная перекись водорода используется в первую очередь пероксидантными системами эритроцитов, в частности, глутатионпероксидазой [17].
Гель-хроматографически выявляется четыре активных фракции каталазы эритроцитов человека: К1, К2, КЗ, К4. Фракция К1 гомогенна, а фракции К2, КЗ, К4 содержат белок, электрофоретическая подвижность которого соответствует гемоглобину. Во фракциях К2-К4 обнаруживаются max пики поглощения при длинах волн 414, 541, 570 нм, что соответствует оксиформе гемоглобина. Комплекс каталазы с гемоглобином во фракции К2-К4 достаточно прочен, особенно во фракции КЗ, где связь не разрывается даже при наложении электрического поля [124]. Во всех фракциях ферменты представлены множественными конформерами, отличающимися оптимумами рН, электрофоретической подвижностью, количеством свободных сульфгидрильных фупп [124,132]. Предполагается, что структурные и кинетические различия отдельных молекулярных форм каталазы связаны с различной локализацией их в эритроцитах и с некоторыми особенностями их физиологических функций. В постгемолитическом остатке также содержится особая молекулярная форма каталазы [132]. Возможно, что физиологическая функция связанной с мембраной формы каталазы, заключается в защите от эндогенной перекиси водорода.
В самом эритроците всегда присутствует перекись водорода в концентрации около 10_7М. Каталаза совместно с глутатионпероксидазой конкурирует за субстрат, а также принимает участие в метаболизме формиата. Предполагается, что такими свойствами обладает форма каталазы, которая не связана ни с мембраной, ни с гемоглобином и идентифицирована как фракция К1. Каталаза, связанная с гемоглобином, возможно, принимает участие в процессах оксигенации и необходима для разложения Н2О2, образующейся при переходе оксигемоглобина в метгемоглобин [132]. При изучении гетерогенности каталазы, данные поставили под сомнение вероятность существования настоящих изоформ (изменение условий элюирования, замена кислорода на азот приводит к объединению фракций) и позволяют расматривать их как лабильные формы , отличающиеся конформацией молекул и изменением состояния сульфгидрильных фупп в структуре. Вполне возможно, что генетическое происхождение всех форм едино, но участки локализации фермента в зрелых клетках и его связи в комплексе с гемоглобином, метгемоглобином и другими ферментными системами эритроцитов ведут к дифференциации свойств с соответствующей перестройкой в структуре молекул фермента.
В лизатах эритроцитов обнаружены три формы каталазы, обозначаемые I, II, III. Основная масса фермента представлена формами I и И, которые по-видимому, могут переходить одна в другую при соответствующих условиях только частично. Форма III локализована в строме и сосредоточена в основном у поверхности клеток. Роль этой формы скорее всего связана с частичной метгемоглобинизацией молекул гемоглобина, преобретающего при этом повышенное сродство к молекулярному кислороду [132]. Авторами была предложена схема участия каталазы в процессах транспорта кислорода эритроцитами [132 ].
Перекись водорода также утилизируется в глутатионпероксидазной системе цитозоля эритроцитов [17]. Глутатионпероксидаза катализирует восстановление перекиси водорода за счет окисления глутатиона, а также неспецифически превращает различные гидроперекиси, в том числе липидные в оксипроизводные, фермент содержит в активном центре атом селена [65].
В мембранах и цитозоле эритроцитов также содержится фермент, неспецифически восстанавливающий одноэлектронные окислители, подобные феррицианиду [278]. Установлено, что значительная часть мембранного фермента находится в латентной форме и переход его в активную зависит от скорости производства гидроперекисей [68,278].
Участие метформы гемоглобина в процессе активации ПОЛ не представляет сомнения, поэтому целесообразно рассматривать метгемоглобинредуктазную систему как компонент антиокислительной системы эритроцитов. Восстановление метгемоглобина в физиологических условиях, при которых ежедневно окисляется около 3% гемоглобина, практически полностью осуществляется НАДН-зависимой метгемоглобинредуктазой. В данном случае в качестве источника НАДН используется гликолитический процесс [16,17]. Схема ферментной системы восстановления гемоглобина в эритроцитах представлена на рис. 1.2.
К неферментативным компонентам АОЗ эритроцитов можно отнести глутатион, а-токоферол, аскорбиновую кислоту [17,179]. Глутатион - главный компонент резервной восстановительной системы, обеспечивающий структурно-функциональную целостность эритроцита. Данный трипептид, содержащий свободную SH-группу, участвует также в переносе ацильных групп. Сохранение глутатиона в восстановленном состоянии необходимо для предохранения ряда ферментов от инактивации, ограждения мембраны клетки от действия перекисей и гемоглобина от окислительного денатурирования [246]. Окисленный глутатион восстанавливается в глутатионпероксидазной системе, а также с помощью НАДН и НАДФН-зависимых глутатионредуктаз [17,179,246].
сс-Токоферол благодаря специфическому взаимодействию между собственной боковой фитильной группой и жирнокислотными цепями фосфолипидов мембран способен приводить к более плотной упаковке липидов и уменьшению проницаемости мембран для активных форм кислорода (АФК). Кроме того, а-токоферол защищает биомембраны от повреждающего действия свободных жирных кислот за счет комплексования с ними и уменьшает скорость ПОЛ путем нейтрализации АФК и пероксидных радикалов липидов [48,197].
Все компоненты АОЗ эритроцитов взаимосвязаны и возможно подвергается тонкой регуляции. Активность и стабильность некоторых ферментов взаимозависимы: известно, что супероксидный анион подавляет активность каталазы и глутатионпероксидазы, а пероксид водорода фрагментирует СОД и инактивирует глутатионредуктазу. Образующийся в ходе свободно радикальных процессов пероксидныи радикал НО , с высокой эффективностью разрушает практически все белки, поэтому необходимо согласованная работа всех ферментов АОЗ. Механизмы инактивации-активации таких ферментов, как СОД и КТ, еще до конца неизвестны. Является ли вся эритроцитарная СОД активной в нативном эритроците и постепенно инактивируется в ходе катализа или для нее возможно наличие перехода из латентной формы в активную через ограниченный протеолиз за счет специфической протеазы и протеинкиназы, как это происходит в гепатоцитах?[82,135]. Каковы причины и механизмы переходов гетерогенных форм каталазы? Эти вопросы пока остаются открытыми. Точно неустановлены еще и механизмы активации и роль НАДН-зависимого мембранного фермента, восстанавливающего гидроперекиси липидов. Предполагают, что исчерпание запасов этого фермента может играть роль в процессе старения и апоптознои гибели эритроцитов [283].
In vivo большое значение для АОЗ эритроцитов и их нормального функционирования имеют многие плазменные факторы, например, церулоплазмин. Он ингибирует образование супероксидрадикалов значительно сильнее, чем внутриклеточные защитные ферменты СОД и КГ, взятые в той же концентрации [200]. Переход от пероксид-аниона к перекиси водорода блокируется серусодержащими аминокислотами метионином, цистеином [163]. Хорошими ловушками радикалов являются алифатические спирты, ловушками перекисных радикалов - стероидные гормоны, убихинон, аскорбиновая кислота [163,302,313].
Воздействие избытка молочной кислоты на эритроциты
Нами было изучено воздействие избытка молочной кислоты в концентрациях 7,5, 10 и 20 мМ/л, что характеризует умеренный, сильный и очень сильный лактоацидоз [279J, на состояние эритроцитарных популяций in vitro с целью выяснения механизмов дестабилизации клеток в условиях лактоацидоза.
Действие молочной кислоты в различной концентрации сопровождается дозозависимым ростом содержания метформы гемоглобина (рис.3.2. Приложение 3. 1)(Р 0,01). Введение в инкубационную среду 7,5 мМ/л молочной кислоты сопровождается ростом содержания метгемоглобина на 61%, 10 мМ/л -на 100%, 20 мМ/л - на 140%. Синхронно растет доля мембраносвязанной фракции гемоглобина (рис.3.3. Приложение 3.1)(Р 0,01). Нарастание доли мембраносвязанного гемоглобина идет с меньшей скоростью, чем ускорение аутоокисления гемоглобина. Так в условиях лактоацидоза 7,5 мМ/л процент роста составляет 40%, увеличение содержания молочной кислоты до 10 мМ/л ведет к повышению процента мембраносвязанного гемоглобина на 60%, усиление лактоацидоза до 20 мМ/л сопровождается ростом мембраносвязанной фракции на 83%. Рост метформы в основном происходит за счет снижения оксигемоглобина, хотя достоверно уменьшение сродства гемоглобина к кислороду регистрируется только в условиях сильного ацидоза (рис.3.1. Приложение 3.1).
С увеличением концентрации молочной кислоты растет скорость химического окисления оксигемоглобина феррицианидом калия (рис.3.2. Приложение 3.1)(Р 0,01). Условия умеренного лактоацидоза 7,5 мМ/л ведет к ускорению химического окисления гемоглобина феррицианидом калия на 59% (Р 0,01), 10 мМ/л приводит к росту скорости окисления на 112%(Р 0,05), а сильный лактоацидоз 20 мМ/л сопровождается ростом химического окисления гемоглобина на 176%(Р 0,01).
Одной из главных причин ускорения процесса аутоокисления гемоглобина в условиях лактоацидоза является снижение сродства гемоглобина к кислороду за счет снятия ингибирования с 2,3 дифосфоглицератмугазы избытком протонов [172,248].
Процесс отдачи кислорода оксигемоглобином (ОКНв) сопровождается генерацией метформы гемоглобина. Однако в условиях быстрой ликвидации ионного дисбаланса активация метгемоглобинредуктазных систем восстанавливает избыток метгемоглобина (МетНв) и его процент не изменяется. Если избыток протонов действует значительный временной промежуток, а также, если степень закислення весьма высока, уход части 1,3 дифосфоглицерата постоянно в шунт Люберинга-Раппопорта, значительно снижает уровень производства АТФ в клетках, к тому же известен прямой эффект ингибирования молочной кислотой одного из ключевых ферментов гликолиза глицерапьдегидфосфатдегидрогеназы {186]. Это неизбежно приведет к снижению энергетического потенциала клетки, уменьшая возможности стабильной работы ферментативных систем клетки, в частности, метгемоглобинредуктазных систем, а также поддержания оптимальных липид-белковых взаимодействий в мембранных структурах, увеличивая мембранную проницаемость клеток. Действительно, в условиях лактоацидоза увеличивается мембранная проницаемость клеток для мочевины (Р 0,01), хотя дозозависимого изменения не наблюдается (рис.3.1. Приложение 3.2). Точнее, некоторое увеличение мембранной проницаемости мембран эритроцитов для мочевины можно отметить при увеличении степени лактоацидоза только в тенденции. Это может быть объяснено большими колебаниями показателя для каждой конкретной популяции клеток. Принцип метода основан на способности мочевины проникать сквозь поры или дефекты мембраны путем быстрой диффузии и, равномерно распределяясь во вне- и внутриклеточном пространстве, вызывать гемолиз [202]. Степень гемолиза зависит от скорости образования пор и скорости их репарации. Снижение энергетического потенциала клетки увеличивает скорость формирования мембранных дефектов, а скорость репарации во многом зависит от степени фосфорилирования спектрина, который связываясь с различными участками мембраны, стабилизирует липид-белковые взаимодействия и снижает скорость утечки ионов из клетки [179]. В условиях лактоацидоза снижается также устойчивость мембран эритроцитов к действию перекиси водорода (Р 0,01)(рис.3.3) и деформируемость клеток (Р 0,05) (рис.3.1. Приложение 3.2).
О дестабилизации клеточных мембран эритроцитов свидетельствуют изменения каталитических характеристик ферментов-маркеров. Значительный рост активности НАДН-феррицианидредуктазы (НАДН-цитохром Ь5-редуктаза) (Р 0,01)(рис.3.3. Приложение 3.2) связан с ускорением перехода латентной формы фермента в активную в условиях активации процессов производства гидроперекисей липидов, служащих естественным субстратом для фермента {68,253,278]. Однако дозозависимый рост феррицианидредуктазной активности наблюдается только до уровня лактоацидоза 10 мМ/л, дальнейшее увеличение содержания молочной кислоты сопровождается снижением активности фермента на 38% по отношению к предыдущей пробе (10 мМ)(рис.З.З.Приложение 3.2)(Р 0,01). Это может быть связано с использованием запасов латентной формы фермента в мембране и снижением активности за счет дестабилизации большей части клеток. Подобная ситуация наблюдается т vivo в условиях хронической гипоксии и лактоацидоза, когда популяция циркулирующих эритроцитов сильно повреждена (см. глава 4).
На происходящие конформационные перестройки в мембране эритроцита указывает возрастание активности 5 -нуклеотидаэы(Р 0,01)(рис.3.4. Приложение 3.2), для активации которой необходима определенная степень деградации липидного бислоя под действием фосфолипаз [207]. Параллельно наблюдается снижение каталитической активности Na+, К+-АТФ-зы(Р 0,01)(рис.3.4.
Приложение 3.2), что обусловлено неблагоприятным изменением белково липидного окружения фермента. Как возрастание активности 5 -нуклеотидазы, так и снижение активности Na+, К+-АТФ-зы зависит от степени лакгоацидоза, и с увеличением содержания молочной кислоты повреждения эритроцитарнои мембраны прогрессивно нарастают. Активации ПОЛ способствует снижение фоновой активности ферментов антирадикальной защиты: каталазы (КТ) и супероксиддисмутазы (СОД) (рис.3.4, Приложение 3.3). Кроме того, снижение активности этих ферментов обусловлено общей дезинтеграцией процессов в клетках.
Таким образом, увеличение содержания молочной кислоты в цельной крови сопровождается значительным ухудшением функционального состояния эритроцитов: возрастает скорость метгемоглобинобразования, нарастают процессы деградации фосфолипидов, ухудшаются каталитические характеристики ферментов антирадикальной защиты и систем регуляции клетки. В результате скорость поглощения эритроцитами глюкозы в присутствии молочной кислоты снижается с 20,00 0,31 мкМ/мин до 12,66±0,31 мкМ/мин, что будет приводить к дальнейшему снижению энергетического потенциала клетки.
Процессы дестабилизации клеток в ходе физических нагрузок у практически здоровых и больных ИБС
Дозированная физическая нагрузка сопровождается развитием эритроцитоза за счет выброса части клеток из кровяных депо (печень, селезенка) [57,110,112]. Часть клеток при этом, особенно у людей нетренированных, ведущих малоподвижный образ жизни уже в различной степени дестабилизированы , что ведет к быстрому разрушению и активации процессов эритропоэза [110,163,183]. Усиленные физические нагрузки ведут к развитию в крови состояния ацидоза за счет развития тканевой гипоксии, уровень молочной кислоты в плазме крови растет пропорционально мощности нагрузки [80,105,110], поэтому дозированная физическая нагрузка является хорошей моделью in vivo для изучения влияния гипоксии и лактоацидоза на скорость дестабилизации эритроцитарных клеток.
У нетренированных практически здоровых людей средняя толерантность к физической нагрузке составляет 150 Вт (средний возраст 47,20±3,5 лет)
До проведения нагрузочного теста эритроцитарная популяция из капиллярной крови у практически здоровых людей (ПЗЛ) характеризовалась преобладанием дезоксиформы гемоглобина над оксиформой (отношение -1,25), нормальным количеством метформы гемоглобина и мембраносвязанного гемоглобина сопоставимых с таковыми в венозной крови у доноров (рис. 4.9. Приложение 4.3). Содержание в плазме молочной кислоты составило 1,06±0,07 мМ/л, что также сопоставимо с таковым у доноров (рис. 4.9. Приложение 4.3).
На субмаксимальном уровне нагрузочного теста соотношение между окси/ дезоксисрормами гемоглобина у ПЗЛ не меняется, наблюдается рост метформы гемоглобина и тенденция к росту содержания мембраносвязанного гемоглобина, вероятно, за счет быстрой смены популяции эритроцитов в ходе перераспределительного эритроцитоза (рис.4.9.,4.10). Через 10 минут после окончания нагрузки отмечается снижение содержания дезоксиформы гемоглобина и увеличение оксигемоглобина , соотношение уменьшается до 1,17, сохраняется тенденция к росту метгемоглобина. В ходе теста наблюдается рост содержания молочной кислоты в крови на 265% , а через 10 минут после окончания процент снижения составляют 43%, содержание молочной кислоты выше исходного уровня на 106%.
Исследование активности ферментов, каталитическая функция которых зависит от состояния липидного микроокружения, показано, что у ПЗЛ не происходит существенного изменения популяций эритроцитов. Каталитическая активность НАДН-феррицианидредуктазы, ацетилхолинэстеразы, лактатдегидрогеназы остается на уровне донафузочных значений (рис.4.11,4.12 Приложение 4.3).
Таким образом, у ПЗЛ в условиях умеренного ацидоза, возникающего в ходе физической нафузки не наблюдается существенных изменений эритроцитарных популяций, свидетельствующих о появлении значительного числа поврежденных клеток.
Нами были также проведены исследования состояния эритроцитарных популяций в ходе ВЭП у больных ИБС, ССН II функционального класса, находящихся на амбулаторном традиционном лечении (нитропрепараты, метаболическая терапия). Средний возраст больных составил 50, 82+2,32 года, толерантность к физической нафузке - 90 Вт. При исследовании эритроцитов из капиллярной крови уровень метгемоглобинобразования оказался выше, чем у ПЗЛ на 78% (Р 0,05), доля мембраносвязанного гемоглобина не отличалось от таковой у ПЗЛ, содержание молочной кислоты было выше, чем ПЗЛ на 44% (Р 0,05). Популяция клеток характеризовалась более низкой фоновой способностью эритроцитарных гемолизатов восстанавливать феррицианид в присутствии НАДН (на 32 %; Р 0,01), увеличением содержания ДОК гемоглобина и уменьшение оксиформы гемоглобина ( отношение ДОК/OK становиться 1,44). Можно также отметить более низкую лактатдегидрогеназную активность эритроцитарных гемолизатов данной группы больных (рис.4.13-.4.16. Приложение 4.4).
Подобная характеристика свидетельствует о присутствии в циркулирующей популяции эритроцитов поврежденных клеток с дестабилизированной мембраной и низким уровнем скорости течения метаболических процессов. Популяция клеток ,полученная на субмаксимальном уровне нафузочного теста (90 Вт), отличалась дальнейшем снижением способности эритроцитарных гемолизатов восстанавливать феррицианид, ростом содержания метгемоглобина и мембраносвязанного гемоглобина, увеличением лактатдегидрогеназнои активности (рис.4.13 - рис. 4.16. Приложение 4.4).
В плазме крови наблюдали значительный рост содержания молочной кислоты (268% от исходного количества). Подавляющее число обследуемых в связи с развитием приступа стенокардии были вынуждены принять нитропрепараты. Возможно поэтому наибольшее изменение показателей фиксируется через 10 минут после окончания нагрузочного теста (рис. 4.13 -4.16). Снижается уровень оксигемоглобина в капиллярной крови за счет значительного роста метгемоглобина (239%) и мембраносвязанной фракции гемоглобина (152%). Исследования ферментативной активности показали снижение каталитической функции мембранной АХЭ эритроцитов. Подобные изменения свидетельствуют о резком ухудшении циркулирующих клеток, в популяции преобладают поврежденные эритроциты с ускоренным процессом аутоокисления гемоглобина, дестабилизированной мембраной, подлежащих элиминации. Содержание молочной кислоты в плазме крови возрастает на 300 %.
При проведении больным ИБС ССН II функционального класса традиционного лечения в стационаре (нитропрепараты, панангин, рибофлавин), их толерантность к физической нагрузке составила 115 Вт. Средний возраст больных составил 49,68±2,66 лет. В ходе нагрузки для исследований использовалась капиллярная кровь. До нагрузки эритроцитарная популяция характеризовалась преобладанием дезоксиформы гемоглобина над оксиформой (соотношение 1,61), высоким процентом содержания метформы гемоглобина и сопоставимым с ПЗЛ процентом мембраносвязанного белка. Клетки отличались небольшим снижением способности гемолизатов восстанавливать феррицианид в присутствии НАДН (15%) (Р 0,01), уменьшением фоновой активности ЛДГ (22%). Таким образом, в популяции преобладали клетки с ускоренным процессом метгемоглобинобразования (рис.4.17-4.20 Приложение 4.5). В плазме уровень молочной кислоты превышал таковой у ПЗЛ на 36%.
Механизмы дезинтеграции эритроцитов в условиях окислительного стресса и реоксигенации
Повреждающее, а также регулирующее действие активных форм кислорода (АФК), в настоящее время привлекает активное внимание многих исследователей [88,149,220,304]. Уровень производства АФК в клетках определяет их метаболическую и окислительную активность, скорость старения, гибели или пролиферации [149,220]. Активные формы кислорода производятся как в процессах оксигенации, то есть непосредственного участия кислорода, так и в условиях гипоксии, когда этот процесс вторичен и обусловлен избытком восстановленных эквивалентов при участии двухвалентного железа (Fe2+). Но наиболее значительным производство АФК кислорода становиться в условиях перехода от состояния гипоксии к нормоксии или гипероксии - при реоксигенации.
Эритроциты представляют собой клетку, где производство активных форм кислорода происходит постоянно и в большом количестве, так как с этим связано выполнение одной из главных функций -отдача кислорода. Это объясняет хорошо отлаженную систему антиокислительной защиты клеток; большое количество катапазы и супероксиддисмутазы, наличие глутатионредуктазной и глутатионпероксидазной систем [11,37,65,132,153,303], антиокислительная активность самого гемоглобина [231]. Однако хорошо защищенная от эндогенных АФК, эритроцитарная клетка повреждается и скорость старения клетки возрастает, если в среде функционирования активируются процессы свободно-радикального окисления.
Нами были изучены механизмы повреждения эритроцитов, инкубированных в условиях окислительного стресса, имитирующего условия гипоксии, при которой возникает избыток восстановленного железа (модель 1)[302], а также условия сочетающие избыток Fe2+ с переокисленными липопротеидами, наиболее способствующие развитию атеросклероза и ИБС (модель 2)[109].
Инкубация эритроцитов в течение 15-20 минут с инициаторами окисления показало, это сопровождается ускорением процессов аутоокисления гемоглобина: растет процент метгемоглобина, доля мембраносвязанного гемоглобина. Особенно интенсивно это происходит при воздействии Fe2+ совместно с желточными липопротеидами (ЖПП). Обе модели воздействия характеризуются снижением содержания оксигемоглобина, в большей степени во второй модели. О снижении сродства гемоглобина к кислороду и усилении окисления оксигемоглобина в метформу свидетельствует увеличение производства 2,3 ДФГ в условиях окислительного стресса. Ускоряется также и образование молочной кислоты, тогда как активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы снижается. Таким образом, в условиях окислительного стресса наблюдается уменьшение энергетического потенциала клеток за счет снижения производства АТФ, понижается количество восстановленных эквивалентов: НАДН, НАДФН. Действие инициаторов окисления на фракцию чистых эритроцитов приводит у ускорению процессов ПОЛ, при этом в мембранах клеток увеличивается содержание окисленных продуктов холестерина, диеновых коньюгатов, снижается антиокислительная активность эритроцитарных гемолизатов и активность каталазы.
Известно, что условия окислительного стресса сопровождаются активацией фосфолипазы Аг [88], что и приводит к образованию фосфолизинов и свободной арахидоновой кислоты и стимуляции производства окисленных продуктов жирных кислот, холестерина. Присутствие желточных липопротеидов не увеличивает скорость производства окисленных продуктов холестерина в мембранах эритроцитов по сравнению с действием одного двухвалентного железа. Это может быть обусловлено возможностью обменивать эритроцитами весь свой холестерин на холестерин внешних липопротеидов [27,60]. Эритроциты человека имеют рецепторы для связывания липопротеидов низкой плотности (ЛНП), взаимодействие с ними носит характер неионной адсорбции [41]. Окисление и расщепление фосфолипидов может приводить к нарушению рецепторного взаимодействия холестерина с эритроцитарной мембраной по принципу обратной связи [60], и уровень холестерина в мембране клеток повышается. Этому может способствовать активация процессов переокисления в самих ЛНП. Так, при ИБС ряд исследователей констатирует увеличение содержания холестерина в мембранах эритроцитов именно за счет избыточного поглощения их клетками. Согласно данным [309], процессы переокисления быстро распространяются в мембранах эритроцитов благодаря трансмембранному переносу липидных гидроперекисей с помощью специфических акцепторов электронов, которыми могут являться аскорбаты и липофильные хелаты железа.
Окисление липидов приводит к резкому нарушению физико-химической структуры мембраны и, соответственно, липид-белковых взаимодействий, повышению мембранной проницаемости, усилению миграции трансмембранных белков за счет появления гидрофильных включений в гидрофобном слое [39]. Появление в бислое липидов гидроксилов и полярных продуктов ПОЛ может приводить к образованию водных пор, резко нарушающих стабильность мембраны и увеличивающих вероятность ее разрыва. Мы наблюдали значительное увеличение процента гемолиза клеток под действием изомолярного раствора мочевины в популяции эритроцитов, подвергнутых воздействию инициаторов окисления.
Метаболические изменения характеризуются, вероятно, сначала усилением гликолитических процессов, так как удается обнаружить увеличение количества 2,3 ДФГ и молочной кислоты в эритроцитах. Увеличение производства восстановленных эквивалентов при уменьшении синтеза АТФ усиливает процессы метгемоглобинобразования и генерации АФК. Об ускорении аутоокисления гемоглобина свидетельствует наблюдаемое нами увеличение содержания метгемоглобина и мембраносвязанного гемоглобина. Дезинтеграция мембран ведет к уменьшению устойчивости клеток к изменению осмотического давления, увеличивает скорость входа кальция в клетки и сопровождается нарастанием денатурационных процессов. Снижается активная концентрация ряда ферментов: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, каталазы. В то же время через 20 минут воздействия инициаторов окисления можно обнаружить более высокую супероксиддисмутазную и НАДН- цитохром Ьэ-редуктазную активность эритроцитарных гемолизатов. Есть данные, что ряд цитокинов, в частности, фактор некроза опухолей (ФНО), стимулируют апоптоз клеток через усиление производства АФК. Это сопровождается индукцией синтеза активной СОД [87]. В эритроцитах активация окислительных процесов и изменение белок-липидных взаимодействий может приводить к активации специфических протеаз, переводящих проферментные формы СОД, неспецифической НАДН- цитохром bs-редуктазы в активные формы.
Ускорение процесса окисления фосфолипидов мембран изменяет условия взаимодействия гемоглобина с мембраной и сопровождается заглублением триптофановых остатков в бислой в области анкирина [243] и образованию липидглобиновых комплексов. Увеличение времени инкубации эритроцитов с инициаторами окисления до 30 минут, по-видимому, дает дальнейшее усиление генерации АФК и способствует превращению части гемоглобина, углубленного в мембрану в кластеры гемихрома. Гемихром обладает высоким сродством к цитоплазматическому домену белка полосы 3 [174,175], что приводит к необратимым нарушениям нормальной структуры и функций мембраны и заканчивается гибелью клетки. В результате большая часть клеток популяции погибает, что является причиной роста деформируемости и электродиффузионного пробоя мембраны в опытных пробах, где остаются лишь самые устойчивые молодые клетки.
Повреждения клеток и органов активными формами кислорода происходит не только при прямой генерации их в условиях избытка кислорода, но и опосредовано, в условиях гипоксии, где активация ПОЛ и производство АФК происходит из-за избытка восстановленных эквивалентов и двухвалентного железа [39,220]. Особенной опасной становиться увеличение Fe2+ в условиях перехода от гипоксии к нормооксии или гипероксии ( то есть при реоксигенации). Появление кислорода в достаточном количестве способствует протеканию фентоновской реакции: Н202 + Fe2+ - ОН + ОН" + Fe3+ [39,220].
Для изучения влияния условий реоксигенации на процессы дезинтеграции эритроцитов мы исследовали кровь больных ИБС III функционального класса стенокардии до операции аортокоронарного шунтирования и после проведения операции.
Популяция эритроцитов больных ИБС III функционального класса стенокардии с сердечной недостаточностью Hi стадии характеризовалась наличием большого количества поврежденных, функционально неполноценных клеток с большой скоростью процессов дезинтеграции. Данное положение доказывается высоким процентом метформы гемоглобина, повышением доли жестко связанного и углубленного в мембрану белка. Большая часть клеток имеют поврежденную мембрану и ускоренные процессы аутоокисления гемоглобина. Быстрому повреждению и дезинтеграции эритроцитов способствуют условия хронической гипоксии, лактоацидоза, так как среднее содержание молочной кислоты у больных ИБС III функционального класса стенокардии в два, два с половиной раза превышает таковую у практически здоровых людей. Длительное применение нитропрепаратов также увеличивает скорость дезинтеграции эритроцитов.
