Введение к работе
Актуальность темы. Метаболизм кислорода в аэробных клетках сопровождается постоянным образованием токсичных реакционноспособных свободно - радикальных продуктов. В результате эволюции у аэробов возникли защитные механизмы, к которым относятся специализированные ферментные и неферментные антиоксидантные системы. Главную роль в защите от кислородных метаболитов играют ферменты, способные обезвреживать супероксидные радикалы и перекисные соединения в клетках, например: су-пероксиддисмутаза - СОД (разрушает супероксидные анион-радикалы до перекиси водорода), каталаза (восстанавливает перекись водорода до кислорода и воды) и пероксидазы (также восстанавливающие перекись водорода до воды, но с участием органических восстановителей). (Меныцикова Е.Б., Зенков Н.К., 1993). Абиотические и биотические стрессы приводят к временному сдвигу тканевого балланса антиоксидантов и проокси-дантов в сторону последних. Активные формы кислорода могут участвовать в регуляции экспрессии генома, в том числе индукции/репрессии биосинтеза ферментов- антиоксидантов. (Dat IF. et al., 1998; Смирнова Г.В. и соавт., 1999). Однако в настоящее время нет целостного представления как о влиянии различных неблагоприятных факторов внешней среды на метаболизм белков и, в частности, ферментов-антиоксидантов в клетках растений, так и механизмах компенсации повреждений, вызванных этими факторами. В связи с этим, теоретическая и практическая важность решения данной проблемы требует дальнейшего исследования состояния и обмена ферментов антиоксидантной системы в ответ на различную степень воздействия стрессовых факторов внешней среды.
Для изучения многих физиологических и биохимических процессов в качестве модели широко используются клеточные культуры растений, которые дают возможность достаточно адекватно оценить процессы обмена веществ в растениях и их ответные реакции на разнообразные внешние воздействия. Культивируемые растительные клетки и органы имеют ряд преимуществ, так как выращиваются в строго контролируемых условиях и существуют в автономном режиме, в отсутствии присущих для интактного растения метаболических связей между органами и тканями, а также фитогормональной регуляции. Поэтому интерпретация ответных реакций растительных клеток на строго определенные воздействия того или иного фактора окружающей среды может быть более однозначной. (Бутенко Р.Г., 1986; Носов A.M., 1999).
Известно, что культивирование клеток in vitro приводит к репрессии генов, отвечающих за тканевую специализацию клетки на фоне индукции генов универсального клеточного метаболизма, а также генов автономного существования. (Бутенко Р.Г., 1975). Показано, что активно пролиферирующие вне организма клетки содержат высокий уровень активности антиоксидантных ферментов. Многими авторами установлена четкая и прямая корреляция между максимальной видовой продолжительностью жизни и отношением удельной активности ферментов - антиоксидантов в важнейших органах к интенсивности основного обмена. ( Tolmasolf J.M. et al., 1980; Гусев В.А.и соавт., 1982). Известно также, что содержание ферментов антиоксидантной защиты в клетках и тканях различных организмов, в том числе СОД, каталазы и пероксидаз, генетически запрограммировано. Учитывая все выше изложенное, можно полагать, что гены, несущие информацию о ферментах антиоксидантной системы организма следует отнести к генам "выживания".
В настоящее время культуры растительных клеток являются объектом биотехнологии для получения целевых продуктов, поэтому целесообразность изучения ферментов-антиоксидантов в процессе выращивания растительных тканей in vitro в стандартных условиях, при воздействии неблагоприятных воздействий, а также сопоставление продолжительности жизни биологических объектов с их обеспеченностью этими важнейши-
ми антиоксидантами, участвующими в защите организма от токсического воздействия кислорода, становится очевидным.
Кроме того, в последние годы ферменты антиоксидантной системы представляют большой интерес для практической медицины. В частности, СОД используют для лечения различных аутоиммунных и воспалительных заболеваний, в качестве радиопротекторного агента при защите от ионизирующей радиации и др. (Bannister J.V., Bannister W.H, 1984; Hallewell В. et al, 1987; Максименко A.B., Тищенко Е.Г., 1997; Захарова М.И., Завалишин Н.А. и соавт., 1999). Поэтому выделение и очистка фермента может представлять большой интерес для энзимотерапии указанных заболеваний. В этой связи особое значение приобретает поиск технологически обоснованного продуцента ферментов. В настоящее время СОД получают из таких дорогостоящих источников, применяемых в пищевой и медицинской промышленности, как кровь, печень и другие органы и ткани крупного рогатого скота. Возможность использования промышленных штаммов культур растительных тканей в качестве источника СОД представляется перспективной. Цель и задачи исследования. Основной целью работы являлось исследование метаболизма СОД, каталазы и пероксидазы, а также общей белоксинтезирующей способности культивируемых клеток раувольфии змеиной и женьшеня. Изучение возможных путей регуляции обмена ферментов-антиоксидантов в культивируемых растительных клетках и оценка их роли в адаптации растительных клеток к неблагоприятным воздействиям окружающей среды. Непосредственными задачами работы являлись:
1.Сравнительная оценка белоксинтезирующей способности клеток различных штаммов культур клеток раувольфии змеиной и женьшеня.
2. Изучение динамики каталитической активности ферментов-антиоксидантов
(СОД каталазы и пероксидазы) в процессе роста культивируемых растительных клеток, а
также определение места синтеза и локализации в клетках отдельных ферментов-
антиоксидантов.
Разработка методов выделения и очистки СОД, каталазы и пероксидазы из культур ткани различных штаммов раувольфии змеиной и женьшеня. Оценка их некоторых физико-химических параметров.
Исследование биосинтеза и стабильности ферментов-антиоксидантов (СОД каталазы и пероксидазы) в культивируемых клетках лекарственных растений раувольфии змеиной и женьшеня.
Изучение регуляторного действия фитогормонов на метаболизм внутриклеточного белка и исследуемых ферментов антиоксидантной защиты в культивируемых клетках фитогормон-независимой ткани раувольфии змеиной.
Оценка влияния различных температур на белоксинтезирующую способность и обмен трех исследуемых ферментов антиоксидантов в культурах растительных клеток.
Разработка лабораторного регламента на выделение растительной СОД. Прове-, денне оценки острой токсичности и фармакологической активности выделенной субстанции ферментативного белка.
Научная новизна работы. Основным достижением данной работы представляется проведенное впервые широкое и систематическое исследование белоксинтезирующей способности культивируемых растительных клеток в целом, так как состояние белкового метаболизма в клетках является одним из наиболее важных показателей жизнедеятельности и продуктивности клеток. В работе были впервые рассчитаны параметры кругооборота внутриклеточного белка в культивируемых клетках лекарственных растений раувольфии змеиной и женьшеня.
Получены новые данные, расширяющие и углубляющие современные представления о метаболизме белков в клетках растений при экстремальных воздействиях. Уста-
новлено значительное изменение количественного и качественного состава синтезируемых de novo белков в клетках каллусных культур раувольфии змеиной шт. К-27 и женьшеня настоящего при воздействии различных температур. Впервые выявлено появление полипептидов 14 кДа и 17 кДа и сильное увеличение массовой доли как высокомолекулярных (ПО - 50 кДа), так и низкомолекулярных (20 - 18 кДа) полипептидов в изопро-теиновых спектрах изучаемых растительных клеток, которые, по-видимому, относятся к соответствующим семействам стрессовых белков и скорее всего участвуют в процессах адаптации растительных клеток к неблагоприятным факторам внешней среды.
Впервые проведено комплексное исследование и дана всесторонняя характеристика обмена индивидуальных ферментов антиоксидантний системы в культивируемых клетках лекарственных растений раувольфии змеиной и женьшеня. В ходе работы определены ранее неизвестные константы биосинтеза, распада, а также концентрация СОД, ката-лазы и пероксидазы в клетках каллусных культур ткани Rauwolfia serpentina (штаммы К-27 и К-47) и различных штаммов двух видов женьшеня Panax ginseng и Panax quinquefoHus.
Установлена избирательная чувствительность важнейших ферментов антиокси-дантной системы - СОД, каталазы и пероксидазы - к воздействию различных температур, что проявляется в усилении или ослаблении скоростей биосинтеза исследуемых ферментов на фоне количественного и / или качественного изменения состава их изо-ферментных спектров. Полученные данные дают основание сделать заключение о том, что изменение изоферментных спектров, а также скоростей биосинтеза и распада СОД, каталазы и пероксидазы при воздействии низких и высоких температур необходимо для поддержания метаболизма кислорода на оптимальном для клеток уровне и обеспечения формирования повышенной устойчивости и жизнедеятельности клеток в новых температурных условиях. Эти результаты являются основанием анализа и биохимического контроля устойчивости и стабильности культивируемых in vitro растительных тканей и клеток, так как изменение уровня активности ферментов, уровня концентрации ферментативного белка и интенсивности его биосинтеза в клетках может свидетельствовать как о степени повреждения клеточных структур, так и возможности их восстановления.
Впервые показано, что ответ растительных клеток на воздействие высоких и низких положительных температур включал как неспецифические реакции (например, подавление биосинтеза СОД и каталазы и, наоборот, индукция синтеза пероксидазы в обеих исследуемых растительных культурах), так и специфические ответы (например, при воздействии высокотемпературного шока наблюдали повышение (раувольфия змеиная) и, наоборот, снижение (женьшень) скорости биосинтеза внутриклеточного белка).
Изучено гормональное воздействие на биосинтез и функционирование ферментативной антиоксидантной системы в культивируемых растительных клетках раувольфии змеиной.
Предложена схема, отражающая механизмы воздействия температуры на растительный организм и объясняющая григгерные механизмы, запускающие биохимические процессы, которые в конечном счете и приводят к изменению характера обмена веществ в растительных клетках при воздействии нефизиологических температур. Научно-практическая значимость работы. Работа носит экспериментально-теоретический характер. Однако полученные результаты характеризуются практической направленностью для биотехнологии и медицины.
Разработаны методы и схемы выделения и очистки трех ключевых ферментов антиоксидантной системы из культивируемых клеток раувольфии змеиной и женьшеня. На выделение СОД из культивируемых растительных клеток получено АС (№ 1540270, 1989 г.).
На основании полученных результатов был создан лабораторный регламент на получение растительной СОД (1998 г.) и проведены оценка его острой токсичности и доклинические противовоспалительные испытания данной субстанции БАВ.
Была разработана схема совмещенной технологии СОД и аймалина из каллусных культур растительных тканей и показана принципиальная возможность получения двух высокоочищенных биологически активных веществ из культивируемых клеток Rauwolfia serpentina и с высоким выходом целевых продуктов. Выделение двух биологически активных препаратов, возможно позволит в будущем повысить рентабельность производства аймалина, а также значительно снизить себестоимость получаемых целевых продуктов.
Результаты работы были использованы при оформлении патента на способ выделения активного комплекса из культивируемых растительных клеток" (No 2136300 от 10.09.99г., приоритет от 04.11.97 г.).
Полученные результаты использовались в лекционных курсах и лабораторном практикуме на кафедре биохимии для студентов Санкт-Петербургской Государственной химико-фармацевтической академии. Основные положения, выносимые на защиту.
Данные о скорости биосинтеза и времени функционирования общего белка, а также фермектов-антиоксидантов (СОД, каталазы и пероксидазы) являются основой для реальной оценки биосинтетической способности и общего антиоксидантного потенциала культивируемых клеток лекарственных растений раувольфии змеиной и женьшеня и могут быть использованы в полном биохимическом контроле культур растительных клеток, имеющих промышленное значение.
Исследования влияния высоких и низких положительных температур на изопро-теиновые спектры позволяют сделать заключение о том, что экспрессия новых белков при данных воздействиях включает в себя как неспецифические ответные механизмы ( проявляются при всех воздействиях), так и специфические, характерные только для одного вида воздействия.
Разработанные методики выделения ферментов антиоксидантной защиты позволяют рассматривать исследуемые, имеющие промышленное значение, культуры растительных тканей как источник таких ценных для медицины препаратов как СОД и катала-за. Данные фармакологических испытаний полученной субстанции СОД подтверждают перспективность применения препаратов растительной супероксиддисмутазы в качестве противовоспалительного средства.
Апробация работы. Материалы, использованные в диссертационной работе, докладывались и представлялись на 13 Международном конгрессе по биохимии (Нидерланды, 1985), 18 Съезде ФЕБО (Югославия, 1987), Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Россия, 1988), на I Международной конференции по традиционной реабилитационной медицине (Китай, 1989), ГД Всесоюзной конференции "Биоантиоксиданты" (Россия, 1989), YH Международном конгрессе по растительным тканям и клеточной культуре (Нидерланды, 1990), 20 Съезде ФЕБО (Нидерланды, 1990), П Всероссийском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Россия, 1993), ШВсероссийском обществе физиологов растений (Россия, 1993), Пи Ш Российском конгрессе "Человек и лекарство" (Россия, 1995, 1996), Международном экологическом конгрессе (Россия, 1996), Международной научной школе по биотехнологии и применению пероксидазы (Россия, 1997), YII Международной конференции "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда" (Россия, 1997), Y Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Россия, 1998).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 43 печатных работ.
*
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 379 машинописных страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований), обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы (477 источника) и приложения (48 страниц). Материал диссертации проиллюстрирован 7 схемами, 65 рисунками и содержит 51 таблицу.
