Содержание к диссертации
Введение
1. Активирующее действие липопротеидов на системы вторичных посредников в тромбоцитах и гладкомышечных клетках (ГМК) сосудов
1.1. Влияние ЛНП на внутриклеточные системы обмена кальция и фосфоинозитидов в тромбоцитах человека 83
1.2. Влияние ЛИП на внутриклеточные сигнальные системы обмена кальция и фосфоинозитидов в ГМК сосудов 89
1.3. Заключение 103
2. Пролиферативные и гипертрофические эффекты липопротеидов: активация синтеза ДНК и белка в ГМК сосудов
2.1. Результаты 104
2.2. Заключение 110
3. Роль липопротеидных рецепторов и ЛНП-связывающих участков в активирующем действии лип на системы внутриклеточной сигнализации
3.1. Исследование роли ранее описанных липопротеидных рецепторов в развитиии «сигнальных» эффектов ЛНП 112
3.2. Характеристика I-ювых участков связывания ЛНП на ГМК сосудов 122
3.3. Заключение 130
4. Т-кадгерин: новый ЛНП-связывающий мембранный рецептор
4.1. Характеристика ЛНП-связывающих белков ГМК методом лигандного блоттинга 132
4.2. Выделение и идентификация ЛНП-связывающих белков ГМК как Т-кадгерина и его частично процессированного посредника.- 141
4.3. Влияние Т-кадгерина на межклеточную адгезию и связывание липопротеидов с клетками 151
4.4. Экспрессия Т-кадгерина в органах и тканях 157
4.5. Локализация Т-кадгерина в кавеолярной фракции 161
4.6. Заключение 164
5. Влияние окисленных липидов на сигнально-транскрипционные механизмы атеротромбоза
5.1. Роль окисленные эфиров холестерина в инициации сосудистого воспаления 165
5.2. Роль изопростанов в инициации сосудистого воспаления... 171
5.3. Протромбогенное действие окисленных фосфолипидов на эндотелиальные клетки: транскрипционные механизмы индукции тканевого фактора свертывания 177
5.4. Заключение 190
Обсуждение результатов 191
Выводы 211
Цитированная литература 214
- Влияние ЛНП на внутриклеточные системы обмена кальция и фосфоинозитидов в тромбоцитах человека
- Исследование роли ранее описанных липопротеидных рецепторов в развитиии «сигнальных» эффектов ЛНП
- Характеристика ЛНП-связывающих белков ГМК методом лигандного блоттинга
- Роль окисленные эфиров холестерина в инициации сосудистого воспаления
Введение к работе
Взаимосвязь между уровнем липопротеидов плазмы крови и развитием атеросклероза была установлена достаточно давно, однако механизмы влияния липопротеидов на атерогенез не ясны до конца и по сей день. Согласно классическим представлениям, атеросклероз является следствием накопления в стенке сосуда атерогенных липопротеидов, которые создают механическое препятствие току крови [Климов, 2002]. Однако за последние годы накопилось множество данных, показывающих, что атерогенез представляет собой не пассивное отложение липидов, но является активным процессом, в который одновременно вовлечены несколько типов резидентных и пришедших из крови клеток, связанных между собой паракринной стимуляцией [Ross, 1999]. Вопрос о том, какую роль в этом процессе играют липопротеиды, остается в значительной степени открытым.
В настоящее время представляется очевидным, что роль липопротеидов в атерогенезе не ограничивается каким-либо одним механизмом. Наиболее изученным является вклад липопротеидов в образование пенистых клеток, играющих ключевую роль в накоплении липидных масс в атероме. Пенистые клетки образуются за счет неконтролируемого захвата окисленных атерогенных липопротеидов макрофагами и гладкомышечными клетками (ГМК) при посредстве хорошо исследованных клеточных рецепторов [Herz, 2004]. Гораздо менее изученным является действие липопротеидов на другие клеточные процессы, приводящие к ремоделированиго сосудистой стенки, характерному для атеросклероза. Такими процессами являются синтез цито- и хемокинов, накопление в интиме сосуда моноцитов и их дифференцировка в факрофаги, миграция и пролиферация ГМК, синтез белков матрикса и расщепляющих их протеаз, процессы кальцификации атеромы, образование vasa vasorum. и целый ряд других процессов, приводящих к развитию атеромы и острых тромботических осложнений атеросклероза [Libby, 2002].
Участие дислипидемий в патологии человека не ограничивается развитием атеросклероза. Параллельно с атерогенезом дислипидемий вызывают нарушение регуляции тонуса сосудов и повышение агрегационной способности тромбоцитов [Williams, 1988; Aviram, 1987]. Эти процессы вносят вклад в развитие атеромы, но также могут проявляться как отдельные патологические симптомы, выражающиеся в повышенной склонности сосудов к сокращению и приводящие к развитию гипертензии и тромбофилии. Следует подчеркнуть, что имеются данные о ТОМ, что дислипидемия служит причиной развития некоторых форм гипертензии, а не является сопутствующим симптомом, вызванным более общими патологическими изменениями. Особенно тяжелые клинические последствия вызванных дислипидемией нарушений регуляции тонуса сосудов и активности тромбоцитов развиваются при остром коронарном синдроме, механизмы которого включают в себя тромбоз и вазоспазм, развивающиеся на фойе атеросклеротических изменений [Явелов, 2004].
Многообразие элементов атерогенеза, на которые оказывают влияние дислипидемий, позволяет предположить, что липопротеиды воздействуют на ключевые метаболические или регуляторыые системы клетки. Все клеточные процессы в сосудистой стенке находятся под контролем систем вторичных посредников [Чазов, 2000]. Так, фосфоинозитидный обмен играет центральную роль в регуляции таких ключевых процессов атерогенеза как пролиферация и миграция ГМК, продукция цитокинов и т.д. Кроме того, под контролем вторичных посредников находятся процессы, потенциально связанные с развитием осложнений атеросклероза. Например, ионы Са2"'" играют ключевую роль в регуляции сосудистого тонуса путем стимуляции сократительной активности ГМК, а также продукции эндотелием
1-І-
вазорелаксанта NO [Berridge, І990]. Кроме того, ионы Са являются основным внутриклеточным медиатором активации тромбоцитов.
В начале этого исследования мы предположили, что многообразные эффекты липопротеидов плазмы крови на клетки крови и сосудистой стенки могут быть связаны с их способностью воздействовать на системы
вторичных посредников в этих клетках. В связи с этим, одной из задач работы являлось изучение эффектов липопротеидов на системы вторичных посредников в клетках крови и сосудистой стенки. Поскольку активация систем вторичных посредников обычно происходит при участии рецепторов, расположенных на поверхности клеток, в работе также исследовались липопротеид-связывающие белки-клеточных мембран.
Атеросклероз в настоящее время рассматривается как один из видов хронического воспаления [Navab, 2004]. Характерной особенностью атерогенеза является преимущественное накопление в стенке сосуда моноцитов и лимфоцитов, но не нейтрофилов. Изучение механизмов такой избирательности и поиск веществ, стимулирующих экстравазацию моноцитов, представляет значительный интерес для понимания путей инициации атерогенеза и его особенностей по сравнению с другими видами воспаления. Особое внимание в качестве потенциальных инициаторов атерогенеза привлекают продукты окисления липопротеидов, которые обладают рядом проатерогенных свойств [Leitinger, 2003]. Оказалось, что биологические эффекты окЛЫП во многом связаны с действием содержащихся в них окисленных липидов. В последние годы проводится активное изучение атерогенных эффектов различных классов содержащихся в окЛЫП окисленных липидов.
В контексте рассматриваемой проблемы - связи липопротеидов и атерогенеза, обращает на себя внимание биологическая активность изопростанов — продуктов неферментативного окисления арахидоновой кислоты, которые в силу их структурного сходства с простагландинами могут взаимодействовать с рецепторами простаноидов [Pratico, 1999]. Наиболее изученной активностью этих веществ является способность стимулировать сокращение сосудов. Неизвестно однако, принимают ли они участие в таком ключевом процессе атерогенеза как инициация связывания моноцитов с эндотелием. Одной из задач настоящей работы являлось исследование этого вопроса.
Окисленные фосфолипиды (окФЛ) представляют собой недавно обнаруженный класс биологически активных окисленных липидов, в которых продукты окисления арахидоновой кислоты остаются связанными с фосфолипидной молекулой посредством сложноэфирной связи [Watson, 1997]. В последние годы для этих веществ описан целый ряд эффектов на клетки, участвующие в атерогенезе. В частности, был обнаружен стимулирующий эффект окФЛ на способность эндотелия связывать моноциты. Эти эффекты потенциально могут участвовать в инициации и прогрессии атеромы. В данной работе было продолжено изучение биологической активности окФЛ, в частности их способность активировать тесно связанные с атеросклерозом процессы свертывания крови за счет повышения тромбогенности эндотелия. Кроме того, нами были исследованы сигнальные и транскрипционные механизмы оказываемых окФЛ эффектов. Хотя окФЛ являются индукторами воспалительных реакций, оказываемые ими эффекты отличаются от действия известных медиаторов воспаления. Можно предположить, что окФЛ активируют специфичный набор сигналы-ю-транскрипциониых механизмов. Одной из задач данного исследования являлось исследование сигнальных и транскрипционных эффектов, вызываемых окФЛ в эндотелии.
Таким образом, накопленная информация позволила нам сформулировать гипотезу о том, что одним из механизмов, связывающих уровень липопротеидов с сердечно-сосудистыми заболеваниями, является способность липопротеидных частиц влиять на функциональную активность клеток крови и сосудистой стенки. Настоящее исследование было посвящено изучению активирующего влияния липопротеидов на системы вторичных посредников, регулирующие сосудистый тонус, активность тромбоцитов, тромбогенность эндотелия и воспалительные реакции в сосудистой стенке, то есть процессы, участвующие в развитии атеросклероза и его осложнений.
Влияние ЛНП на внутриклеточные системы обмена кальция и фосфоинозитидов в тромбоцитах человека
Влияние ЛНП и ЛВП на концентрацию свободного цитоплазматического кальция (Ca2+i) изучали с помощью Са2+-чувствительных флуоресцентных проб quin-2, fura-2 или i.ndo-1 [Grynkiewicz, 1985]. При добавлении ЛНП к отмытым от плазмы тромбоцитам человека наблюдалось быстрое и обратимое повышение уровня Ca""j (рис. 1-І). В отличие от этого, ЛВПз вызывали гораздо более слабые клеточные ответы. Поскольку исследование слабых эффектов ЛВП представляло технические сложности, дальнейшие исследования действия липопротеидов на тромбоциты проводились с использованием ЛНП. Действие ЛНП по кинетике напоминало эффекты классических активаторов тромбоцитов -фактора активации тромбоцитов (ФАТ) и аденозиндифосфата (ADP, рис. 1-1). Мы обнаружили также, что адреналин ие повышал Са j в тромбоцитах, отмытых от компонентов плазмы и суспендированных в буфере Тироде, но значительно усиливал действие ЛНП (рис. 1-1 и 1-2).
Действие ЛНП было дозозависимым и развивалось в диапазоне концентраций, ые превышающих физиологический уровень ЛНП в плазме крови (рис. 1-2). ЛНП оказывали Са -мобилизующее действие на тромбоциты всех обследованных здоровых доноров, а также на клетки больных с семейной комбинированной гиперхолестеринемией (табл. 1 -1). Количественные данные, представленные в табл. 1-1 показывают, что липопротеиды в концентрациях, близких к насыщению, вызывали более слабое повышение Са2+Ь чем такие индукторы агрегации, как ФАТ или ADP. Таким образом, липопротеиды можно рассматривать как слабые агонисты.
Действие ЛНП.на уровень Са І достоверно усиливалось в присутствии адреналина и полностью подавлялось после преинкубации тромбоцитов с простагландином Ej (рис. 1-1, 1-2 и табл. 1-1). Таким образом, действие ЛНП на тромбоциты регулируется так же, как действие классических гормонов-индукторов агрегации, что свидетельствует о специфичности эффектов ЛНП.
Как известно, повышение уровня Са + в цитоплазме может развиваться за счет двух источников - мобилизации внутриклеточных депо и входа этих ионов снаружи клетки [Siess, 1989]. В настоящее время известны различные группы веществ, способных селективно активировать один из этих путей поступления Са2+, например активировать Са"+ каналы плазматической мембраны [Hess, 1984] или вызывать утечку Са2Ф из ретикулума [Thastrup, 1990]. Характерным признаком действия Са2+-мобилизующих гормонов является то, что они активируют оба этих механизма [Siess, 1989]. Для выяснения источников повышения уровня Са і в тромбоцитах под действием липопротеидов мы изучили влияние ЛНП на тромбоциты, суспендированные в среде с различным содержанием двухвалентных катионов. ЛНП повышали уровень Са2"1", в тромбоцитах, суспендированных в бескальциевой среде, хотя амплитуда этого повышения была значительно ниже, чем в присутствии ионов Са2+ в среде инкубации (рис. 1-3, а, б).
Эти данные позволили предположить, что под действием ЛНП происходит не только мобилизация внутриклеточных кальциевых депо, но и вход Са " из внешней среды. Подтверждением последнего предположения служит способность ЛНП стимулировать вход в тромбоциты ионов бария, которые, так же как и Са" , повышают флуоресценцию quin-2 (рис. 1-3, в). Эти результаты хорошо согласуются с данными о способности рецептор-активируемых каналов плазматической мембраны тромбоцитов пропускать катионы бария [Avckmin, 1991] и позволяют сделать вывод о том, что ЛНП активируют данный тип катионных каналов. Дополнительным подтверждением способности ЛНП активировать вход двухвалентных катионов из внешней среды являются данные таблицы 1-2, показывающие, что ЛНП стимулируют вход радиоактивного кальция в тромбоциты (табл. 1-2) Активация фосфоинозитидного обмена
Как известно, обработка тромбоцитов индуцирующими агрегацию гормонами приводит к активации фосфоинозитидного обмена, образованию диацилглицерина и активации протеинкиназы С, основными субстратами которой в тромбоцитах являются плекстрин (47 кДа) и легкая цепь миозина (20 к Да). Мы обнаружили, что добавление ЛНП к тромбоцитам, преинкубированным с 3Н-инозитолом, приводило к накоплению водорастворимых продуктов фосфолипазы С - инозитолфосфатов (рис. 1-4). Как и в случае повышеиия Са2\ этот эффект потеициировался адреналином (рис. 1-4).
Исследование роли ранее описанных липопротеидных рецепторов в развитиии «сигнальных» эффектов ЛНП
Важной характеристикой взаимодействия ЛНП с их рецепторами является необходимость присутствия двухвалентных катионов, и прежде всего кальция [Goldstein, 1977]. Мы определили, как влияет удаление двухвалентных катионов из среды инкубации и добавление хелаторов Са2+ на способность липо протеидов активировать сигнальные системы клетки. Приведенные нарис. 3-1 данные свидетельствуют о том, что в бескальциевой среде клеточные ответы на ЛНП хотя и снижаются, но не исчезают полностью. Таким образом, ионы кальция не являются абсолютно необходимыми для взаимодействия, липопротеидов с предполагаемыми «сигнальными» мембранными рецепторами.
Влияние липопротеидов на клетки, лишенные классического ЛНП-рецептора Приведенные выше данные продемонстрировали сходство в действии кальций-мобилизующих гормонов и липопротеидов на системы вторичных посредников в клетках крови и сосудистой стенки. Эти данные позволяют предположить, что эффекты липопротеидов, подобно действию гормонов, опосредуются мембранными рецепторами. Наиболее изученным рецептором ЛНП является апо В,Е-рецептор [Goldstein, 1977]. Инактивация этого белка в результате мутаций приводит к нарушению захвата ЛНП іспетками и развитию семейной гиперхолестеринемии. Для выяснения роли апо В,Е-рецептора в активации систем вторичных посредников под действием ЛНП мы исследовали тромбоциты трех больных с характерными клиническими признаками гомозиготной формы семейной гиперхолестеринемии (таблица
У двух пациентов отсутствие функционально активных апо В,Е-рецепторов было подтверждено измерением связывания иод-меченных ЛНП с культивируемыми фибробластами кожи (рис. 3-2, а). Измерение влияния ЛНП на уровень С а2 1"; в тромбоцитах показало, что клетки больных обладали той же чувствительностью к Са2+ мобилизирующему действию липопротеида, что и клетки здоровых доноров (рис. 3-2, б и 1-2). Так же как у здоровых лиц, действие ЛНП на тромбоциты гомозиготных пациентов ингибировалось активатором адеиилатциклазы тромбоцитов -простагландином Еь и потенциировалось адреналином.
Еще одним подтверждением того, что сигнальные эффекты липопротеидов опосредуются рецептором, отличающимся от апо В,Е рецептора, являются данные, демонстрирующие активацию фосфоинозитидного обмена под действием ЛНП и ЛВП3 в гладкомышечных клетках, полученных от кроликов линии Ватанабе (рис. 3-3). Как известно, у этих животных нарушены структура и функция апо В,Е-рецепторов (Schneider, 1989). Несмотря на это, липопротеиды активировали фосфоинозитидиый обмен в ГМК кроликов линии Ватанабе в той же степени, что и в клетках, полученных от нормальных животных (рис. 3-3). Таким образом, используя две модели генетических дефектов апо В,Е-рецептора, мы показали, что апо В,Е-рецептор не участвует в активации сигнальных систем клетки под действием липопротеидов. Этот результат позволяет предпололсить, что в клетках крови и сосудов существуют неохарактеризованные рецепторы липопротеидов, сопряженные с системами вторичных посредников. Поликатионная структура аігоВ-100 не салена для индукции «сигнальных» эффектов ЛНП Белковый компонент частиц ЛНП, апо В-100, содержит домены, богатые аргинином и лизином. При физиологическом рН эти аминокислотные остатки заряжены положительно, в связи с чем отдельные фрагменты апо В-100 можно рассматривать как поликатионы [Schneider, 1989], Положительно заряженные участки апо В-100 функционально очень важны, поскольку играют ключевую роль во взаимодействии апо В-100 с ЛПЛ-рецептором, содержащим отрицательно заряженные участки узнавания апо В-100 [Schneider, 1989]. Кроме того, положительно заряженные аминокислотные остатки апо В-100 опосредуют связывание ЛНП с протеогликанами внеклеточного матрикса субэндотелиального слоя, ответственными за накопление атерогенных липо протеидов в интиме сосудов на ранних стадиях атерогенеза [Skalen, 2002]. Удаление или нейтрализация положительных зарядов на лизилах и аргинилах апо В-100 приводит к утрате способности ЛНП взаимодействовать с апо В,Е-рецептором [Weisgraber, 1978; МаЫеу, 1977]. Таким образом, ионные взаимодействия играют важную роль в биологическом распознавании ЛНП. В связи с этим мы предпололшли, что положительно заряженные аминокислотные остатки апо В-100 могут быть важны для проявления «сигнальных» эффектов липопротеидов. Для выяснения возможной роли поликатионных участков апо В-100 в активирующем действии ЛНП на сигнальные системы клетки мы проверили, могут ли другие поликатионы имитировать действие ЛНП. Для этого мы сравнили действие разнообразных положительно заряженных веществ на фосфоинозитидный обмен в культивируемых ГМК микроартерий человека. Положительно заряженные гистоны и протамин вызывали дозозависимое накопление фосфатов инозитола в ГМК (рис. 3-4, а-в). В отличие от этого, низкомолекулярные полиамины путресцин и спермин не вызывали такого эффекта (рис. 3-4, в). Эти результаты показали, что высокомолекулярные положительно заряженные структуры действительно способны активировать внутриклеточную сигнализацию в ГМК.
Характеристика ЛНП-связывающих белков ГМК методом лигандного блоттинга
Для получения противолептидных антисывороток пептиды конъюгировали с активированной периодатом натрия пероксидазой хрена [Harlow, 1994], и полученными коиъюгатами иммунизировали мышей и кроликов.
Для оценки взаимодействия полученных антисывороток с белками р105/р130 применяли метод иммуиоблоттинга. Для анализа использовали препарат Т-кадгерина из медии аорты человека [Tkachuk, 1998]. Кроличьи антисыворотки против пептидов С-140, С-161 и С-260, а также мышиные антисыворотки против пептидов С-140 и С-161 взаимодействовали на блотах с теми же белками, что и ЛНП (результаты не показаны). Полное совпадение картины лигандного и иммунного блоттингов мы наблюдали и на препарате мембран культивируемых ГМК человека, а также после разделения белков методом двумерного гель-электрофореза (результаты не показаны). Следует отметить, что среди животных, иммунизированных одним и тем же пептидом, интенсивность иммунного ответа несколько варьировала.
Согласно данным иммуноблоттиига, пептиды С-51, С-340, С-350 и С-370 оказались неиммуногенны. Причины этого могут быть различными, но молено отметить, что соответствующие этим пептидам фрагменты расположены ближе к гликозилированным областям Т-кадгерина по сравнению с иммуногенными фрагментами [Tanihara, 1994]. Не исключено, что гликозилирование соседних участков белка вносит определенный вклад в конформацию эпитоиов.
Для .проверки принципиальной возможности использования полученных антисывороток для ингибирования функции Т-кадгерина мы изучили влияние полученных нами антител на связывание ЛНП человека с Т кадгерином на лигандных блотах. Нам удалось показать, что антисыворотки к пептидам С-140, С-161 и С-260, в отличие от контрольной сыворотки, дозозависимо подавляли связывание ЛНП (рис. 4-13). Несмотря на то, что сыворотки были нормированы на концентрацию общих иммуноглобулинов класса G, их способность вытеснять ЛЫП отличалась. Наиболее эффективным ингибитором связывания была сыворотка против пептида С-140, соответствующего N-концевому участку белка р105 (Т-кадгерина). Две другие сыворотки были менее эффективными (рис. 4-13), Интересно отметить, что подобная закономерность была ранее описана для антител против Е-кадгерина [Nose, 1990]. В этом случае моноклональные антитела к N-концевому участку белка, где расположен лиганд-связывающий сайт, обладали наибольшим ингибирующим связывание эффектом [Nose, 1990]. Вследствие высокой гомологии с классическими кадгеринами, такое объяснение вполне вероятно и для Т-кадгерина.
Таким- образом, три из семи рассчитанных и синтезированных нами пептидных фрагментов обладают антигенными и иммуногенными свойствами. С помощью этих пептидов нам удалось получить антитела, подавляющие связывание ЛНП с 105 кДа-белком на лигандных блотах. Эти результаты подтвердили правильность идентификации белка рЮ5 как Т-кадгерина. Второй вывод заключается в том, что используя в качестве антигенов синтетические пептиды, не удается получить иммунный ответ на некоторые участки белка. В связи с этим в дальнейшей работе мы получали антитела против рекомбинантных фрагментов этого белка, экспрессированиых в бактериях (см. ниже). В-третьих, все три полученных антитела одновременно с 105 кДа-белком окрашивали белок с массой около 130 кДа, что свидетельствует о родстве двух этих ЛНП-связывающих белков. Идентификации белка р 130 была посвящена следующая часть нашей работы. р130 — частично процессированный предшественник Т-кадгерина
В наших экспериментах по изучению липопротеидсвязывающих белков гладкомышечных клеток мы постоянно наблюдали присутствие двух ЛНЇЇ-связывающих белков с массами 105 и 130 кДа, хотя соотношение этих белков варьировало в разных препаратах ГМК. Секвенирование позволило идентифицировать белок р105 как Т-кадгерин. Правильность этой идентификации была подтверждена тем, что антитела против трех пептидов, синтезированных на основе опубликованной последовательности Т кадгерина, узнавали 105 кДа-белок и блокировали его взаимодействие с ЛНП (рис. 4-13). Эти же антитела взаимодействовали и с 130 кДа-белком (рис. 4-14). Принимая во внимание, что липопротеид-связывающие свойства 105 кДа- и 130 кДа-белков были практически идентичными, мы предположили, что белки р 105 и р130 являются либо гомологами, либо по-разному процессированными вариантами одного белка.
Из литературы известно,, что процессинг Т-кадгерина протекает в несколько этапов. После синтеза предшественника Т-кадгерина происходит присоединение ГФИ-гругшы и отщепление пропептида [Udenfriend, 1995; Suzuki, 1996]. Мы проверили, имеет ли 430 кДа-белок ГФИ-якорь. Для этого мы обработали клетки, экспрессирующие 130 кДа-белок, фосфолипазой С, специфичной для ГФИ-группы. Обработка клеток этим ферментом освобождает все ГФИ-белки из мембраны и переводит их в растворимую форму. Мы обнаружили, что ГФИ-специфичная фосфолипаза С снижает количество Т-кадгерина и р130 на мембране ГМК человека, одновременно вызывая появление растворимых форм этих белков (рис. 4-15). Эти данные показывают, что 130 кДа ЛНП-связывающий белок прикреплен к мембране посредством ГФИ-группы.
Характерным свойством классических кадгеринов, а также Т-кадгерина, является их устойчивость к действию трипсина в присутствии ионов кальция [Vestal, 1992]. Мы обработали ГМК человека трипсином и обнаружили, что в отсутствие Са + оба белка р105 и р130 подвергались протеолизу, в то время как при наличии Са2+ наблюдалось снижение уровня р130 и одновременное накопление р105 (рис. 4-15). Поскольку укороченный продукт трипсинолиза р130 оставался прикрепленным к мембране, можно сделать вывод, что трипсин отщеплял пептид от дистального домена 130 кДа-белка, где расположен пропептид.
Роль окисленные эфиров холестерина в инициации сосудистого воспаления
Ранее было показано, что восстанавливаемые функциональные группы играют важную роль в биологической активности окисленных липидов [Watson, 1997]. В связи с этим мы проверили, повлияет ли химическое восстановление окЛХ, гидроперекисей ЛХ или 9-ОНХ на их способность стимулировать взаимодействие ЭК и U937. Липиды обрабатывали боргидридом натрия, который восстанавливает гидроперекиси, эпоксиды, альдегиды и кетоны в гидроксиды. Адгезия клеток U937 к ЭК, обработанным окЛХ, гидроперекисями ЛХ и 9-ОНХ подавлялась после восстановления этих липидов боргидридом натрия (рис. 5-2, в).
Механизмы, ведущие к специфическому связыванию моноцитов
Адгезия лейкоцитов к эндотелию требует экспрессии на поверхности ЭК специфических молекул адгезии [Carlos, 1994]. С помощью клеточного иммуноферментного анализа (ИФА) мы проверили, как окЛХ, нативный ЛХ и 9-ОНХ влияют на экспрессию Е-селектина, ICAM-1 и VCAM-1 на поверхности ЭК. Ни одно из перечисленных веществ не повышало экспрессию указанных молекул адгезии на поверхности ЭК в тех концентрациях, которые вызывали связывание моноцитов (результаты не показаны). Биологическая активность использованных препаратов окЛХ и ОНХ контролировалась с помощью измерения адгезии клеток U937 (результаты не показаны).
Адгезия моноцитов к ЭК опосредуется также CS-1-доменом фибронектина, который экспрессируется на поверхности ЭК после стимуляции окисленными липидами [Shih, 1999]. Для изучения роли CS-1-содержащего фибронектина в адгезии моноцитов, вызванной окЛХ, ЭК обрабатывали окЛХ, а перед добавлением клеток U937 добавляли моиоклональные антитела против CS-1-участка фибронектина, либо контрольные антитела. Обработка ЭК антителами против CS-1-домена фибронектина приводила к достоверному (Р 0,05) снижению связывания моноцитоподобных клеток U937 (контроль: 100±8 %; окЛХ: 202± 25%; окЛХ + анти-CS-l: 130±І9%; окЛХ + контрольные антитела: 189 18%; результаты одного- из трех экспериментов). Антитела не влияли на связывание U937 с необработанными ЭК или с ЭК, обработанными TNFa (результаты не показаны). окЛХ и 9-ОИХ активируют МАР-киназы, но не влияют на активность NFKB
Стимуляция ЭК различными индукторами воспаления ведет к фосфорилированию и деградации ингибиторного белка ГкВа, что приводит к транслокации NFKB В ядро и активации NFKB-зависимой транскрипции [de Martin, 2000]. Для изучения влияния окЛХ и 9-ОНХ на активность NFKB-пути мы окрасили Вестерн-блоты клеточных лизатов антителами против фосфорилированной и тотальной ІкВа. В отличие от TNFa, который был использован в качестве положительного контроля, ни окЛХ, ни 9-ОНХ не вызывали фосфорилирования либо деградации ІкВа (рис. 5-3).
Ранее было показано, что EPJC1/2 МАР-киназы играют важную роль в стимуляции ЭК окисленными липидами [Bochkov, 2002, Blood]. Мы обработали ЭК окЛХ и изучили степень активации ERK1/2 с помощью окраски блотов антителами против фосфорилированной (активированной) формы EFJC1/2. Было обнаружено, что окЛХ стимулирует быстрое и обратимое фосфорилирование ERK.1/2 (рис. 5-4, а). Сходный, но более выраженный эффект оказывал TNFa.
Активация ERK1/2 зависит от проксимальной киназы МЕК1/2, а в некоторых случаях и протеинкиназы С [Gutkind, 1998]. Для определения функциональной роли МЕК1/2 и ПК С, ЭК были обработаны окЛХ в-присутствии ингибиторов МЕК1/2 (PD98059) и ПК С (бисиндолилмалеимида I). Оба ингибитора снижали как окЛХ и 9-ОНХ индуцированное фосфорилирование ERK1/2 (рис. 5-4, б), так и индукцию адгезии клеток U937 к ЭК (рис. 5-5). Для контроля на количество нанесенного на форез белка мы окрашивали блоты антителами против ERK1/2, узнающими как фосформированную, так и дефосфорилированную форму этого белка (рис. 5-4, б). Таким образом, механизм активации ЭК, ведущей к адгезии моноцитов, включает активацию ПК С, МЕК1/2 и ERK1/2. Изопростан S-u3o-PGF2a как потенциальный индуктор моноцитарного воспаления в сосуде
Изопростаны являются продуктами не ферментативного окисления арахидоновой кислоты под действием свободных радикалов [Pratico, 1999]. Содержание этих веществ повышается при различных состояниях, сопровождающихся окислительным стрессом, в том числе при гиперхолестеринемии [Reilly, 1998]. Один из наиболее распространенных изопростанов, 8-H3o-PGF2a; обнаружен в окисленных ЛНП [Lynch, 1994] и атер о склеротических поражениях человека и апо Е-нокаутированных мышей [Gniwotta, 1997; Pratico, 1998]. Изопростаны оказывают различные биологические эффекты на сосуды, наиболее выраженным из которых является вазоконстрикция [Morrow, 1997]. Сосудосуживающее действие 8-H30-PGF2ct опосредуется рецептором тромбоксана ТР и может быть заблокировано антагонистами ТР-рецепторов, например препаратом SQ29548 [Takabashi, 1992]. ТР-рецепторы опосредуют многие, но не все эффекты изопростанов, в связи с чем неоднократно высказывались предположения о существовании альтернативных рецепторов, селективных для изопростанов [Fiikunaga, 1997]. Не исключено, что эти предполагаемые рецепторы похожи на ТР-рецептор, поскольку они также чувствительны к блокирующему действию SQ29548 [Takabashi, 1992].
