Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Типы транспортеров, переносящих дикарбоксилаты 6
Глава 2. Первичная структура транспортеров дикарбоксилатов 11
2.1. Митохондриальные транспортеры 11
2.2. Транспортеры бактерий 14
2.3. Транспортеры плазматической мембраны 15
Глава 3. Вторичная структура транспортеров дикарбоксилатов 19
3.1. Митохондриальные транспортеры 21
3.2. Транспортеры плазматической мембраны эукариотов 26
3.3. Бактериальные транспортеры 28
Глава 4. Активный центр дикарбоксилатных транспортеров 30
4.1. Активный центр мембранного фермента: Сукцинатдегидрогеназа 31
4.2. Четвертичная структура транспортеров 34
4.3. Точки связывания субстратов в транспортерах дикарбоксилатов 36
4.4. Канал в активном центре переносчиков дикарбоксилатов 41
4.5. Организация дикарбоксилатных транспортеров в интерфазе 45
Глава 5. Модели функционирования дикарбоксилатных переносчиков 47
5.1. Типы рассматривавшихся моделей 47
5.2. Модель переносчика с изменяющимся каналом 49
5.3. Количество точек связывания субстрата в транспортере 50
Глава 6. Материалы и методы 53
6.1. Среды 52
6.2. Выделение митохондрий 54
6.3. Выращивание и подготовка дрожжей S. cerevisiae 56
6.4. Измерение скоростей дыхания 57
6.5. Получение субмитохондриальных частиц 59
6.6. Определение состава препаратов субмитохондриальных частиц 58
6.7. Определение доли доступной мембранной фазы клеток 61
6.8. Другие методы 62
6.9. Реактивы и материалы 65
6.10. Расчеты 67
Глава 7. Результаты исследования 72
7.1. Характеристика сопряженных систем 72
7.2. Зондирование активного центра сукцинатдегидрогеназы 86
7.3. Зондирование дикарбоксилатного транспортера митохондрий печени крыс 90
7.4. Зондирование дикарбоксилатного транспортера плазматической мембраны 101
Глава 8. Обсуждение результатов 104
Выводы 112
Литература 113
Заключение 125
- Митохондриальные транспортеры
- Транспортеры плазматической мембраны эукариотов
- Точки связывания субстратов в транспортерах дикарбоксилатов
- Определение состава препаратов субмитохондриальных частиц
Введение к работе
Четырехуглеродные дикарбоксилаты (прежде всего L-малат и сукцинат) играют важную роль в метаболизме. Они являются интермедиатами нитратного цикла, локализованного в митохондриях. Окисление дикарбоксилатов необходимо для окислительного фосфорилирования, основного поставщика АТФ в клетке.
Наряду с участием в обмене веществ особую роль играет специфический транспорт этих метаболитов через биологические мембраны. Так, например, транспорт L-малата через митохондриальную мембрану связан с так называемым транспортом восстановительных эквивалентов, необходимым для обеспечения взаимодействия между двумя изолированными пулами никотинамидадениндинуклеотидов - митохондриальным и цитозольным. Транспорт сукцината через митохондриальную мембрану обеспечивает взаимосвязь между обменом в пероксисомах и митохондриях.
Особую роль играет транспорт L-малата через плазматическую мембрану клетки, поскольку этот дикарбоксилат, благодаря его особой роли в основном обмене может служить источником углерода, необходимого для роста в аэробных условиях клеток эукариотов. На важность этого процесса указывает то, что у этих организмов дикарбоксилатаый транспортер индуцируется при наличии в среде обитания L-малата. Надо отметить, что дикарбоксилатаый переносчик был обнаружен у организмов, рост которых дикарбоксилаты не поддерживают. Хотя эти организмы могут ассимилировать экзогенные дикарбоксилаты в присутствии других источников углерода, функция дикарбоксилатного переносчика в этом случае не установлена.
Дикарбоксилатный транспортер митохондрий относится к особому митохондриальному семейству переносчиков, которые структурно отличаются от других переносчиков этого типа. Структурные особенности этих транспортеров отражают и специфику их функционирования. Так, транспорт дикарбоксилатов немитохондриальными переносчиками сопряжен с транспортом катионов. Есть группа переносчиков, которая в качестве катионов использует ионы натрия. Другая группа переносит дикарбоксилаты в симпорте с протонами. Эта зависимость транспорта дикарбоксилатов от катионов, по-видимому, связана с тем, что этот процесс контролируется Н+-АТФазами плазматической мембраны, т.е. зависит от энергетического состояния клетки.
Изучению структуры и особенностей функционирования дикарбоксилатных переносчиков уделяется значительное внимание. В частности, для некоторых из них определена первичная структура. Однако многое остается неясным. Особенно мало известно о молекулярном механизме функционирования этих транспортеров. В частности, не установлены принципиальные для функции переносчиков особенности структуры их активного центра, включающего точки связывания дикарбоксилатов и каналы, по которым поступают субстраты к этим точкам связывания.
Митохондриальные транспортеры
Особенностью переносчиков дикарбоксилатов плазматической мембраны является в 2 раза больший по сравнению с транспортерами митохондрий размер полипептидной цепи [13, 94, 95, 126] (см. рис. 1 и 2). Причем, Na/дикарбоксилатные транспортеры высших эукариотов содержат около 600 аминокислотных остатков (табл. 4), в то время как, например, Независимый транспортер дрожжей Sch. pombe - 438, что ближе к размерам бактериальных транспортерам (табл. 3). Первичная структура транспортера рыбы Ps. americanus гомологична структуре транспортеров почек крысы, кролика и человека соответственно на 43, 44 и 43% [126]. В данном случае сходство значительно ниже, чем гомологичность между структурами дикарбоксилатного транспортера митохондрий С. elegans и человека, которая составляет 57% [39], хотя эволюционная дистанция во втором случае значительно выше.
Na/сульфатный котранспортер почек крысы (принадлежащий к тому же семейству транспортеров, что и транспортеры люминальной мембраны почечных канальцев [94] и кишечника A", laevis [13]) и Na-дикарбоксилатный транспортер кролика содержат 65% сходных аминокислот, из которых 47% идентичных остатков [95]. Причем отдельные участки аминокислотной последовательности этих транспортеров (482 - 568 и 71 - 157 в Na/сульфатном котранспортере) обнаруживают еще более высокую гомологию (соответственно 84 и 96%). Такая высокая гомологичность позволила установить (путем создания функционирующих белковых химер дикарбоксилатного транспортера кролика с сульфатным транспортером X. laevis), что ответственный за связывание дикарбоксилата участок находится вблизи С-конца (в последней четверти последовательности) [98].
Дикарбоксилатный транспортер плазматической мембраны Sch. pombe между аминокислотными остатками 214 и 235 содержит так называемую лейциновую молнию (расположенный вблизи липофильного сегмента участок, содержащий 4 остатка лейцина, разделенных шестью аминокислотными остатками) [48]. Лейциновая молния характерна для некоторых мембранных белков, образующих ди- и тетрамеры, в том числе для транспортеров катионов Na , К и Са +. Предполагается, что лейциновая молния участвует в управлении воротным механизмом потенциал-зависимых катионных каналов [135].
В первичной последовательности большинства Na-зависимых дикарбоксилатных транспортеров плазматической мембраны присутствуют участки гликозилирования [13, 48, 94, 95, 126] и фосфорилирования [64, 94, 95]. Гликозилирование происходит по остаткам аспарагина, находящимся в консервативных сайтах узнавания для гликозилирующего фермента. Эти сайты состоят из трех остатков аминокислот: Asn-X-Ser/Thr, причем X, как правило, Thr, Ser или Lys [74]. В Na/дикарбоксилатном транспортере человека присутствует два сайта гликозилирования и два участка фосфорилирования [94]. Участки возможного фосфорилирования показаны для трикарбоксилатного транспортера [64] и Na/дикарбоксилатного транспортера почек человека [95]. Это подразумевает существование в этих транспортерах плазматической мембраны сайтов узнавания для соответствующей фосфорилазы.
Первичные последовательности Na-зависимого транспортеров базолатеральной мембраны проксимальных канальцев почек крысы и кишечника крысы, обладают гомологией 79%. Причем различие приходится в основном на 27 аминокислот в области 260 - 290 [119]. Поскольку показано, что субстратная специфичность таких транспортеров связана с областью 420-615 [98], то область 260-290 остатков может отвечать за тканевую специфичность транспортера.
Консервативный домен PEST (Pro-Glu-Serre) на С-конце Н/дикарбоксилатного транспортера плазматической мембраны Sch. pombe [48], включающий участок 421-434, по-видимому, ответственен за протеолиз этого белка, так как такой участок содержат многие белки со временем жизни менее двух часов [113].
Таким образом, первичная структура транспортеров, катализирующих трансмембранный транспорт дикарбоксилатов, характеризуется большим разнообразием. Количество аминокислотных остатков в их первичной структуре варьирует от 286 до 622, что определяется типом мембраны, в которой функционируют эти транспортеры. К настоящему времени удалось выявить важность для функционирования этих транспортеров некоторых аминокислотных остатков. Показана избыточность первичной структуры некоторых транспортеров для выполнения основной, транспортной функции. Выявлены участки, подвергающиеся посттрансляционной модификации.
Транспортеры плазматической мембраны эукариотов
Не только в гидрофильных петлях митохондриальных транспортеров дикарбоксилатов, но и в пределах трансмембранных сегментов этих переносчиков присутствуют полярные аминокислотные остатки (см. рис. 4). Так, вблизи середины сегмента II у транспортеров человека, крысы и 5. cerevisiae присутствует остаток аргинина. Остатки аргинина есть и в других трансмембранных сегментах. Надо отметить, что кроме положительно заряженных аминокислотных остатков в трансмембранных сегментах присутствуют и отрицательно заряженные остатки (см. рис. 4).
Надо отметить, что в трикарбоксилатных переносчиках эволюционно отдаленных видов (крысы, S. cerevisiae, С. elegans), присутствует консервативный фрагмент KXXXR в середине сегмента II [65]. Этот положительно заряженный фрагмент может являться элементом активного центра, ответственным за связывание субстрата, аниона трикарбоксилата. Интересно отметить, что принадлежащий этому фрагменту остаток аргинина (Arg-88 у транспортера крысы) присутствует также в фосфатном транспортере и разобщающем белке митохондрий бурого жира [65], т.е. он может быть ответственен за связывание анионов различной структуры в согласии с субстратной специфичностью соответствующего транспортера.
Точечная замена на Cys других остатков аргинина - Arg-189 или Arg-181 в сегменте IV цитратного транспортера митохондрий дрожжей - приводит к полной инактивации переносчика. Расстояние между этими остатками аргинина чуть меньше двух оборотов а-спирали, что свидетельствует об их пространственной близости [63]. Предполагается, что эти остатки могут связывать дианион субстрата в ходе транспорта.
Сравнение аминокислотных последовательностей дикарбоксилатных переносчиков [11] не позволяет обнаружить пару близко расположенных положительных зарядов в области трансмембранных сегментов, однако отдельные консервативные остатки аргинина найдены в сегментах II, IV и VI, причем в последних двух случаях на расстоянии 8 позиций от начала участка. Это позволяет предположить, что площадка связывания субстрата может находиться одновременно на двух трансмембранных сегментов.
По данным гидропатических профилей дикарбоксилатные транспортеры плазматической мембраны эукариот содержат 8-12 трансмембранных сегментов (см. табл. 6 и рис. 3). В Na/дикарбоксилатном транспортере почек кролика присутствует 8 трансмембранных липофильных сегментов [94]. Большая гидрофильная петля между трансмембранными сегментами III и IV, локализованная на наружной стороне мембраны, содержит участок гликозилирования. Предполагается, что гликозилирование петель способствует удержанию в мембране соседствующих с ними липофильных сегментов [18].
Как и в митохондриальных транспортерах, в Ка+-зависимьгх транспортерах плазматических мембран кишечника X. laevis, почек человека, крысы и кролика консервативные аминокислотные остатки группируются вблизи примембранных участков в гидрофильных петлях и в липофильных сегментах [95]. С помощью химерных структур, включающих фрагменты Na/дикарбоксилатного транспортера плазматической мембраны камбалы и сульфатного транспортера X. laevis, было обнаружено, что за связывание сукцината ответственны четыре трансмембранных сегмента вблизи С-конца транспортера [41]. Причем в одном из них (в сегменте VII) находится консервативный домен (K/R)L(K/R), общий для транспортеров почек человека, крысы, кролика и X. laevis [18]. Возможно, именно этот домен, содержащий положительно заряженные аминокислоты, участвует в непосредственном связывании аниона сукцината. Однако, на сродство к сукцинату влияет каждый из четырех сегментов. Так химера, содержащая 13 сегментов транспортера кролика и один из сегментов (VII, IX или XI) транспортера человека имеет промежуточное сродство, в то время как сродство исходных транспортеров отличается друг от друга на порядок [61]. Одновременная мутация по двум отрицательно заряженным остаткам Asp-373 и Glu-475 в сегментах VIII и IX транспортера кролика, участвующих в транспорте Na, также влияет на
сродство к сукцинату [47]. По-видимому, активный центр плазматических Na/дикарбоксилатные транспортеров так же, как и митохондриальных транспортеров, включает нескольким трансмембранных сегментам.
Принимается, что для функции переносчиков необходимо не менее 6 трансмембранных сегментов, и наличие только двух таких сегментов в дикарбоксилат-связьгаающем белке вакуолей, участвующем в транспорте дикарбоксилатов, предполагает наличие других необходимых для транспорта субъединиц [109]. За связывание субстрата в котранспортерах плазматической мембраны отвечает лишь четверть молекулы [61], а оставшаяся часть - за связывание катиона и, вероятно, за сопряжение связывания и транспорта.
Дикарбоксилатный транспортер Е. coli, катализирующий обмен сукцината на фумарат, имеет 12 трансмембранных липофильных сегментов (см. табл. 7) [120]. Другой бактериальный переносчик Н/дикарбоксилатный транспортер Rh. capsulatus, также содержит 12 трансмембранных сегментов. В нем имеется крупная гидрофильная петля между средними сегментами VI и VII, обогащенная положительно заряженными остатками аминокислот [41]. Наличие такой петли характерно и для дикарбоксилатного транспортера Rh. trifolii MatC, хотя этот транспортер содержит только 11 липофильных сегментов. По-видимому, 11/12-доменная структура с протяженной гидрофильной петлей между средними трансмембранными сегментам характерна для бактериальных Н+/дикарбоксилатных транспортеров.
Точки связывания субстратов в транспортерах дикарбоксилатов
Принимается, что этот канал образован а-спиральными сегментами полипептидной цепи переносчика [29, 63, 69]. Присутствие в переносчике цепочки положительно заряженных остатков, по которой могли бы перемещаться дианионы субстрата, по-видимому, исключено, т.к. наличие более тре заряженных аминокислотных остатков в липофильном полипептидном сегменте исключает его трансмембранную локализацию [88].
Отдельные гидрофильные и заряженные аминокислоты, находящиеся на поверхности в целом липофильных а-спиральных трансмембранных сегментов, могут играть существенную роль в транспорте. Для дикарбоксилатного транспортера митохондрий такое распределение существенных аминокислот не исследовалось и насколько участок связывания погружен в канал не ясно. Однако в составе липофильных сегментов всех транспортеров диарбоксилатов присутствуют отдельные положительно заряженные остатки аминокислот [39, 64] (см. рис. 4). Эти остатки находятся на расстоянии от 1/3-ти до1/2-й длины этих сегментов. Показано, что точечные замены на Cys Arg-181 или Arg-189 в сегменте IV приводят к инактивации транспортера из дрожжей [137], а соответствующие замены на Lys сохраняют 25%-ю активностью. Бактериальные симпортеры дикарбоксилатов DcuA, DcuB и DcuC Е. coli содержат консервативньп остатки аргинина и лизина в сегменте I [120]. Протон-зависимый антипортер CytP L. lactis содержит остаток гистидина в середине липофильного сегмента І, аргинил в составе сегментов VII и XII [78].
Связать конкретный остаток аминокислоты с участком связывания субстрата для дикарбоксилатного транспортера не представляется возможным. Для Na/дикарбоксилатного транспортера апикальной плазматической мембраны почечных канальцев человека и кролика показано, что за связывание субстрата и специфичность этого связывания отвечают липофильные сегменты VII, X и XI [61, 98], но консервативные положительно заряженные аминокислотные остатки обнаружены так же в составе сегментов I и II [126].
Внешняя поверхность трансмембранных а-спиральных сегментов транспортеров контактирует с фосфолипидным слоем мембраны. Разумно предположить, что канал в транспортере, по которому субстрат переносится через мембрану, образован внутренними поверхностями трансмембранных а -спиралей. Своеобразное сканирование характера такой поверхности, образуемой сегментом IV, было проведено для цитратного транспортера [63] (см. главу 2). Доступными для водорастворимых модификаторов, подавляющих транспорт, оказались, наряду с полярными Arg-189 и Arg-181, неполярные остатки Pro-177, Val-178, Gln-182, Asn-185, Gln-186, Leu-190 и Туг-193. Однако полярность обращенных в канал поверхностей остальных сегментов не ясна. Не исключено, что поверхность канала может содержать много полярных остатков аминокислот, поскольку липофильные остатки должны участвовать во взамодействии с фосфолипидами мембраны. Известно, что, например, характерный для митохондрий фосфолипид кардиолипин прочно связан с митохондриальными транспортерами и необходим для их активность [21].
Некоторые положительно заряженные остатки консервативные аминокислот, расположенные на выходах из канала и даже находящиеся в гидрофильных петлях модулируют связывание субстрата и активность аденилатного транспортера митохондрий дрожжей. При замене на Lys-48, Lys-38, Arg-152 на Ala и Lys-179 на Met сохраняется от 10 до 50% активности [90]. Предполагается участие этих аминокислот в формировании канала по крайней мере на отдельных этапах транспорта.
Получены данные, из которых, по-видимому, следует участие гидрофильной петли в транспорте субстрата. Так, фотоаффинное связывание азидо-производного субстрата аденилатного транспортера митохондрий происходит вблизи остатков лизинов гидрофильной петли между сегментами I и II [34]. Это означает, что эти остатки могут участвовать в связывании субстрата. Интересно отметить, что эта петля исходно находится в матриксе митохондрий, а связывание субстрата происходит при добавлении модифицированного субстрата с цитоплазматической стороны мембраны. Предполагается, что упомянутая петля входит в пространство между трансмембранными сегментами при открытом воротном механизме [69]. Аналогичные результаты получены для дрожжевого транспортера, у которого в состав этой петли входят другие остатки.
Насколько канал, ведущий к точке связывания субстрата, раскрывается пытались оценить с помощью полярных модификаторов аминокислотных остатков. Было обнаружено, что Cys-134 ортофосфатного транспортера, находящийся посередине сегмента III, модифицируется объемным гидрофильным SH-агентом 5,5-дитиобис(2-нитробензоатом) с цитоплазматической стороны и, по-видимому, находится в водной фазе, a Cys-28, находящийся посредине липофильного сегмента I, модифицируется только небольшим катионом двухвалентной ртути [118]. Замена Cys-134 на Ser не приводит к потере переносчиком транспортной активности. Однако модификация этого остатка подавляет активность переносчика, что объясняют блокированием канала лигандом [118]. Замена Cys-28 блокирует только выход фосфата, но не вход или обмен, а модификация его приводит к превращению переносчика в неспецифичный канал. Предполагают, что Cys-134 участвует в образовании канала с цитоплазматической, a Cys-28 - с матриксной стороны [118].
Определение состава препаратов субмитохондриальных частиц
В настоящей работе активный центр дикарбоксилатных транспортеров клеток дрожжей и митохондрий исследовался in situ с помощью эндогенных сопряженных систем окисления сукцината- «сукцинатоксидаз» (см. рис. 7 и 13). Исследование транспортеров в интактной мембране исключает возможное изменение их структуры, которое может происходить при их выделении и последующей реконструкции в искусственных мембранах. Такая возможность существует именно для транспортеров, поскольку специфическая вторичная структура этих белков может необратимо изменяться после их выделения [22, 29, 63, 69, 81].
В работе разными способами показано, что сукцинатоксидазные системы митохондрий печени крыс и клеток S. cerevisiae лимитируются внешними дикарбоксилатными транспортерами и поэтому пригодны для зондирования активного центра этих транспортеров.
Использованные в работе ингибиторы, представляющих собой субстраты транспортеров с липофильным алифатическим заместителем различной длины являются своеобразным калибровочным устройством, позволяющим зондировать окружение вблизи точки связывания субстрата с шагом, равным длине метиленового звена. Уменьшение сродства после удлинения ингибитора на одно метальное звено (см. табл. 9) интерпретируется как наличие стерических препятствий в точке локализации этого звена, а увеличение сродства - как попадание этого звена в липофильное окружение.
Показано, что все использованные производные субстратов являются конкурентными ингибиторами окисления сукцината митохондриями печени крыс (см. рис. 10А, 20А, 23, 25, 27А) и клетками S. cerevisiae (см. рис. 17А), т.е. их действие направлено на точку связывания субстратов. Кроме того, эти соединения имеют однофазную зависимость скорости окисления сукцината от своей концентрации в координатах Диксона (см. рис. 10Б, 12Б, 22, 23Б и 24Б), что свидетельствует о том , что они взаимодействуют с лимитирующим транспортным звеном, соответствующих сопряженных систем - дикарбоксилатным транспортером митохондрий. Аналогичный результат получен для О-ацил-Ь-малатов на клетках S. cerevisiae (рис 17Б). Сигмоидная зависимость скорости окисления сукцината от концентрации ингибитора наблюдалась при уменьшении активности сопряженной системы (см. рис 13). Таким образом, исследованные ингибиторы обратимо взаимодействуют с точками связывания субстратов в активном центре транспортера.
Использованный в данной работе ингибиторы дикарбоксилатных транспортеров либо не влияют на отдельные компоненты эндогенных сопряженных систем (для митохондрий см. рис. 8 и 9), либо их влияние незначительно по сравнению с влиянием на транспорт (для митохондрий см. рис. 19 и 21), либо это влияние не может реализоваться благодаря тому, что эти соединения, не проникают через мембрану. Так, с помощью разработанного нами метода (см. раздел 6.7) показано, что О-ацил-Ь-малаты не проникают через плазматическую мембрану дрожжей (см. табл. 10) и благодаря этому не могут действовать, например, на митохондриальный дикарбоксилатный транспортер. Их действие направлена только на доступный для них дикарбоксилатный транспортер плазматической мембраны S. cerevisiae.
Поскольку субстратом сукцинатдегидрогеназы является дикарбоксилат, представляло интерес провести зондирование активного центра этого фермента (рис. 19). Моно- и диалкилмалонаты взаимодействуют с точкой связывания сукцината в этом ферменте, поскольку они являются его конкурентными ингибиторами (рис 18А). С помощью этих соединений было установлено, что на расстоянии 0,38 - 0,62 нм от точки связывания субстрата в активном центре сукцинатдегидрогеназы есть стерическое препятствие (см. табл. 9). В то же время на расстоянии от 0,62 до 1,2 нм от точки связывания субстрата в ферменте присутствует просторная зона, в которой, по-видимому, локализуются как липофильные, так и гидрофильные остатки аминокислот, т.к. инкремент lgKj для этой липофильно-гидрофильной области в два раза ниже соответствующего инкремента характерного для полностью липофильного окружения (рис. 6 и 19)).
Отдельные, не систематичные исследования активного центра сукцинатдегидрогеназы с помощью окисляющихся алкил-производных сукцината согласуются с результатами, полученными в данной работе. Предположение о большой ограниченности пространства вблизи точки связывания сукцината в сукцинатдегидрогеназе ранее высказывалось Уэббом [133] в связи с тем, что а-метилсукцинат окисляется со значительно меньшей скоростью, чем сукцинат [43]. Для высших алкилсукцинатов показано увеличение степени ингибирования с ростом п [42], но константы ингибирования в этом случае не определялись. Не учитывалось также то, что в отличие от малоната связывание сукцината (и, по-видимому, его производных) существенно зависит от редокс-состояния ФАД в ферменте [2, 10]. Кроме того сама реакция окисления алкилсукцинатов может зависеть от алкильного заместителя. Поэтому, хотя данные с производными сукцината не противоречат полученным в данной работе результатам, они не являются дополнительным аргументом в пользу выводов, сделанных в данной работе. Использование алкилмалонатов для зондирование активного центра сукцинатдегидрогеназы представляется более корректным.
Полученные в данной работе результаты интерпретируются в рамках одноцентровой модели (см. рис. 29). Согласно этой модели дикарбоксилатный транспортер представляет собой гомодимер. Трансмембранные а-спиральный сегменты II (содержащий в центре инвариантный остаток аргинина Arg-69) каждой субъединицы являются подвижными элементами транспортера. Модель предполагает, что 10 остальных трансмембранных сегментов выполняют роль статора для подвижных элементов. Дикарбоксилатный субстрат нейтрализует положительные заряды, локализованные на подвижных сегментах. При этом подвижные сегменты получают возможность флуктуировать между двумя состояниями: активный центр последовательно доступен только из матрикса митохондрий или только из цитоплазмы. Эти энергоемкие переходы осуществляются благодаря тепловому движению с высокой энергией активации. В открытом активном центре может происходить обмен между связанным и свободным субстратом. После перехода активного центра в альтернативное состояние активный центр становится доступным для свободного субстрата на обратной стороне мембраны. Тем самым обеспечивается транспорт по обменному механизму (антипорт). Модель предполагает, что в отсутствие субстрата в точке его связывания активный центр фиксируется в одном из двух состояний.
