Введение к работе
Актуальность темы. В последнее время большое внимание исследователей в различных отраслях знаний уделяется оценкам новых возможностей, возникающих в связи с бурным развитием нанотехнологий. В том числе, это касается биохимии и фармакологии, где уникальные свойства наноструктурированных объектов создают весьма благоприятную основу для конструирования новых типов диагностических систем и лекарственных форм.
В литературе отмечается все больше сведений о применении носителей нанометрового диапазона в качестве средств доставки антигенных и лекарственных веществ к иммунокомпетентным клеткам и пораженным органам макроорганизма. Эти результаты позволяют надеяться, что с помощью подобных систем можно значительно снизить токсичность и повысить эффективность действия традиционно используемых лекарственных препаратов. Весьма перспективным, в частности, оказывается применение наночастиц в качестве составных частей потенциальных лекарственных форм для конструирования противоопухолевых, противогрибковых, бактерицидных и антивирусных препаратов. Кроме того, в последнее время активно развиваются исследования, имеющие целью разработку вакцинных препаратов на основе нанометровых носителей и их применение в медицине и ветеринарии (Han et al., 2007).
В качестве корпускулярных носителей для биологически активных веществ используются такие структуры, как фуллерены и дендримеры, липосомы, полиакрилатные частицы, мицеллы, коллоидное золото (КЗ) и др. Известно, в частности, что инъекционное введение лабораторным животным КЗ может приводить к его накоплению в ретикулярных клетках лимфоидной ткани, активации клеточного и гуморального иммунного ответа (Дыкман, Богатырев, 2007). Кроме того, КЗ применяют как вектор для непосредственного внесения лекарственных веществ в очаги воспаления и в пораженные органы макроорганизма (Kattumuri et al., 2007).
Была показана возможность применения КЗ для терапевтического воздействия на злокачественные новообразования (Paciotti, 2004; El-Sayed, 2005). Исследователи наносили на поверхность коллоидной частицы фактор некроза опухолей и вводили полученный конъюгат пораженным опухолями мышам. В итоге было установлено, что комплекс КЗ с фактором некроза менее токсичен и более эффективен в терапевтическом воздействии на опухоль по сравнению с нативным фактором, несмотря на то, что конъюгированный с золотыми наночастицами фактор вводился в организм в меньшей дозе. Однако биодинамика золотых частиц, вводимых в организм, изучена недостаточно. В известных работах авторы отмечают (Eisler, 2004; Li et al., 2007), что частицы КЗ захватываются гепатоцитами, секретируются желчью и выводятся из организма с каловыми массами.
Конструирование терапевтических препаратов на основе мицелл поверхностно-активных веществ (ПАВ) также находит все более широкое применение в современной ветеринарной медицине (You et al., 2007; Lo et al., 2007). Это связано с тем, что данная корпускулярная система позволяет использовать лекарственные субстанции, обладающие ярко выраженными гидрофобными свойствами.
Введение активного вещества в эту систему в ряде случаев приводит к повышению биодоступности лекарственной формы, что способствует более высокой терапевтической активности и снижению дозировки препарата. Поэтому препараты, сконструированные на данной основе, обладают меньшей токсичностью.
Таким образом, приведенное выше краткое резюме результатов проведенного нами анализа литературных данных свидетельствует об актуальности темы данной диссертации. Этот анализ позволяет также констатировать, что ко времени начала наших исследований в этой области наблюдался дефицит сведении по:
а) молекулярным и клеточным механизмам иммуномодулирующего действия наночастиц в составе комплексов с широким спектром разнообразных антигенов и примерам их использования для получения in vivo поликлональных антител к низкомолекулярным веществам (гаптенам);
б) эффектам взаимодействий коньюгатов КЗ с антигенами (низкомолекулярными и высокомолекулярными) с имунокомпетентными клетками, а также аналогичным данным при использовании в качестве наноструктурированных носителей антигенов мицеллярных структур;
в) примерам конструирования препаратов на мицеллярной и мицеллярно-гелевой основе и их применению в ветеринарной медицине.
Целью нашей работы было изучение механизмов взаимодействия высоко- и низкомолекулярных антигенов, ассоциированных с корпускулярными носителями (коллоидное золото и мицеллы), с клетками ретикулоэндотелиальной системы, разработка основ конструирования фармацевтических композиций с применением данных наноструктур и изучение их фармакодинамических свойств.
В соответствии с данной целью, в работе решались следующие основные задачи:
-
С использованием золотых наночастиц в качестве носителя антигенов и адъюванта получить поликлональные антитела против ряда лекарственных веществ (ивермектин, кленбутерол, диминазен) для их детектирования и анализа фармакодинамики в биологических жидкостях животных.
-
Исследовать особенности взаимодействий коньюгатов коллоидного золота с низко- и высокомолекулярными антигенами с клетками ретикулоэндотелиальной системы, оценить эффекты их проникновения в фагоцитирующие клетки и влияние на дыхательную активность макрофагов.
-
Исследовать особенности взаимодействий комплексов мицеллярных структур с низко- и высокомолекулярными антигенами с клетками ретикулоэндотелиальной системы, оценить эффекты их проникновения в фагоцитирующие клетки и влияние на дыхательную активность макрофагов.
-
Разработать физико-химические основы получения новой мицеллярной инъекционной лекарственной формы диминазена с применением неионогенного поверхностно-активного вещества, оценить его фармакологические характеристики и терапевтические свойства.
-
Разработать физико-химические основы получения новой мицеллярно-гелевой формы ивермектина для наружного применения, оценить его фармакологические характеристики и терапевтические свойства.
В ходе реализации этой цели и задач были получены результаты, научная новизна которых заключается в следующем:
- впервые с применением коллоидного золота в качестве носителя антигенов и адъюванта получены поликлональные антитела к низкомолекулярным веществам (ивермектин, диминазен и кленбутерол), использованные для определения и анализа ивермектина и диминазена в биологических жидкостях животных;
- впервые получены экспериментальные результаты, характеризующие взаимодействие низко- и высокомолекулярных веществ, коньюгированных с золотыми наночастицами, либо ассоциированных с мицеллами ПАВ, с клетками ретикулоэндотелиальной системы, оценены эффекты их проникновения в фагоцитирующие клетки и влияние на дыхательную активность макрофагов;
- разработана новая мицеллярная инъекционная лекарственная форма на основе диминазена, проведено изучение ее фармакологических и фармакодинамических свойств;
- сконструирована новая мицеллярно-гелевая лекарственная форма для наружного применения на основе ивермектина, проведено изучение ее фармакологических и фармакодинамических свойств.
Полученные результаты имеют также определенную практическую значимость. Прежде всего, это касается данных об особенностях взаимодействий комплексов антигенов с использованными наночастицами с иммунокомпетентными клетками, позволяющих судить о возможных механизмах их иммуномодулирующих свойств. Это делает более эффективным решение задач получения iv vivo поликлональных антител к слабоиммуногенным антигенам, а также открывает перспективу разработке вакцин нового поколения. В частности, нами были разработаны и защищены патентами РФ адъювант для вакцин на основе мицеллярных структур и адъювант на основе КЗ. Кроме того, на основе сконструированной и защищенной патентом РФ лекарственной формы разработана фармацевтическая композиция для лечения заболеваний микробной и паразитарной этиологии. На основе данной композиции создано два препарата, прошедшие регистрацию и допущенные к производству как противопаразитарные и антимаститные гели. Был разработан и защищен патентом РФ препарат для лечения заболеваний кровепаразитарной этиологии. Данный инъекционный препарат прошел регистрацию и допущен к производству. Результаты работы были представлены на Втором саратовском салоне изобретений, инноваций и инвестиций, 2006 г., ряде российских и региональных выставок.
На защиту выносятся следующие основные положения:
-
Использование коллоидного золота в качестве носителя антигенов и адъюванта обеспечивает получение in vivo поликлональных антител против лекарственных веществ ивермектина, кленбутерола и диминазена, которые могут быть использованы для определения данных соединений в биологических жидкостях животных.
-
Взаимодействие конъюгатов золотых наночастиц с низко- и высокомолекулярными антигенами с клетками ретикулоэндотелиальной системы приводит к их проникновению в фагоцитирующие клетки и вызывает стимулирование дыхательной активности макрофагов. Накопление низкомолекулярных веществ в фагоцитирующих клетках в присутствии наночастиц золота происходит более интенсивно. При этом само коллоидное золото вызывает повышение дыхательной активности макрофагов.
-
Взаимодействие комплексов мицелл, полученных на основе неионогенных ПАВ, с низко- и высокомолекулярными антигенами с клетками ретикулоэндотелиальной системы приводит к их проникновению в фагоцитирующие клетки и вызывает стимулирование дыхательной активности макрофагов. Накопление низкомолекулярных веществ в фагоцитирующих клетках в присутствии мицеллярных наночастиц происходит более интенсивно. При этом сами неионогенные ПАВ активно проникают через мембраны клеток в цитоплазматическое пространство.
-
Разработанная новая инъекционная мицеллярная лекарственная форма диминазена (Неозидин М) является стабильной и обладает высокой терапевтической эффективностью.
-
Разработанная новая мицеллярно-гелевая лекарственная форма ивермектина для наружного применения (Ивермек-гель) является стабильной и обладает высокой терапевтической эффективностью.
Работа выполнена в лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН по планам НИР в рамках следующих бюджетных тем: “Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений”, научный руководитель д.х.н. профессор С.Ю. Щеголев, № гос. регистрации 01890017743; “Комплексный иммунохимический анализ антигенных структур, определяющих ассоциативные взаимодействия микроорганизмов с растениями”, научный руководитель д.х.н. профессор С.Ю. Щеголев, № гос. регистрации 01200606177.
Частично настоящая работа получила финансовую поддержку РФФИ (гранты №№ 04-04-48224-а; 07-04-00301-а; 07-04-00302-а); МНТЦ (проект № 2426); Федерального агентства по науке и инновациям (гос. контракт № 02.513.11.3028); Президиума РАН (проект в рамках программы фундаментальных исследований “Фундаментальные науки – медицине”).
Часть работы была выполнена на базе научно-исследовательского отдела ЗАО “Нита-Фарм” и Саратовской научно-исследовательской ветеринарной станции РАСХН.
Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в сотрудничестве, главным образом, с д.б.н. Дыкманом Л.А.. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, основная идея которых принадлежит автору данной диссертации и в получении которых роль автора была определяющей.
В исследованиях также принимали участие сотрудники группы иммунотехнологии лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН аспиранты Видяшева И.В., Зайцева И.С. и Пристенский Д.В. А также сотрудники ЗАО “Нита-Фарм” Аксиненко Н.М., Василенко О.А., Габалов К.П., Ермилов Д.Н., Жемеричкин Д.А., Сазонов А.А., Семенов С.В., Сидоркин В.А., Сынкин С.Ю., Шведова О.В. и Улизко М.А. Всем им автор выражает глубокую благодарность.
Кроме того, следует отметить вклад в выполнение данной работы д.х.н. профессора С.Ю. Щеголева (ИБФРМ РАН) за интересное и полезное обсуждение результатов на всех ее этапах.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлялись, докладывались и обсуждались на: межд. науч. конф. “Биотехнология на рубеже двух тысячелетий”, Саранск, 2001; VIII Всеросс. съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 2002; I и III межрег. конф. молодых ученых “Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой”, Саратов, 2002, 2006; 6, 7 и 8 John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology, Pushchino, Russia, 2002, 2005, 2007; 1 и 5 межд. конгр. “Биотехнология – состояние и перспективы развития”, Москва, 2002, 2009; VIII Int. Conf. “The Biology of Plant Cells in vitro and Biotechnology”, Saratov, Russia, 2003; науч. конф. “Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями”, Москва, 2003, 2004, 2005; межд. науч.-практ. конф. “Актуальные проблемы инвазионной, инфекционной и незаразной патологии животных”, Ставрополь, 2003; межд. конф. “Основные достижения и перспективы развития паразитологии”, Москва, 2004; межд. науч.-практич. конф. “Современные проблемы иммуногенеза, теории и практики борьбы с паразитарными и инфекционными болезнями сельскохозяйственных животных”, Уфа, 2004; X Всеросс. конф. “Карбонильные соединения в синтезе гетероциклов”, Саратов, 2004; 9 межд. школе-конф. молодых ученых “Биология – наука XXI века”, Пущино, 2005; Всеросс. конф. “Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты”, Саратов, 2005; Saratov Fall Meeting, Workshop on Nanobiophotonics I, II, III, IV, Saratov, Russia, 2005, 2006, 2007, 2008; межд. науч.-практ. конф. “Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных”, Ульяновск, 2006; межрег. науч. конф., посвященной 119-й годовщине со дня рождения академика Н.И. Вавилова, Саратов, 2006; межд. науч. конф. “Микробные биотехнологии”, Одесса, Украина, 2006; VI Всеросс. конф. молодых ученых “Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии”, Саратов, 2007; 15 межд. науч. конф. “Высокие технологии в биологии, медицине и геоэкологии”, Новороссийск, 2007; 10 Analytical Russia-German-Ukrainian Symp., Saratov, Russia, 2007.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 83 печатные работы, в том числе 4 патента, 23 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК, 16 статей в отечественных и зарубежных сборниках научных трудов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, основной части, содержащей три главы, заключения и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 303 страницах, иллюстрирована 71 рисунком и включает 71 таблицу. Список использованных литературных источников содержит 440 наименований.
