Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 9
1. Генетическая связь между фототрофными и другими грамотрицательными бактериями 9
2. Биосинтез липополисахаридов 12
2.1. Структура и биосинтез липида А 13
2.1.1. Регуляторные пути для модификации липида А 15
2.2. Структура и биосинтез олигосахаридов кора 17
2.2.1. Хемотипы бактерий 20
2.2.2. Роль кора в стабильности внешней мембраны: глубокий R-хемотип 22
2.3. Структура и биосинтез О-антигена 23
2.3.1. Транспорт ЛПС из внутренней во внешнюю мембрану 25
2.3.2. Серотипы бактерий 26
3. Электроповерхностные свойства грамотрицательных бактерий 26
4. Высвобождение липополисахаридов из клеточной стенки бактерий 28
4.1. Участие белков плазмы крови в высвобождении ЛПС из клеточной стенки бактерий 29
II. Материалы и методы исследования 36
Материалы 36
Объекты исследований. 36
1. Культивирование клеток 36
1.1. Культура клеток Rb. capsulatus 36
1.2. Культура клетокЕ, coli 37
2. Метод агглютинации клеток по Линдбергу 37
3. Регистрация спектров поглощения клеток Rb. capsulatus 38
4. Иммунная электронная микроскопия клеток Rb. capsulatus PG 38
5. Определение электрофоретической подвижности клеток (ЭФП) 38
6. Выделение липополисахаридов из биомассы бактерий и определение их качественного состава 39
6.1. Получение ЛПС из клеток Rb. capsulatus 39
6.2. Получение полисахаридного фрагмента из ЛПС Rb. capsulatus методом гидролиза 40
6.3. Получение ЛПС из клеток Е. coli 40
6.4. Определение чистоты препаратов ЛПС 41
6.5. Определение качественного состава ЛПС методом электрофореза 41
7. Получение антител против ЛПС и ПС из Rb. capsulatus PG 42
8. Иммунно-ферментный анализ определения ЛПС 42
9. Колориметрический метод определения ЛПС с карбоцианшювым красителем 43
10. Определение содержания КДО в препаратах ЛПС по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой 44
11. Инкубация клеток Rb. capsulatus PG и Е. coli различных хемотипов с белками плазмы крови 45
12. Определение количества колониеобразуїощих единиц у клеток Е. coli после инкубации с белками плазмы крови 46
III. Результаты и их обсуждение 47
1. Определение хемотипа бактерий Rb. capsulatus В10 и Rb. capsulatus PG 48
1.1. Характеристика ЛПС из разных штаммов Rb. capsulatus 50
1.1.1. Изучение возможностей применения колориметрического метода для определения ЛПС различной структуры 50
1.1.2. Сравнительный анализ содержания КДО в препаратах ЛПС из разных штаммов Rb. capsulatus 53
1.1.3. Сравнительный анализ состава ЛПС различных штаммов Rb. capsulatus методом электрофореза в полиакриламидном геле 55
2. Исследование электроповерхностных свойств клеток Rb. capsulatus VLE. сой различных хемотипов 56
3. Исследование влияния факторов роста на состав ЛПС клеток Rb. capsulatus PG 64
4. Влияние хемотипа бактерий на высвобождение ЛПС из клеточной стенки Rb. capsulatus PG и Е. coli под действием различных белков плазмы крови 72
Выводы 77
Список литературы 78
- Электроповерхностные свойства грамотрицательных бактерий
- Определение качественного состава ЛПС методом электрофореза
- Определение хемотипа бактерий Rb. capsulatus В10 и Rb. capsulatus PG
- Исследование электроповерхностных свойств клеток Rb. capsulatus VLE. сой различных хемотипов
Введение к работе
Многие тысячелетия человек сосуществует на Земле с патогенными микробами, и лишь на рубеже XIX-XX веков был достигнут решающий перелом в борьбе с болезнями, вызываемыми микроорганизмами.
Актуальной современной проблемой остается ухудшение эпидемиологической обстановки, в частности, увеличение количества больных с грамотрицательной бактериемией. При заражении грамотрицательными бактериями возрастает опасность осложнений, которые могут привести к эндотоксиновому шоку, причиной развития которого являются липополисахариды (ЛЇЇС). ЛПС - основная структурная единица внешней мембраны грамотрицательньгх бактерий (Nikaido & Vaara, 1987).
Токсической составляющей ЛПС является липид A (Westphal & Luderitz, 1954). Длина и состав кора и полисахаридного фрагмента ЛПС определяют хемотип бактерий.
Сравнительнвіе определения последовательностей нуклеотидов 16S рРНК (Woese, 1987) обнаружили неизвестную ранее филогенетическую связь между фототрофиыми (Pseudomonas, Rhodobacter) и другими грамотрицательными бактериями, такими как Neisseria, Escherichia, Salmonella и др., что позволило расширить границы исследований и возможности модифицировать факторы, влияющие на рост грамотрицательных бактерий. Представители класса Proteobacteria имеют принципиальные различия по морфологии, физиологии, экологии и взаимоотношениям с другими формами жизни. Однако все они характеризуются общей организацией клеточной оболочки, макромолекулярными компонентами которой являются пептидогликан, липопротеины, порины, фосфолипиды, а также ЛПС, занимающие две трети клеточной поверхности (Weckesser et al,, 1979). Физико-химический состав и структура клеточной стенки бактерий являются определяющими во взаимодействии с разнообразными факторами внешней среды. Поверхностный заряд, создаваемый структурными компонентами клеточной стенки, влияет на взаимодействие бактериальных клеток с антибиотиками, детергентами и биологически активными молекулами (Bayer & Sloyer, 1990). ЛПС проявляют различные виды биологической активности только в свободном состоянии (Mayeux, 1997). На высвобождение ЛПС из бактерий могут влиять как свойства самой клетки - ее жизнеспособность, структура и заряд клеточной стенки, так и внешние факторы, такие как условия роста бактерий и различные внешние агенты. Исследования по этим вопросам носят скорее отрывочный, чем систематический характер. Имеющиеся в литературе данные получены для различных бактерий и штаммов без прослеживания логической связи объектов исследования.
Актуальность проблемы
Весьма актуальным является изучение зависимости электроповерхностных свойств бактериальных клеток от таких важных характеристик клеточной стенки, как хемотип, поверхностный заряд, плотность упаковки ЛПС в клеточной стенке. Это важно знать для понимания процессов, происходящих при взаимодействии бактерий с катионпыми белками и антибиотиками, а также при оценке возможной адгезивной и антигенной активности бактерий. Полученные данные могут иметь решающее значение при антибактериальной терапии.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы явилось изучение влияния состава ЛПС на электроповерхностные характеристики некоторых представителей грамотрицательньгх бактерий в различных условиях окружающей среды и их способности взаимодействовать с катионными белками плазмы крови в зависимости от хемотипа.
Были поставлены следующие задачи:
определить хемотип бактерий штаммов Rb. capsulatus В10 и Rb. capsulatus PG, a также состав ЛПС, формирующих их клеточную стенку;
изучить влияние факторов роста (состав среды и условия освещенности) на состав ЛПС клеточной стенки и хемотип клеток Rb. capsulatus;
провести сравнительное исследование электроповерхностных свойств клеток Rb. capsulatus и Е. сой различных хемотипов;
изучить роль некоторых белков плазмы крови в высвобождении эндотоксинов из клеточной стенки в зависимости от хемотипа бактерий на примере Е. coli и Rb. capsulatus.
Научная новизна
Впервые определены неописанные ранее хемотипы фототрофных бактерий Rb. capsulatus Bl 0 и Rb. capsulatus PG.
Впервые показано влияние состава ЛПС на электроповерхностпые свойства фототрофных бактерий Rb. capsulatus В10 и Rb. capsulatus PG.
Установлена зависимость взаимодействия белков крови с бактериями не только от их хемотипа, но и плотности упаковки ЛПС в клеточной стенке, которая определяется коровой частью ЛПС.
Научно-практическая значимость
Полученные в настоящей работе результаты по взаимодействию белков плазмы крови с грамотрицательными бактериями различных хемотипов представляют не только теоретический, но и практический интерес, поскольку имитируют процесс, который может
реализоваться у больных с грамотрицательной бактериемией. Полученные результаты могут иметь решающее значение при антибактериальной терапии.
Впервые показана возможность практического применения колориметрического метода с карбоцианиновым красителем для определения ЛПС различной структуры и установления хемотипа бактерий.
Основные положения, выносимые на защиту
Методические подходы определения структуры ЛПС и хемотипа грамотрицательных бактерий.
Факторы внешней среды влияют на состав и высвобождение ЛПС из клеточной стенки клеток Rb. capsulatus VG.
Хемотип бактерий Rb. capsulatus и Е. coli влияет на электроповерхностные свойства клеток.
Хемотип бактерий играет ведущую роль в высвобождении эндотоксинов из клеточной стенки Rb. capsulatus PG и Е. coli под действием белков плазмы крови.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (Саранск, 2001 г.), на VII Всероссийском научном Форуме имени академика В.И. Иоффе с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003 г.), на юбилейной научно-практической конференции, посвященной 80-летию образования кафедры инфекционных болезней ММА им. И.М.Сеченова «Инфекционные и паразитарные болезни в современном обществе, Клинико-лабораторное обеспечение шфектологии» (Москва, 2003 г.), на III Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004 г.), иа I международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004 г.), на III Российском конгрессе по патофизиологии «Дизрегуляционная патология органов и систем» (Москва, 2004 г.), иа Конференции «Фундаментальные науки - медицине» Программа фундаментальных исследований Президиума РАН (Москва, 2004 г.), на II международной научно-практической конференция Медбиотек-2 «Перспективы развития биотехнологии в России» (Пущино, 2005 г.), на XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006 г.).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых Российских журналах и одна статья принята в печать.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 94 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, вьгеодов и списка литературы, включающего 206 источников. Диссертация иллюстрирована 29 рисунками и 8 таблицами.
Электроповерхностные свойства грамотрицательных бактерий
Серотип - это внутривидовое разнообразие бактерий. Определение серотипа основано на реакции агглютинации бактерий со специфическими антителами. Серотип идентифицируют по наличию или отсутствию агглютинации. Принадлежность к серотипу определяется строением О-антигена (О-полисахарида) ЛПС.
О-цепи содержат иммунодетерминантные структуры, против которых нарабатываются антитела при инфекции или иммунизации (Luderitz et al., 1971). Каждый серотип бактерий синтезирует уникальный липополисахарид, который характеризуется специфическим составом и структурой О-цепи и, соответственно, индивидуальной 0-антигеиностыо. Следовательно, имеется столько бактериальных серотипов, сколько существует различных липополисахаридов. Например, S-штаммы Salmonella образуют более 60 серогрупп. В состав О-антигена наиболее значимых серогрупп (A-D) Salmonella входит регулярно повторяющийся трисахарид, состоящий из D-маннозы, D-галактозы и L-рамнозы. В другие серогруппы входят либо эти сахара в другой конфигурации, либо другие сахара. Найдено, что наибольший вклад в специфичность О-антигенов серогрупп вносят терминальные остатки 3,6-дезоксигексоз (Книрель и др., 19936).
Для Е. coli установлено более 150 серогрупп. Почти все О-специфические полисахариды Е. coli являются гексозаминогликанами, различная комбинация которых определяет серогруппу. Следует отметить, что, как и в роду Salmonella, О-антигены некоторых серогрупп Е. coli дают перекрёстные реакции с антигенами групп крови человека. (Книрель и др., 19936). Отсутствие кросс-реактивности между не только различными видами грамотрицательных бактерий, но даже между штаммами в пределах одного вида, является причиной невозможности создания универсальной вакцины против патогенных грамотрицательных бактерий.
В последние годы электрофизические методы анализа клеток нашли широкое применение при исследовании микроорганизмов как методы, позволяющие провести экспресс-анализ поверхностных клеточных структур при минимальном воздействии на клетки. Последнее выгодно отличает эти методы от других (например, химических) методов анализа. Современный арсенал электрофизических методов довольно разнообразен и позволяет решать широкий круг задач в прикладной микробиологии и биотехнологии (Мирошников и др., 1986).
Физико-химический состав и структура клеточной стенки бактерий являются определяющими во взаимодействии с разнообразными факторами внешней среды. Поверхностный заряд, создаваемый структурными компонентами клеточной стенки, влияет на образование колоний, адгезивные свойства бактериальных клеток, их взаимодействие с антибиотиками, детергентами и биологически активными молекулами (Bayer & Sloyer, 1990).
Липополисахариды, располагаясь во внешнем лепестке внешней мембраны, обеспечивают целостность и стабильность мембраны и участвуют во взаимоотношениях бактериальной клетки с внешней средой. Благодаря присутствию в коре и липиде А отрицательно заряженных групи, ЛПС связывают на клеточной поверхности катионы двухвалентных металлов. Эти катионы необходимы для стабилизации внешней мембраны. Их удаление хелатирующими агентами, такими как ЭДТА, приводит к нарушению ее целостности. Фосфатные группы способствуют проникновению в клетку катионных антибиотиков (полимиксина, аминогликозидов), адсорбируя их на поверхности мембраны (Езепчук, 1977; Katsu et al., 1984; Ribi et al., 1966). Заряд полисахаридной цепи может быть нейтральным или отрицательным, однако, как правило, концентрация отрицательного заряда не превышает одной кислотной группы на мономерное звено. Это отличает ЛПС от капсульных полисахаридов, для многих из которых характерна высокая концентрация отрицательно заряженных компонентов (Книрель, Кочетков, 1993).
Мутанты, имеющие в составе клеточной стенки ие полную молекулу ЛПС, а различные варианты Ra-Re гликолипидов, отличаются большей проницаемостью внешних мембран и повышенной чувствительностью к некоторым антибиотикам и гидрофобным агентам (Dame & Shapiro, 1979; Nikaido, 1976).
Установление принадлежности ЛПС к тому или иному хемотипу осуществляется комплексом методов, в который входят генная инженерия, фаготипирование, серология, установление состава и структуры ЛПС, изучение комплекса его биологических и физико-химических свойств.
При исследовании поверхности клеток чаще всего используют метод клеточного электрофореза, который позволяет очень точно охарактеризовать границу раздела клетка-окружающая среда (Гузев и Звягинцев, 1979). Сравнительное исследование электроповерхностных и адгезивных свойств клеток S. minnesota в зависимости от фазы роста показало, что наибольшие значения электрофоретической подвижности (ЭФП) и адгезии характерны для стационарной фазы. При этом ЭФП и адгезивность S. minnesota возрастали от S- к Re-хемотипу (Воскун, 1992). Изучение электроповерхностных свойств бактериальных клеток E.coli и Salmonella различного хемотипа показало, что максимальные значения электрокинетического потенциала (ЭКП) наблюдались у глубоких Re-Rd-мутантов, имеющих в составе ЛПС только остатки кето-дезокси-октолузоновой кислоты (КДО) и гептозы. Эти различия объясняются локализацией основных отрицательно заряженных группировок (КДО, фосфаты) во внутренней коровой области. Наименьшие значения ЭКП отмечались у клеток S-хемотипа, несущих полноценные О-полисахаридные цепи, Иное объяснение различия зарядов поверхности клеток отдельных штаммов может быть связано с наличием в молекуле ЛПС других неуглеводыых заместителей, сообщающих ей определенный заряд (фосфаты, этаноламин, амины). Значения ЭКП препаратов ЛПС и исходные значения ЭКП клеток, из которых были выделены эти препараты, совпадают, что свидетельствует о том, что ЛПС энтеробактерий в значительной мере определяют величину их ЭКП. Прогрев клеток Е. сой, имеющих S- или Ra-хемотип, не сопровождался значимыми изменениями в величине ЭКП. Напротив, прогрев клеток с глубокими дефектами синтеза ЛПС (Re-Rd) приводил к снижению ЭКП, Данный факт можно объяснить большей стабильностью клеточной стенки бактерий, имеющих полноценный ЛПС, по сравнению с глубоко дефектными клеточными стенками (Гремякова, 1996). Как упоминалось выше, строение клеточной стенки грамотрицательных бактерий и, в частности, липополисахаридов, как ее главной структурной составляющей (Nikaido et al, 1987), является определяющим во взаимодействии с разнообразными факторами внешней среды, такими как антибиотики и различные катионные белки. Располагаясь на внешней стороне клеточной стенки грамотрицательных бактерий, ЛПС легко доступны для взаимодействия с компонентами сыворотки, которые могут способствовать их высвобождению из бактерии. Известно, что только в свободном состоянии ЛПС проявляют различные виды биологической активности и включаются в патогенез септического шока, который является частой причиной смертности (Mayeux, 1997). Существуют две возможности высвобождения эндотоксинов из клеточной стенки и попадания их в среду в свободном виде. Первая - за счет естественного высвобождения в результате разрушения клеточной стенки, происходящего во время деления, а также при гибели клеток (Shenep, 1985; Rassel, 1976; Goto, 1980). Вторая - в результате принудительного высвобождения при участии внешних агентов, таких как антибиотики, ферменты, белки плазмы крови. В этой части обзора будет более детально рассмотрено участие отдельных белков плазмы в высвобождении ЛПС из клеточной стенки бактерий.
Определение качественного состава ЛПС методом электрофореза
Из литературных данных известно, что одной из ведущих проблем фармакологии является получение свободных от эндотоксина белков крови человека. В связи с этим во многих экспериментах, связанных с участием эндотоксинов, используют рекомбинантные белки. Из-за недоступности этих белков (крайне высокая стоимость) перед нами возникла необходимость проверки присутствия ЛПС в коммерческих препаратах белков, чтобы исключить их вклад в высвободившихся ЛПС. Концентрации белков, исследуемых на присутствие в них эндотоксина, соответствовали физиологическим: альбумин - 40 мг/мл; фибриноген - 4 мг/мл; лизоцим - 150 мкг/мл; ферритин - 300 нг/мл; лактоферрин - 1 00 мкг/мл. Результаты по определению примесей ЛПС в белках представлены на рис. 27,
Из представленных спектров видно, что исследованные нами белки если и содержали примеси эндотоксина, то их концентрация была ниже диапазона рабочих концентраций ЛПС.
Для изучения влияния хемотипа бактерий на высвобождение ЛПС необходимо было взять бактерии, ЛПС которых различались бы не только наличием полисахаридного фрагмента, но и структурой кора. Классическим объектом в таких исследованиях является Е. coli. В нашем распоряжении имелось два штамма Е. соїі, не имеющих О-антигена и различающихся по структуре кора, JM 103, относящийся к Re-хемотипу и Ra-хемотип D21. В качестве бактерии, ЛПС которой имеет в своей структуре полисахаридный фрагмент, мы использовали фототрофную бактерию Rb. capsulatus PG. Такой выбор был правомерен, поскольку, как отмечалось выше, бактерии Rb. capsulatus и Е. coli имеют общую организацию клеточной стенки.
Результаты по высвобождению ЛПС из бактерий различных хемотипов под действием лизоцима и лактоферрина представлены в таблице 8. Из данных таблицы видно, что количество высвободившегося ЛПС в контрольных клетках зависит от хемотипа бактерий и увеличивается с удлинением структуры ЛПС. Можно предположить, что усеченная структура молекул ЛПС обеспечивает более плотную упаковку в клеточной мембране, что согласуется с данными по ЭФП клеток (гл. 2). Наличие полного сахаридного кора (Ra-хемотип) и О-антигена (S-хемотип) делает упаковку ЛПС более рыхлой, что способствует более легкому высвобождению ЛПС из клеточной стенки.
Количество высвободившихся ЛПС при инкубации с лизоцимом возрастало от Re- к RS-хемотипу. Высвобождение ЛПС при инкубации с лактоферрином имело близкие значения для Ra- и SR-хемотипов и более низкие значения для Re-хемотипа.
Поскольку в контроле у различных хемотипов бактерий высвобождалось различное количество ЛПС, для удобства сравнения эффектов белков на клетки разных хемотипов Е. coli результаты экспериментов представлены в виде гистограмм, на которых концентрации ЛПС в контроле приняты за единицу (рис. 28).
Из результатов, представленных на рис. 28, видно, что количество ЛПС, высвободившееся под влиянием лизоцима, было сравнимо с контролем в случае клеток Е. coli .JM 103 и в 1.4 раза превышало контрольные значения у клеток Е. coli D21. Лактоферрин увеличивал высвобождение ЛПС по сравнению с контролем в 3 раза для Е. coli D21 и в 3.6 раза для Е. coli JM 103.
Известно, что белки сыворотки крови высвобождают до 30% ЛПС клеточной стенки (Tesch et al., 1988). Представляло интерес выяснить - как повлияет высвобождение ЛПС под действием различных белков на жизнеспособность клеток. Это возможно оценить по количеству колониеобразующих единиц (CFU) после инкубации клеток с белками плазмы крови по сравнению с контрольными клетками.
Подсчет количества CFU показал, что под действием исследованных белков величина CFU значительно снижалась по сравнению с контрольными клетками (рис. 29). На гистограмме представлены результаты трех независимых экспериментов в относительных единицах. Контрольные значения приняты за единицу (6.6x106 клеток для Е. coli D21; 8.4хЮ6 клеток для Е. coli JM 103). Наиболее заметный эффект по подавлению роста колоний на Е. coli D21 (Ra-хемотип) оказывал белок лизоцим (в 6.6 раза по сравнению с контролем). Для Е. coli JM 103 это значение снижалось в 3 раза. Катионный белок лактоферрин снижал значение CFU на клетках Re-хемотипа в 4 раза и в 3.3 раза по сравнению с контролем на клетках с Ra-структурой кора ЛПС.
Меньшее высвобождение ЛПС из клеток Re-хемотипа, чем из клеток с Ra-структурой кора при действии лизоцима мы можем объяснить различной плотностью упаковки ЛПС в клеточной стенке бактерий двух хемотииов. Лизоцим для разрушения пептидогликанового слоя должен проникнуть через внешний лепесток внешней мембраны, который труднее преодолеть в клетках с более плотной упаковкой ЛПС, предполагаемой нами для Re-хемотипа бактерий (гл. 2). Действительно, из этих клеток высвобождалось наименьшее количество ЛПС.
Известно, что лактоферрин взаимодействует с грамотрицательными бактериями по иному, чем лизоцим механизму. Он связывается с белками-поринами, входящими в состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий. При связывании поринов с лактоферрином ослабляется связь между этими белками и молекулами эндотоксинов, результатом чего является высвобождение ЛПС в среду (Erdei et al., 1994). Показано, что степень взаимодействия лактоферрина с клеточной поверхностью увеличивается при переходе от S- к R-структуре ЛПС у Е. coli Н10407 (Gado et al., 1991). Предполагается, что Оцепи ЛПС экранируют порины, защищая их от взаимодействия с лактоферрином (Erdei et al., 1994), Полученные нами результаты показали, что сахара кора клеток Ra-хемотипа затрудняют доступ лактоферрина к поринам, по сравнению с коротким кором клеток Re-хемотипа. Кроме того, поверхность клеток Е. coli JM 103 более электроотрицательна, чем у клеток Е. coli D21, о чем свидетельствовали электрофоретические измерения (рис. 17). Этот факт также способствует лучшему взаимодействию этих бактерий с катиониым белком, каковым является лактоферрин. В результате под действием лактоферрина из клеток Re-хемотипа высвобождалось больше ЛПС и сильнее подавлялся рост колоний (рис. 28, 29). Наши результаты хорошо согласуются с данными группы авторов, изучавших взаимодействие лактоферрина с бактериями S- и Ra- хемотипов (Andra et al., 2005).
Определение хемотипа бактерий Rb. capsulatus В10 и Rb. capsulatus PG
Количественное определение ЛПС в лекарственных препаратах и биологических жидкостях остается актуальной задачей. В настоящее время для количественного определения ЛПС используют биологические, серологические и спектральные методы, основанные на регистрации окрашенных продуктов взаимодействия ЛПС с химическими реагентами (Janda & Work, 1971; Karklianis et al., 1978). Недостатками биологических методов является их трудоемкость. Широко применяемый в последние годы LAL-тест достаточно прост в исполнении и имеет высокую чувствительность, однако он оценивает биологическую активность ЛПС, не отражая его структуры (Levin & Bang, 1964; Elin & Woeff, 1973). В нашей работе мы использовали метод колориметрического определения ЛПС с карбоцианином, суть которого состоит во взаимодействии карбоцианинового красителя (Ьэтил-2 [3-(1-этилнафто[1,2д]-тиазолин-2илиден)-2 метилпропенил]нафто[1,2ё]-тиазолия бромида) с молекулой ЛПС, не содержащей хромофорных групп. Это ведет к появлению в спектре комплекса ЛПС-карбоцианин характерного пика с максимумом поглощения в диапазоне 450-478 нм, в то время как взаимодействие с другими типами макромолекул (белками, полисахаридами и нуклеиновыми кислотами) вызывает совершенно иные изменения спектра. Методы экстракции, чистота препаратов, особенности штаммов могут влиять на структуру ЛПС (Zeyetal., 1973).
Из литературы известно, что комплекс липида А с краской смещает максимум поглощения в коротковолновую, а комплекс карбоциании-полисахарид (ПС) - в длинноволновую область по сравнению с максимумом поглощения свободного красителя (Егорова и др., 1988). Вклад кора в изменения спектров и положений максимумов поглощения нигде в литературе не был отмечен. Поскольку одной из наших задач было установление хемотипа разных штаммов бактерий Rb. capsulatus на основании анализа структуры ЛПС, сначала было изучено влияние ЛПС бактерий известных хемотипов на сяектральные характеристики комплекса ЛПС-карбоцианин. Были использованы коммерческие препараты ЛПС: Е. coli 055:В5 (S-хемотип), Е. coli ЕН100 (Ra-мутант), Е. coli 15 (Rc-мутант), S. thyphimurium SL1181 (Re-мутант) ("Sigma").
Растворы карбоцианина с препаратами ЛПС, лишенными полисахаридного фрагмента (Ra-, Re-, Re-структуры), приобретали желтую окраску различных оттенков, а растворы ЛПС S-хемотипа всегда были окрашены в синий цвет. Спектры, представленные на рис. 13, показывают, что только ЛПС S-хемотипа дополнительно поглощал свет в диапазоне 500-600 им. Таким образом, можно заключить, что синее окрашивание растворов карбоцианина с ЛПС свидетельствует о присутствии О-полисахарида в препаратах ЛПС, что согласуется с литературными данными о диапазоне поглощения комплекса ПС-карбоцианин для полисахаридиого фрагмента, полученного гидролизом ЛПС (Егорова и др., 1988). Из спектров поглощения комплексов ЛПС-карбоцианин видно, что спектры ЛПС различных хемотипов различаются не только по форме, но и по величине и положению максимумов поглощения (рис. 13).
Наиболее длинноволновый максимум поглощения наблюдался для ЛПС S-хемотипа при 465 нм. С укорочением длины кора происходило смещение максимумов в коротковолновую область: для Ra-кора он соответствовал 462 нм, Re-кора - 461.5 нм, Re-кора - 458 нм (рис. 13). Видно также, что чем более усеченной является структура ЛПС, тем меньше величина абсорбции комплекса с краской (концентрация ЛПС во всех образцах 100 мкг/мл). Следует принять во внимание, что относительная массовая доля липида А в равных навесках ЛПС различна и уменьшается от Re- к S-структуре. Это также может влиять на величину поглощения комплексов ЛПС с краской.
Как отмечено выше, принципиальным отличием между S- и R-ЛПС является наличие О-антигена. Молекулы, усеченные по этому фрагменту, более гидрофобны и склонны к агрегации. Гидрофобность ЛПС возрастает и с усечением кора, что приводит к образованию мицелл в растворах, в связи с чем меняется возможность контакта краски с отдельными молекулами. Это четко отражается в интенсивности спектров поглощения (рис. 13). В пользу данного предположения говорят данные о пропорциональном снижении интенсивности реакции краски с ЛПС при добавлении агрегирующего агента ПЭГ 6000 (Егорова и др., 1988). С увеличением гидрофобности ЛПС от S- к Re-хемотипу снижается интенсивность поглощения, спектры расширяются и максимумы смещаются в коротковолновую область (рис. 13). Из этого следует, что для количественного определения ЛПС в пробах необходимо построение графика зависимости поглощения от концентрации для каждого конкретного ЛПС.
Во избежание адсорбции ЛПС и карбоцианинового красителя, искажающей картину поглощения света, в работе использовались пробирки из борсиликатного стекла. Обобщая полученные результаты, можно сделать заключение, что спектры поглощения комплексов ЛПС с карбоциаиином позволяют судить о составе исследуемых ЛПС, в частности, как о наличии полисахаридиого фрагмента так и о составе кора ЛПС. На основании полученных результатов, подтверждающих возможность использования колориметрического метода с карбоциаиином для оценки состава ЛПС, мы исследовали ЛПС Rb. capsulatus различных штаммов. Нами было проверено соответствие спектров с карбоциаиином между ЛПС, высвобождаемыми в среду роста и ЛПС, выделенных из бактерий по методу Кульшина (1987). Установлена идентичность их спектральных характеристик. Из спектральных характеристик комплексов ЛПС с карбоцианином видно, что максимум поглощения комплекса ЛПС-карбоцианин для ЛПС из Rb. capsulatus В10 соответствовал 458 им, а из Rb. capsulatus PG - 468 нм (рис. 14). Сдвиг максимума в спектре поглощения комплекса ЛПС-карбоцианин в коротковолновую область может свидетельствовать о различии в структурах ЛПС двух видов клеток, а именно о более усеченной структуре ЛПС из Rb. capsulatus В10.
Исследование электроповерхностных свойств клеток Rb. capsulatus VLE. сой различных хемотипов
Поскольку в контроле у различных хемотипов бактерий высвобождалось различное количество ЛПС, для удобства сравнения эффектов белков на клетки разных хемотипов Е. coli результаты экспериментов представлены в виде гистограмм, на которых концентрации ЛПС в контроле приняты за единицу (рис. 28).
Из результатов, представленных на рис. 28, видно, что количество ЛПС, высвободившееся под влиянием лизоцима, было сравнимо с контролем в случае клеток Е. coli .JM 103 и в 1.4 раза превышало контрольные значения у клеток Е. coli D21.
Лактоферрин увеличивал высвобождение ЛПС по сравнению с контролем в 3 раза для Е. coli D21 и в 3.6 раза для Е. coli JM 103. Известно, что белки сыворотки крови высвобождают до 30% ЛПС клеточной стенки (Tesch et al., 1988). Представляло интерес выяснить - как повлияет высвобождение ЛПС под действием различных белков на жизнеспособность клеток. Это возможно оценить по количеству колониеобразующих единиц (CFU) после инкубации клеток с белками плазмы крови по сравнению с контрольными клетками. Подсчет количества CFU показал, что под действием исследованных белков величина CFU значительно снижалась по сравнению с контрольными клетками (рис. 29). На гистограмме представлены результаты трех независимых экспериментов в относительных единицах. Контрольные значения приняты за единицу (6.6x106 клеток для Е. coli D21; 8.4хЮ6 клеток для Е. coli JM 103). Наиболее заметный эффект по подавлению роста колоний на Е. coli D21 (Ra-хемотип) оказывал белок лизоцим (в 6.6 раза по сравнению с контролем). Для Е. coli JM 103 это значение снижалось в 3 раза. Катионный белок лактоферрин снижал значение CFU на клетках Re-хемотипа в 4 раза и в 3.3 раза по сравнению с контролем на клетках с Ra-структурой кора ЛПС. Меньшее высвобождение ЛПС из клеток Re-хемотипа, чем из клеток с Ra-структурой кора при действии лизоцима мы можем объяснить различной плотностью упаковки ЛПС в клеточной стенке бактерий двух хемотииов. Лизоцим для разрушения пептидогликанового слоя должен проникнуть через внешний лепесток внешней мембраны, который труднее преодолеть в клетках с более плотной упаковкой ЛПС, предполагаемой нами для Re-хемотипа бактерий (гл. 2). Действительно, из этих клеток высвобождалось наименьшее количество ЛПС. Известно, что лактоферрин взаимодействует с грамотрицательными бактериями по иному, чем лизоцим механизму. Он связывается с белками-поринами, входящими в состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий. При связывании поринов с лактоферрином ослабляется связь между этими белками и молекулами эндотоксинов, результатом чего является высвобождение ЛПС в среду (Erdei et al., 1994). Показано, что степень взаимодействия лактоферрина с клеточной поверхностью увеличивается при переходе от S- к R-структуре ЛПС у Е. coli Н10407 (Gado et al., 1991). Предполагается, что Оцепи ЛПС экранируют порины, защищая их от взаимодействия с лактоферрином (Erdei et al., 1994), Полученные нами результаты показали, что сахара кора клеток Ra-хемотипа затрудняют доступ лактоферрина к поринам, по сравнению с коротким кором клеток Re-хемотипа. Кроме того, поверхность клеток Е. coli JM 103 более электроотрицательна, чем у клеток Е. coli D21, о чем свидетельствовали электрофоретические измерения (рис. 17). Этот факт также способствует лучшему взаимодействию этих бактерий с катиониым белком, каковым является лактоферрин. В результате под действием лактоферрина из клеток Re-хемотипа высвобождалось больше ЛПС и сильнее подавлялся рост колоний (рис. 28, 29). Наши результаты хорошо согласуются с данными группы авторов, изучавших взаимодействие лактоферрина с бактериями S- и Ra- хемотипов (Andra et al., 2005). Проанализировав результаты экспериментов по высвобождению ЛПС из клеточной стенки бактерий и образованию CFU, можно предположить, что взаимодействие лактоферрина с клетками Е, coli осуществляется по механизму, при котором высвобождение ЛПС пропорционально снижает жизнеспособность клеток. При действии физиологических концентраций лизоцима на клетки Е, coli подавление роста колоний не связано с повреждением внешнего лепестка мембраны и высвобождением ЛПС из клеточной стенки бактерий. Совокупность полученных нами результатов свидетельствует о том, что в механизмах взаимодействия исследованных белков с клеточной стенкой хемотип бактерий играет существенную роль. 1. Установлена принадлежность бактерий Rb. capsulatus В10 к R-, a Rb. capsulatus PG к SR-хемотипу. 2. Показано, что условия культивирования фототрофной бактерии Rb. capsulatus PG влияют на формирование состава ЛПС клеточной стенки. 3. Установлено, что электроповерхностные свойства клеток определяются структурой ЛПС, формирующих хемотип грамотрицательных бактерий. 4. На основании полученных величин ЭФП клеток и степени высвобождения из них ЛПС под воздействием лизоцима установлено, что разные хемотипы Е. coti различаются плотностью упаковки молекул ЛПС в клеточной стенке. 5. Показано, что коровая часть молекулы ЛПС влияет на взаимодействие лизоцима и лактоферрина с клеточной стенкой грамотрицательных бактерий. 6. Установлено, что жизнеспособность клеток после контакта с катионными белками определяется не количеством высвободившихся ЛПС, а механизмом повреждения клеточной стенки. 7. Впервые показана возможность применения карбоцианинового красителя для определения ЛПС различной структуры колориметрическим методом.
