Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 10.
2.1. Бактериолитические ферменты 11.
2.1.1. Субстратная специфичность бактериолитических ферментов 12.
2.1.2. Свойства бактериолитических ферментов 13.
2.1.3. Применение бактериолитических ферментов в научной и практической деятельности человека 13.
2.1.4. Внеклеточные бактериолитические комплексы 14.
2.2. Структура клеточной стенки бактерий 21.
2.3. Пептидогликан клеточной стенки 24.
2.3.1. Структура и классификация пептидогликана 24.
2.3.2. Влияние структуры пептидогликана на активность литических ферментов 29.
2.4. Анионные полимеры клеточной стенки бактерий 30.
2.4.1. Тейхоевые кислоты 32.
2.4.2. Тейхуроновые кислоты 34.
2.4.3. Липотейхоевые кислоты 34.
2.4.4. Анионные полимеры как рецепторы автолитических ферментов 34.
2.5. Механизм действия литических ферментов на клеточные Стенка грамположительных бактерий-мишеней 36.
2.5.1. Механизм действия эндопептидазы лизостафина Staphylococcus simulans на клеточную стенку Staphylococcus aureus 38.
2.5.2. Механизм действия автолизина Staphylococcus aureus на клеточную стенку S. aureus 40.
2.5.3. Механизм действия фаг-кодируемых гидролаз пептидогликана на клеточную стенку S. aureus 42.
2.5.4. Механизм действия автолизина Streptococcus pneumoniae на клеточную стенку пневмококка с холином 42.
2.6. Действие литических ферментов на грамотрицательные бактерии-мишени 44.
3.Материалы и методы 47.
3.1. Материалы 48.
3.2. Микроорганизмы и условия культивирования 48.
3.3. Определение ферментативных активностей 49.
3.3.1. Определение бактериолитической активности 49.
3.3.2. Определение протеолитической активности 49.
3.3.3. Определение фосфатазной активности 49.
3.4. Очистка ферментов лизоамидазы 49.
3.4.1. Выделение мурамидазы 49.
3.4.2. Выделение пептидазы Л1 50.
3.4.3. Выделение пептидазы Л2 50.
3.5. Определение молекулярных масс ферментов 50.
3.6. Определение температурной инактивации ферментов 51.
3.7. Определение температурного оптимума литических ферментов 51.
3.8. Определение рН-оптимума литических ферментов 51.
3.9. Определение оптимального значения ионной силы буфера 51.
3.10. Получение клеточных стенок бактерий 51.
3.10.1. Получение клеточной стенки Staphylococcus aureus 209-Р 51.
3.10.2. Получение клеточных стенок Streptomyces chrysomallus ВКМ АС628, Streptomyces roseoflavus var. roseofungini ВКМ Ac770, Streptomyces azureus РИА 1009, Glycomyces harbinensis BKM Ac-1247 и Nocardiopsis dassonvillei IMRU-509 52.
3.11. Получение пептидогликана 52.
3.12. Получение тейхоевых кислот 52.
3.13. Идентификация тейхоевых кислот 52.
3.14. Гидролиз клеточной стенки Staphylococcus aureus 209 Р 53.
3.15. Изучение действия лизоамидазы на клетки, клеточные стеЪки, и пептидогликан грамположительных бактерий 53.
3.16. Изучение действия бактериолитических ферментов лизоамидазы на клетки, клеточные стенки, и пептидогликан грамположительных бактерий 53.
3.17. Изучение влияния гомологичной тейхоевой кислоты, добавленной в реакционную смесь, на активность лизоамидазы 53.
3.18. Влияние экранирования заряда тейхоевых, тейхуроновых кислот двухвалентными катионами на бактериолитическую активность лизоамидазы и её ферментов 54.
3.19. Периодатное окисление тейхуроновых кислот клеточной стенки бактерий .54.
3.20. Изучение действия лизоамидазы на клетки и пептидогликан грамотрицательных бактерий 54.
3.20.1. Изучение влияния полимиксина В на действие лизоамидазы на грамотрицательные бактерии-мишени 54.
3.20.2. Изучение влияния отрицательно заряженного липополи- сахарида Esherichia coli на действие лизоамидазы на пептидогликан Е. coli 54.
3.21. Получение полисахарида лизоамидазы 54.
3.22. Изучение взаимодействия полисахарида лизоамидазы и её литических ферментов 55.
3.23. Аналитические методы 55.
3.23.1. Определение концентрации белка 55.
3.23.2. Определение содержания полисахаридов 55.
3.23.3. Кислотный гидролиз клеточной стенки, пептидогликана и тейхоевых кислот 55.
3.23.4. Определение фосфора 56.
3.23.5. Определение количества тейхоевой кислоты в клеточной стенке бактерий 56.
3.23.6. Определение количества пептидогликана в клеточной стенке бактерий 56.
3.23.7. Определение редуцирующих Сахаров 57.
3.23.8. Определение свободных №І2-групп 57.
3.23.9. Определение способности ферментов гидролизовать синтетический субстрат для муромидазы 57.
3.23.10. Определение способности ферментов гидролизовать синтетический субстрат для протеазы 57.
4. Результаты и обсуждение 58.
4.1. Очистка бактериолитических ферментов лизоамидазы 59.
4.1.1. Выделение бактериолитической пептидазы III 59.
4.1.2. Выделение мурамидазы. 66.
4.2. Характеристика бактериолитических ферментов лизоамидазы 66.
4.2.1. Физико-химические свойства пептидазы Л1 66.
4.2.2. Физико-химические свойства мурамидазы 71.
4.2.3. Физико-химические свойства пептидазы Л 2 71.
4.3. Определение субстратной специфичности Л1 и Л2- бактериолитических пептидаз 82.
4.4. Изучение роли теихоевых, теихуроновых кислот в механизме действия лизоамидазы и её ферментов на клетки грамположи тельных бактерий. 85.
4.4.1. Действие бактериолитических ферментов лизоамидазы на клетки, клеточную стенку, содержащую рибиттейхоевую кислоту, и пептидогликан Staphylococcus aureus 209 Р 86.
4.4.2. Действие бактериолитических ферментов лизоамидазы на клетки, клеточные стенки, содержащие разное количество рибиттейхоевых кислот, и пептидогликан Streptomyces chrysomallus ВКМ Ас-62. 88.
4.4.3. Действие лизоамидазы на клеточные стенки, содержащие 20% тейхоевой кислоты рибитфосфатной природы, и пептидогликан Streptomyces azureus РИА 1009 90.
4.4.4. Действие лизоамидазы на клеточные стенки Streptomyces roseoflavus var.roseofungini ВКМ Ас-770, Nocardiopsis dassonvillei IMRU 509, Glycomyces harbinensis BKM Ac - 1247 содержащие глицеринтейхоевые кислоты 92.
4.4.5. Действие лизоамидазы на клетки, клеточные стенки, в состав которых входят тейхуроновые кислоты, пептидогликан Bacillus subtilis W-23 .93.
4.5. Действие лизоамидазы на грамотрицательные бактерии-мишени 95.
4.6. Изучение влияния полисахарида лизоамидазы на активность бактериолитических ферментов 97.
Заключение 99.
Выводы 102.
Литература 104.
- Применение бактериолитических ферментов в научной и практической деятельности человека
- Механизм действия автолизина Staphylococcus aureus на клеточную стенку S. aureus
- Изучение действия бактериолитических ферментов лизоамидазы на клетки, клеточные стенки, и пептидогликан грамположительных бактерий
- Характеристика бактериолитических ферментов лизоамидазы
Применение бактериолитических ферментов в научной и практической деятельности человека
Литические ферменты находят широкое применение в научной и практической деятельности человека. Их применяют в биотехнологии, генной инженерии для получения сферопластов и протопластов (Kato et al., 1960, Hash et al., 1964, Schuhardt, Klesius, 1968, Hirachi et al.,\91\, Jagusztyn-Kraynicka et al, 1982, Филатова и др., 1982, Hatano, 1992, Kaul, 1993, Kobayashi, 1994), для изучения строения клеточных стенок различных микроорганизмов (Ghuysen, 1968, Kawata et al, 1984, Asenjo, 1993 , TonThat et al, 1997, Tenkanen et al, 1999), для выделения антигенов клеточных стенок бактерий и дрожжей (Ofek et al, 1982, Martinezmartinez et al., 1993), а также для лизиса клеточных стенок с целью выделения из клеток ДНК и РНК (Шурыгин и др., 1979, Щекина и др., 1983, Pospisek, Palkova, 1991). Особого внимания заслуживают работы, показывающие возможность использования бактериальных литических ферментов для лечения ряда заболеваний, вызванных патогенной микрофлорой, множественно устойчивой к антибиотикам (Schuhardt, Schindler, 1964, Strominger, Ghuysen, 1967, Yokogawa et al, 1972, Goodman et al, 1981, Кулаев и др., 1984, Бабенко и др., 1990, Романовская, Давиденко, 1999). Известно, что лечение инфекционных заболеваний антимикробными препаратами осложняется в связи с появлением множественно устойчивых к антибиотикам штаммов бактерий (Russell, Chopra, 1996). Появление патогенных штаммов, устойчивых к традиционно применяемым антибиотикам, заставляет искать новые антибактериальные вещества (Nosaki, 1989, Скрябин, Кулаев, 1990, Croux, 1992, Kim et al, 1999). Бактериолитические ферменты можно применять в качестве антибактериальных средств как в виде самостоятельного вещества, так и в сочетании с различными антибиотиками, что увеличит эффективность этих средств. Так лизоцим применяется в качестве лечебного препарата при инфекционных болезнях, в дерматологии, офтальмологии, хирургии и при действии на злокачественные опухоли (Егоров, 1986).
Возможно также создание сложных ферментных комплексов с широким спектром действия, включающих различные бактериолитические ферменты, активные в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. Создание таких комплексов, по-видимому, оправдано, поскольку, как уже отмечалось выше, каждый литический фермент имеет вполне определенный литический спектр действия. Объединение подобных ферментов дает возможность расширить этот спектр, а следовательно, и эффективность действия препарата. В литературе имеются данные относительно бактерий, секретирующих в среду роста ряд бактериолитических ферментов, отличающихся друг от друга по субстратной специфичности и свойствам (Ghuysen et al, 1962., Ghuysen et al, 1969, Aksnes, Grov, 1974, Iversen, Grov, 1973, Robinson et al, 1979, Kawata et al, 1984). Примеры внеклеточных бактериолитических комплексов эубактерий, их состав и специфичность действия представлены в табл. 1. Состав литических комплексов может быть непостоянным (Sado, Dworkin, 1972). Так одна из амидаз комплекса Myxococcus xanthus, была получена только в одном опыте. При последующих выращиваниях этой культуры на среде того же состава амидаза не секретировалась (Sado, Dworkin, 1972). Возможное непостоянство состава литического комплекса Streptomyces albus «G» отмечает также Гюзен (Ghuysen et al, 1969). По-видимому, потенциально, организм способен секретировать более широкий спектр литических ферментов, чем реально секретируемый в определённых, выбранных экспериментатором условиях. Многие бактерии способны осуществлять индуцированный синтез литических ферментов (Bronneke et al, 1994, Nishi et al, 1999).
Так как клеточные стенки бактерий очень сложная структура, то выявление истинных индукторов синтеза литических ферментов является трудной задачей. К тому же, выбор эубактерий, на которых проверяется действие литических ферментов, во многом случаен и, следовательно, нет гарантии, что учитываются все литические ферменты, секретируемые продуцентом. Всё это препятствует полному определению литического спектра бактериолитических комплексов и литического спектра отдельных ферментов. Так, бактериолитический комплекс S. albus «G», имеющий достаточно широкий спектр действия, включает в себя стафилолитический комплекс, в состав которого входит четыре из шести бактериолитических ферментов S. albus «G» (мурамидаза, две эндопептидазы и амидаза) (табл. 1). Таким образом, очевидно, что если бы работу проводили целеноправленно по выделению стафилолитических ферментов, часть других бактериолитических ферментов, секретируемых продуцентом не была бы идентифицирована. Следовательно, сужая размах работы с целью более полного решения поставленной задачи, исследователь вынужден отказаться от возможности изучения взаимодействия всех компонентов литического комплекса. Работа с комплексами бактериолитических ферментов осложняется ещё и тем, что в культуральной жидкости продуцентов могут присутствовать факторы неферментной природы, влияющие на действие литических ферментов.
Так Bacillus subtilis YT-25 способен разрушать клетки Pseudomonas aeruginosa только в сочетании с нативным литическим фактором (NTF) (табл. 1). Кроме того, действие ферментов с одинаковой субстратной специфичностью зависит от структуры пептидогликана. Например, мурамидаза,S. albus "G" гидролизует только связи, образованные мурамовой кислотой, связанной с пептидной частью пептидогликана (Munoz et al., 1966). А действие двух мурмидаз из Streptomyces globisporus 1829 в различной степени зависит от присутствия О-ацетильных групп на остатке мурамовой кислоты. Присутствие О-ацетильных групп ингибирует действие М-2 мурамидазы, никак не влияя на М-1 мурамидазу (Kawata et al., 1983а). Так как в состав сложных литических комплексов входят несколько ферментов с разной субстратной специфичностью, то естественней вопрос о их взаимодействии и порядке действия в процессе лизиса клеточных стенок. Литические ферменты с одинаковой субстратной специфичностью, по-видимому, не проявляют эффекта синергизма при действии на клеточные стенки бактерий (Yokogawa et al., 1975). В то время как действие на клеточную стенку нескольких литических ферментов с разной субстратной специфичностью приводит к более полному её лизису (Ward, Perkins, 1968, Yoshimoto, Tsuru, 1972). Эубактерий, способные секретировать комплекс бактериолитических ферментов с различной субстратной специфичностью и механизмом действия имеют значительные преимущества по сравнению с другими. С одной стороны, спектр бактерий, которые могут быть разрушены комплексом литических ферментов, значительно шире по сравнению со спектром бактерий, которые могут быть разрушены отдельным литическим ферментом, с другой стороны, действие комплекса приводит к более полному разрушению клеточных стенок.
Таким образом, для внеклеточных бактериолитических комплексов характерны следущие свойства: 1. Ферменты комплекса обычно различаются по литическому спектру и механизму действия. 2. Активность отдельных компонентов комплекса значительно ниже активности целого комплекса. 3. Широкий спектр комплекса является результатом совместного действия ферментов. Специфическим субстратом бактериолитических ферментов являются клеточные стенки бактерий. Они представляют собой многокомпонентную структуру, защищающую содержимое бактериальной клетки и осуществляющую её связь с внешней средой (Koch, 1995, Navarre, Schneewind, 1999). Клеточные стенки бактерий интенсивно изучались на протяжении нескольких десятков лет, поскольку особенности строения клеточной стенки определяют взаимоотношение бактериальной клетки с окружающей средой и ее способность быстро изменять обмен веществ в зависимости от внешних условий (Степная и др., 1999). Наиболее полно представление о строении клеточных стенок эубактерий отражено в следующих обзорах (Salton, 1952, Rogers et al, 1980, Archibald et al, 1993, Salton, 1994, Labischinski, Maidhof, 1994). Структура клеточных стенок грамположительных и грамотрицательных бактерий различна (рис. 1а,б). В табл. 2 приведена сравнительная характерис тика компонентов клеточной стенки эубактерий. t Клеточная стенка грамположительных бактерий. Грамположительные бактерии окружены аморфной клеточной оболочкой толщиной 20-80 нм. В качестве основного полимера она содержит пептидогликан, который составляет 50-80% всей массы стенки (Rogers, Perkins, 1980). С ним ковалентно связаны тейхоевые, тейхуроновые кислоты и полисахариды (табл. 2). Липотейхоевые кислоты, входящие в состав цитоплазматических мембран ряда грампо ложительных бактерий, являются глицеринтейхоевыми. Диглицеридные остатки липотейхоевых кислот и липоманнанов «заякорены» в липидной части цитоплазматической мембраны. Липотейхоевые кислоты проходят через слой пептидогликана и выполняют функции поверхностных антигенов (табл. 3). Цитоплазматические мембраны грамположительных бактерий могут содержать и так называемые липогликаны (табл. 2). Обычно бактерии содержат в составе мембраны или липотейхоевые кислоты, или липогликан. (Fischer, 1994). Довольно часто, с клеточной стенкой грамположительных микроорганизмов бывают ассоциированы белки (Messner, Sleytr, 1991, Messner, Sleytr, 1992, Navarre, Schneewind, 1999, Monogodin, et al., 2000, Tonhat et-al, 2000). Белки клеточных стенок большинства грамположительных бактерий образуют на поверхности клетки регулярную структуру (Krauze, 1977, Sleytr et al, 1993, Sleytr, 1997). Грамположительные бактерии разработали ряд механизмов, багодаря которым белки могут иммобшшзовываться на их поверхности. Эти механизмы включают либо ковалентное присоединение белка к пептидогликану, либо нековалентное связывание белка с пептидогликаном или «вторичными» полимерами клеточной стенки, такими как тейхоевые, тейхуроновые, липотейхоевые кислоты (Navarre, Schneewind, 1999). Структура клеточной стенки грамположительных бактерий представлена на рис. 1а.
Механизм действия автолизина Staphylococcus aureus на клеточную стенку S. aureus
Как известно, стафилококки делятся в направлении перпендикулярном плоскости предшествующего деления. Atl-фермент - автолизин стафилококка, atl мутантные клетки имеют характерное нарушение деления и роста клеток в виде больших кластеров (Sugai et ah, 1995). Atl ген кодирует большой полипептид-препрофермент, состоящий из нескольких доменов (Foster, 1995, Oshida et al., 1995, Brunskill, Bayles, 1996). N-концевой сигнальный пептид необходим для экспорта (Baba, Schneewind, 19986). Секретируемый Pro-Atl состоит из двух частей (198 и 775 аминокилотных остатков) (Oshida et al, 1995, Baba, Schneewind, 19986). Последующее расщепление приводит к образованию N-концевого пропептида с неизвестной функцией и двух доменов с ферментативными функциями амидазы и глюкозаминидазы (Singer et ah, 1972, Tipper, 1969). Три повторяющихся домена расположены в центре pro-Atl. Зрелая амидаза содержит два С-концевых повтора, а зрелая глюкозаминидаза - один повтор на N-конце (Oshida et al., 1995). Эти повторяющиеся домены направляют Atl к сайту деления стафилококка (Baba, Schneewind, 19986), структуре, названной экваториальным поверхностным кольцом (Baba, Schneewind, 19986, Yamada et al., 1996). Зрелая амидаза и глюкозаминидаза остаются связанными на поверхности кольца (Baba, Schneewind, 19986, Yamada et al, 1996). Значение синхронизации процессинга и прикрепления не ясно.
Присоединение повторяющихся доменов к другим пептидам направляет гибридный белок к экваториальным поверхностным кольцам. Следовательно, повторяющиеся домены Atl надлежащим образом направляют фермент к сайтам деления, на которых, возможно, локализованы специфические рецепторы для Atl (Baba, Schneewind, 19986). Предполагают, что. специфическое «декорирование» пептидогликана определяет будущее местоположение фермента на клеточной поверхности. Таким образом, определение сайтов деления клетки происходит путем создания химически «декорированного» пептидогликанового экзоскелета, что, возможно, обеспечивает «участки заякоривания» автолитических ферментов (Rothfield, Justice, 1996, Rothfield, Justice, 1997). На рис. 8 изображена схема действия Atl-фермента на клетки S. aureus. экваториальных колец стафилококка, что определяет будущий участок деления. Процесс присоединения определяется повторяющимися доменами (R1-R3) Pro Atl. В результате протеолитического расщепления образуется зрелая амидаза (Atl-A) и глюкозаминидаза (Atl-G), которые содержат один или два повторяющихся домена и остаются связанными с поверхностными кольцами. Эти ферменты гидролизуют клеточную стенку. C. Процесс гидролиза клеточной стенки S. aureus автолитической амидазой (Atl-A) и глюкозаминидазой (Atl-G), вероятно, синхронизирован с внутриклеточным сокращением FtsZ колец. Так образуются две дочерние клетки S. aureus. D. Поскольку, у стафилококков деление происходит в направлении перпендикулярном плоскости предшествующего деления, то присоединение pro-Atl ко второму экваториальному кольцу может инициировать процесс гидролиза на участке будущего клеточного деления. Бактериолитические ферменты можно разделить на два класса (Navarre, Schneewind, 1999): 1. Ферменты, которые кодируются генами на бактериальной хромосоме, экспортируемые с помощью N-концевого сигнального пептида. 2. Ферменты, гены которых локализованы на хромосоме бактериофага, лишенные сигнального пептида и экспортируемые с помощью основного механизма лизиса.
Последний класс генов вызывает индукцию лизогенных фагов в конце логарифмической фазы роста. Для того чтобы получить более полное представление о механизме действия литических ферментов на клеточную стенку S. aureus, рассмотрим механизм действия некоторых фаг-кодируемых гидролаз пептидогликана. Из литературы известно, что бактериофаг лямбда Е. coli использует S литический фермент (холин) для того, чтобы разрушить мембрану клетки хозяина (Reader, Siminovitch, 1971, Altaian et al, 1983, Blasi et al, 1990). Этот механизм позволяет фаг-кодируемым внутриклеточным гидролазам пептидогликана покидать цитоплазму и разрушать пептидогликан, который расположен в периплазматическом пространстве грамотрицательньгх бактерий (Black, Hogness, 1969, Lis, Schleif, 1971). Без гидролиза пептидогликана фаговые частицы не могут освобождаться в экстрацеллюлярную среду (Reader, Siminovitch, 1971). Подобная стратегия используется также бактериофагами грамположи-тельных бактерий (Ronda-Lain et al, 1977). Так например, фаг ф11 экспрессирует гидролазу пептидогликана (LytA), лишенную N-концевого сигнального пептида (Wang et ah, 1991, Wang et al, 1992). LytA-фермент имеет С-концевой целевой сигнал, подобный таковому эндопептидазы лизостафина (Baba et al, 1996) и его N-концевые домены кодируют d-Ala-Gly эндопептидазу и амидазу (Navarre, Schneewing, 1999). Соседняя к lytA - открытая рамка считывания литического фермента с последовательностью гомологичной холинам бактериофагов грамотрицательньгх бактерий (Borchardt et ah, 1993). Отметим, что подобная генетическая организация обнаружена для литических ферментов фагов стафилококков 80а и Twort (Bon et al, 1997, Loessner et al., 1998). Итак, фаг-кодируемые гидролазы пептидогликана S. aureus - фі 1, 80a, Twort высвобождаются из цитоплазмы только после холин-индуцируемого нарушения цитоплазматической мембраны, что осуществляется в процессе литического цикла фага. С-концевой направляющий сигнал LytA фага ф11 подобен таковому эндопептидазы лизостафина и также направляет литические ферменты к их рецепторам в оболочке клеточной стенки S. aureus. Рассмотрим механизм действия автолизина Streptococcus pneumoniae на клеточные стенки пневмококка с холином. Литические ферменты пневмококков являются результатом слияния двух независимых функциональных модулей, где С-концевой домен, вероятно, ответственней за узнавание холин-содержащей ! стенки, а активный центр локализован в N-концевой части белка (Lopez et ah, 1992, Garcia etal, 1994/ Ферменты обладают как субстратной, так и связывающей специфичностями.
Первая относится к их взаимодействию с нерастворимыми субстратами, тогда как вторая определяет участок их действия (Garcia et ah, 1999). Холин может служить как элемент сильного отборочного давления для сохранения определенных структур хозяина и фаговых литических систем, что приводит к гомологиям в последровательности литических ферментов пневмококков. Возможно, литические ферменты пневмококков эволюционируют путем модулярных обменов - пример способа организации генов, с помощью которого бактерия или фаг адаптируется к новым ситуациям в окружающей среде (Lopez etal, 1992, Lopez et ah, 1997). S. pneumoniae синтезирует автолизин, который гидролизует клеточную стенку бактерий в стационарной культуре (Tomasz et ah, 1970). Полагают, что фермент может находиться в двух формах: неактивной цитоплазматической и ассоциированной с мембраной активной форме (Brise, Hakenbeck, 1985). Неактивная форма (Е) накапливается в клетках, которые выращиваются в среде с этаноламином, тогда как более активный (С) фермент - в клетках, выращенных на среде содержащей холин. Неактивный фермент был очищен до гомогенного состояния методом афинной хроматографии на холин-Сефарозе (Brise, Hakenbeck, 1985), или ионообменной хроматографии на DEAE (Sanz et ah, 1988). Фермент может быть активирован добавлением холина (Holtje, Tomasz, 1975а.), что позволило предположить, что холин является необходимым кофактором (Giudicelli, Tomasz, 1984). Предположительно, LytA-амидаза претерпевает конформационные изменения, когда сталкивается с холином, в результате чего образуется активный фермент (Holtje, Tomasz, 1975 а,б.в, Sanchez-Puelles et ah, 1987). Определение нуклеотидной последовательности lytA гена обнаружило открытую рамку считывания полипептида с молекулярной массой 31-кДа (Garcia et ah, 1988).
Открытая рамка считывания имеет последовательность гомологичную генетической последовательности, кодирующей ферментативные домены многих других известных амидаз (Romero et ah, 1990). Кроме того, шесть повторяющихся доменов, локализованных на С-конце LytA (Garcia et ah, 1988, Sanchez-Puelles, 1990), не найдены в последовательностях амидаз бактерий других видов, но обнаружены у различных фаг-кодируемымых гидролаз пептидогликана S. pneumoniae (Lopez et ah, 1997). Показано, что экспрессированные в Е. coli и очищенные до гомогенного состояния Lyt А повторы связывают холин, и поэтому названы холин-связывающими повторами. Таким образом, LytA присоединяется к холин-содержащим тейхоевым кислотам клеточной стенки, что приводит к его ферментативной активации и гидролизу пептидогликана (Holtje, Tomasz, 1975а,б.в). Поскольку тейхоевые и липотейхоевые кислоты пневмококков имеют подобную химическую структуру (Jennings et ah, 1980, Bechr et ah, 1992, Fischer et ah, 1993, Fischer et ah, 1997), можно предположить, что LytA-амидаза может связываться в обоих случаях. LytA открытая рамка считывания не обнаруживает N-концевого сигнального пептида (Garcia et ah, 1988), и либо LytA не экспортируется в физиологических условиях, либо его экспорт может осуществляться иным путем, чем тот, который мы знаем (Diaz et ah, 1989). Экспрессированный в Е. coli LytA-фермент транслоцируется через цитоплазматическую мембрану и обнаруживается с помощью метода иммунологического мечения золотом на периплазматическом участке цитоплазматической мембраны (Diaz et al, 1989).
С помощью этого же метода у S. pneumoniae было обнаружено LytA окрашивание на поверхности клетки, что выявляло, что фермент транслоцируется и может быть обнаружен на поверхности клетки (Diaz et al, 1989). Необходима дальнейшая работа для того, чтобы больше узнать о механизме экспорта LytA. PspA (поверхностный белок A) S. pneumoniae - основной антиген при инфекциии животных. PspA синтезируется с N-концевым сигнальным пептидом (Yother, Briles, 1992). На С-концах PspA содержит домены гомологичные таковым lytA-амидазе (Yother, Briles, 1992). Укорачивание С-концевого домена на пять остатков освобождает мутантный белок в супернатант культуры (Yother et al, 1992). Эти результаты сравнимы с теми, которые наблюдаются для LytA, которые показывают, что для присоединения белка к поверхности пневмококка требуется по крайней мере четыре повторяющихся домена. LytA домены необходимы также для присоединения к холин-содержащим тейхоевым кислотам клеточной стенки. Это было доказано как с помощью экспрессии химерных белков сшитых с LytA повторами пневмококков (Romero et al, 1993, Smith et al., 1995), так и с помощью дополнительной очистки рекомбинантных белков в культурах S. pneumoniae (Croux et al., 1993). Таким образом, литические ферменты пневмококков, как и многие другие белки, имеют доменную структуру. В результате исследования их структуры возникла идея модулярной организации литических ферментов пневмококков (Diaz et al, 1991, Lopez et al, 1992, Croux et al, 1993, Garcia et al, 1994, Birkeland,1994, Lopez et al, 1997, Sheehan et al, 1999). С-концевые LytA-повторы автолизина S. pneumoniae направляют фермент к холин-содержащим тейхоевым кислотам клеточной стенки пневмококка. LytA фермент присоединяется к холин-содержащим тейхоевым кислотам клеточной стенки, что приводит к его ферментативной активации и гидролизу пещгидогликана. Итак, некоторые гидролазы пептидогликана, такие как: глицилглицин-эндопептидаза лизостафина, автолизин S. aureus, LytM эндопептидаза & aureus, автолизин Streptococcus pneumonia, устроены таким образом, что домены цели: С-концевые С WT-повторы (cell wall targeting) узнают специфические рецепторы на поверхности бактерий-мишеней. Домен цели не может распознать интактный пептидогликан, т.к. эта структура весьма консервативна у всех грамположительных бактерий. Возможно, анионные полимеры клеточной стенки действуют как рецепторы литических ферментов в процессе лизиса грамположительных бактерий. Фаг-кодируемые гидролазы пептидогликана S. aureus - фіі, 80а, Twort высвобождаются из цитоплазмы только после холин-индуцируемого нарушения цитоплазматической мембраны, что осуществляется в процессе литического цикла фага. С-концевой направляющий сигнал фага ф11 подобен таковому эндопептидазы лизостафина и также направляет литические ферменты к их рецепторам в оболочке клеточной стенки S. aureus.
Изучение действия бактериолитических ферментов лизоамидазы на клетки, клеточные стенки, и пептидогликан грамположительных бактерий
Все операции проводили аналогично вышеописанному, но ферментативный комплекс предварительно инкубировали с тейхоевой кислотой при 20С 60 мин, добавляя в опыт количество тейхоевой кислоты сопоставимое с содержанием этого полимера в клеточной стенке. Клетки S. aureus 209-Р, М. luteus предварительно инкубир9вали в расстворе MgCl2) СаС12 (6, 10, 50, 100 мМ), 2 час, при 25С, затем, 12 час, при 4С. Определяли бактериолитическую активность. Отмывали 3 раза дистилиро-ванной водой, определяли бактериолитическую активность. 104 мг клеточной стенки помещали в 5 мл 0.25 М раствора NaI04 в 0,02 М. трис НС1, рН 6,0 на 72 час при комнатной температуре. Затем периодат отмывали большим количеством (200 мл.) дистилированной воды на центрифуге. Полученный осадок гидролизовали 0,5 М НС1 при комнатной температуре, в течение 8 час и кислоту отмывали дистилированной водой до нейтральной реакции. Далее препарат высушивали спиртом и ацетоном. Перед измерением бактериолитической активности, грамотрицательные микроорганизмы выдерживали 15 мин. в растворе полимиксина В в 0,01 М трис-НС1, рН 8,0 (300, 600, 1000 Е/пробу), 37С. Определяли бактериолитическую активность. К 0,5 мл взвеси пептидогликана E.coli в 0,01 М трис-HCl буфере, рН 8,0 (поглощение 0,7), добавляли 200 мкл раствора липополисахарида Е. coli (20 мг/мл рабочего буфера) и 50 мкл раствора лизоамидазы (3 мг/мл. рабочего буфера). Смесь инкубировали от, 15 мин при температуре 52С. Определяли бактериолитическую активность. Полисахарид лизоамидазы получали в процессе очистки Л1-пептидазы. Использовали препараты лизоамидазы полученные на опытно-технологической установке
Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, а также на заводе ферментных препаратов, г. Вышний Волочёк. В качестве первой стадии очистки пептидазы Ш использовали гельфильтрацию на сефакриле S-200 (20/150 см), уравновешенном 0,1 М глицин-NaOH буфером, рН 12. На колонку наносили 4 г лизоамидазы, растворенной в 200 мл того же буфера. Элюцию вели стартовым буфером со скоростью 30 мл/час. Полисахарид определяли антроновым методом, осаждали цетримидом (100 мл раствора полисахарида/60 мл раствора цетримида в Н2О (3 г/ 50мл), расстворяли осадок в растворе NaCl и переосаждали спиртом. Проводили дополнительную очистку на колонке (2,5/10 см) с DEAE-сефадексом, рН 8.0. Деацетилированный полисахарид получен в лаборатории химии углеводов, ИОХ РАН. Для определения влияния полисахарида на активность бактериолитических ферментов лизоамидазы на клетках S. aureus определяли бактериолитическую активность по методике, добавляя к 600 мкл субстрата полисахарид лизоамидазы (соотношение фермент:полисахарид - 1:60, 1:80, 1:100) и 100 мкл фермента. Содержание белка измеряли по поглощению при 280 нм и по методу Брэдфорд (Bradford, 1976). Для определения белка по методу Бредфорд 50 мкл раствора фермента, содержащего 5-50 мкг белка смешивали с 2,5 мл реагента и сразу же измеряли поглощение при 595 нм. Концентрацию белка в пробе рассчитывали по калибровочной кривой. Реагент готовили непосредственно перед опытом путем смешивания реактивов А и В в отношении 1:19. Реактив А-0,2% раствор Кумасси-Г-250 в 96%-ном этаноле, реактив Б-смесь 100 мл 85%-ной фосфорной кислоты и 850 мл воды. Полисахарид лизоамидазы определяли антроновым методом (Захарова, Косенко, 1982). Для этого к 4 мл охлажденного свежеприготовленного 0,2% раствора антрона в концентрированной серной кислоте добавляли осторожно наслаивая, 1-2 мл раствора, содержащего 10-20 мкл углеводов, охлаждали в ледяной бане. Смесь несколько раз интенсивно встряхивали, после этого выдерживали несколько минут при комнатной температуре и кипятили в течение 16 мин. Охлаждали в водяной бане. Измеряли поглощение при 520 нм на СФ-26.
Количество полисахарида определяли по калибровочной кривой, построенной для глюкозы. Кислотный гидролиз клеточной стенки, пептидогликана и тейхоевых кислот проводили в следующих условиях: для обнаружения продуктов деградации тейхоевых кислот субстрат обрабатывали 2 н. НС1, 3 час, 100С; для идентификации аминокислот пептидогликана - 6 н. НС1, 18 час, 100С. Аминокислоты идентифицировали на аминокислотном анализаторе "Hitachi" (Япония). Общий фосфор определяли по методу Вейл-Мелербе и Грина (Weil-Malherbe, Green, 1951). Для этого к 0,5 мл пробы добавляли 0,2 мл 57% НСЮ4, помещали в печь при 100С. После испарения воды и побурения расствора, температуру повышали до 180С и продолжали сжигание. При 180 С идет конденсация фосфора и образование пирофосфата. После сжигания, конец которого узнают по обесцвечиванию пробы, в пробирку добавляли 2 мл НгО и гидролизовали 20 мин на кипящей водяной бане, при этом пирофосфат переходит в ортофосфат. Затем нейтрализовали раствор, добавляя NH4OH, до рН 7 и доводили объем пробы до 5 мл. К 5 мл образца добавляли 6 мл смеси изобутанол-бензол (1:1), 1мл 5% молибдата аммония в 4 н. H2SO4 и встряхивали 15-20 сек. После расслоения раствора, нижний водный слой осторожно отсасывали и отбрасывали. Оставшийся слой изобутанол-бензол обезвоживали, добавляя на кончике скальпеля безводный Na2S04. Обезвоженный слой совершенно прозрачен и имеет желтоватый оттенок. Сухой пипеткой из обезвоженного слоя переносили 1 мл во вторую пробирку. Затем, туда добавляли 1 мл кислого этанола (490 мл абсолютного этанола + 10 мл конц. H2SO4). Полученную таким образом смесь перемешивали, после чего добавляли 0,04 мл рабочего раствора олова (10 г. SnCh в 25 мл конц. НС1), приготовленного непосредственно перед определением, и немедленно перемешивали. Через 15 мин измеряли поглощение на спектрофотометре с красным фильтром против смеси изобутанол-бензол. Количество фосфата в пробе определяют по калибровке для КН2РО4. Фосфор лабильных соединений определяли также, но гидролиз образца проводили в течение 7 мин ОДМ НС1 при 100С. Фосфор нуклеиновых кислот определяли по Спирину (Спирин, 1958).
Для этого к исходному материалу (5-500 мг) добавляли 5-10 мл НСЮ4 и нагревали 20 мин на кипящей водяной бане. После охлаждения и центрифугирования измеряли величину поглощения в надосадочной жидкости при 270 и 290 нм. Для расчета количества микрограммов нуклеинового фосфора в 1 мл раствора разность между этими величинами делится на 0,19. Количество тейхоевой кислоты (в процентах от общего веса клеточной СТеНКи) В КЛеТОЧНОЙ СТеНКе раССЧИТЫВаЛИ ПО формуле: (Р0бщий - ( Рнуклеиновых кислот + Рлабильных соединений)) Кта (коэффициент, рассчитанный на основании структурной формулы тейхоевой кислоты). Коэффициенты: для S. aureus - 12,0; для S. chrysomallus -10,0; для S. azureus -12,0; для S. roseoflavus var.roseofungini - 8,0; для N. dassonvillei - 8,0; для G. harbinensis -10,0. Количество пептидогликана в клеточной стенке рассчитывали, учитывая содержание диаминопимелиновой кислоты (Агрш) и молекулярный вес средней мономерной единицы пептидогликана. Пептидогликан (% от общего веса клеточной стенки) = Агрт (мкМоль в 100 мг стенки)х к, где к = 960 х 10"3 ( для А Зу-типа) и 940 х 10"3 (для А1у-типа). Редуцирующие сахара определяли методом Парка и Джонсона (Park, Johnson, 1959). К 1 мл нейтрализованого гидролизата клеточной стенки S. au reus 209-Р добавляли 1 мл феррицианидного реагента (0,5 г феррицианида калия K3Fe(CN)6 в 1л НгО) и 1 мл карбонатцианидного реагента (5,3 г карбоната натрия и 0,65 г KCN на литр раствора). После перемешивания пробирки нагре вали в кипящей воде 15 минут и охлаждали. Затем к пробе добавляли 5 мл реак тива, содержащего сульфатаммонийное железо (1,5 г NH4Fe(S04)xl2 Н2О и 1г додецилсульфата натрия в 1л 0,05 н. H2SO4), и смесь перемешивали. Развива лась синяя окраска, которую определяли через 15 минут при 690 нм. Количество редуцирующих групп определяли по калибровочной кривой, построенной для N-ацетилглюкозамина. ,
Присутствие в гидролизате свободных NH2-rpynn определяли методом Гюзена и Строминджера (Ghuysen et ah, 1966). К 0,5 мл гидролизата клеточной стенки добавляли 0,06 мл раствора 2,4-динитрофторбензола (130 мкл в 10 мл абсолютного этанола). Смесь выдерживали в водяной бане при 60С 30 мин. Затем к образцам добавляли 2,4 мл 2 н. НС1 и измеряли поглощение на спектрофотометре при 420 нм. Содержание свободных NH2-rpynn определяли по калибровочной кривой, построенной по глютаминовой кислоте. Определение вели следующим образом: готовили раствор 3,4-динитро-фенил-тетра-ІЧ-ацетил-Р-В-хитотетраозида (Ballardie, Capon, 1972) в 0,01 М трис-HCl буфере рН 8,0, в концентрации 120 мкг/мл. В контрольную пробирку вместо фермента добавляли 100 мкл буфера. Смесь инкубировали при 37С, 24 час. Об активности фермента судили по увеличению поглощения при 400 нм. Определение вели следующим образом: к 150 мл раствора антранилоил-аланил-аланил-фенилаланил-р-нитроанилида (Abz-Ala-Ala-Phe-pNa) в диметил-формамиде (5 мг/мл) добавляли 350 мкл 0,05 М трис-HCl буфера рН 8,0 и 150 мкл фермента. В контрольную пробирку вместо фермента добавляли 150 мкл буфера. Смесь инкубировали при 37С, 24 час. Об активности фермента судили по увеличению поглощения при 410 нм.
Характеристика бактериолитических ферментов лизоамидазы
Были определены основные физико-химические свойства гомогенных бактериолитических ферментов лизоамидазы (табл. 5). Были определены основные физико-химические свойства выделенной бактериолитической пептидазы Л1. Молекулярный вес фермента - 21 000 Да (рис. 18). Наибольшую активность фермент проявляет при концентрации буфера в реакционной среде равной 50 мМ (рис. 19). Оптимум рН реакции лизиса клеток S. aureus бактериолитической пептидазой Л1 широк. Максимальную активность фермент имеет при рН от 7 до 11 (рис.20). , Оптимум температуры реакции лизиса клеток S. aureus пептидазой Л1 -70С (рис. 21). Температура полуинактивации фермента - 55С (рис. 22). Были определены основные физико-химические свойства очищенного фермента. Молекулярная масса мурамидазы - 22 400 Да (рис. 23). Выяснилось, что этот фермент очень чувствителен к повышению ионной силы рабочего буфера (рис. 24). Оптимум рН действия фермента на клетки S. aureus - 8,0 (рис. 25 ). Оптимум температуры реакции мурамидазы - 60С (рис. 26). 50 % активности фермента утрачивается после его прогрева в течение 15 минут при 65С (рис. 27). Показано, что полученный из культуральной жидкости малоактивного штамма фермент, по свойствам и специфичности идентичен пептидазе Л2 высокоактивной формы. Из представленных данных видно, что каждый бактериолитический фермент X. campestris ИБФМ 124 имеет уникальную комбинацию свойств, хотя и очень близких. Наиболее выражены различия в оптимуме концентрации буфера и оптимуме температуры реакции.
Так например, Л1-пептидаза проявляет наибольшую активность при концентрации буфера в реакционной среде равной 50 мМ, тогда как бактериолитическая пептидаза Л2 - 5 мМ (Степная и др., 1992). Оптимум концентрации рабочего буфера мурамидазы очень низкий. На рис. 24 видно, что наибольшая бактериолитическая активность фермента проявляется при концентрации буфера - 0,1 мМ. Причём, максимальную активность мурамидаза проявляет при использовании вместо буфера дистиллированной воды. Интересно отметить высокий температурный оптимум реакции лизиса клеток S. aureus пептидазой Л1 - 70С (Рис. 21). Такой высокое значение может быть объяснено, по-видимому, защитным действием высокомолекулярного Значения молекулярной массы литических ферментов лизоамидазы очень близки, а значения оптимума рН и вовсе одинаковы. Важно отметить, что комбинации свойств каждого из бактериолитических ферментов лизоамидазы являются строго индивидуальными, но в широком смысле, не отличаются от свойств подавляющего большинства описанных в литературе бактериолитических ферментов, которые характеризуются низким молекулярным весом (наиболее характерный 18 -25 кДа), щелочным значением оптимума рН, низким оптимумом ионной силы (Shockman, Holtje, 1994). Ранее было показано, что на клеточной стенке S. aureus лизоамидаза обладает глицилглицинэндопептидазной, мурамоилаланинамидазной и мурамидазной активностями. Было определено, что один из трех литических ферментов лизоамидазы является мурамидазой и расщепляет в гликановой цепи связь между мурамовой кислотой и глюкозамином с образованием редуцирующей группы на мурамовой кислоте (Степная и др., 1986). Субстратную специфичность бактериолитических ферментов определяли по освобождению редуцирующих Сахаров и свободных NH2-rpynn в процессе лизиса клеточной стенки S. aureus 209-Р. Полученные данные представлены в табл. 6.
Результаты для пептидазы Л2 получены ранее (Степная и др., 1992). В данной работе определена субстратная специфичность Л1, Л2-ферментов лизоамидазы в отношении пептидогликана S. aureus. Под действием ферментов Л1 и Л2 происходила деградация пептидогликана клеточных стенок S. aureus до коротких фрагментов. Гидролиз сопровождался увеличением свободных аминогрупп аминокислот. Свободные аминогруппы, образующиеся после ферментативного гидролиза, становились доступными для взаимодействия с динитрофторбензолом. После динитрофенилирования проводили общий кислотный гидролиз пептидогликана, динитрофторбензольные производные аминокислот экстрагировали хлороформом, оставшиеся аминокислоты анализировали на аминокислотном анализаторе. По разнице в аминокислотном состав судили о расщепляемой ферментом связи, (табл. 7). Из табл. 7 видно, что 0.53 моля глицина и 0.34 моля аланйна, отнесённые на моль глютаминовой кислоты, становились доступны действию динитрофенола после гидролиза клеточных стенок пептидазой Л1. Таким образом можно сделать вывод о том, что Л1-фермент обладает глицилглицинэндопептидазной и мурамоилаланинамидазной активностями. Действие Л2-пептидазы на клеточные стенки стафилококка приводит к освобождению 0.15 молей N-концевого аланйна. Эта величина недостаточно велика, чтобы можно было однозначно сказать, что Л2-фермент является мурамоилаланинамидазой. Поэтому, мы провели сравнительное изучение активности ферментов лизоамидазы на клетках М. luteus и S. aureus. Структура межпептидного мостика микрококка имеет иное строение и аналогична структуре его пептидной субъединицы (рис. 28), в отличие от S. aureus, в состав пептидогликана которого входит пентаглициновьш межпептидный мостик (рис. 29), Следовательно, на клеточной стенке М. luteus может проявиться мурамидазная и мурамоилаланинамидазная и не проявляется глицилглицин-эндопептидазная активность бактериологических ферментов лизоамидазы. Из табл. 8 видно, что величина бактериолитической активности Л2-фермен-та на клетках S. aureus и М. luteus сопоставима и может определяться только мурамоилаланинамидазной активностью. Величина активности Л1-фермента на клетках М. luteus также может быть отнесена на счет мурамоилаланинамидазной активности.
Таким образом, в данной работе показано, что пептидогликан S. aureus Л1-пептидаза гидролизует как глицилглицинэндопептидаза и мурамоилаланилами-даза, а Л2-пептидаза обладает на этом субстрате только мурамоилаланиламидаз-ной активностью (рис. 29). Известно, что у некоторых грамположительных бактерий в процессе связывания автолизинов с клеточными стенками участвуют анионные полимеры, в том числе тейхоевые, тейхуроновые и липотейхоевые кислоты (Herbold, Glaser, 1975, Giudicelly, Tomasz, 1984, Fischer, 1994, Shockman, 1994, Наумова, Шашков, 1997, Navarre, Schneewind, 1999). Механизм взаимодействия автолитических ферментов и стеночных тейхоевых кислот пока до конца не понят, но очевидно, что он может быть разным. Показано, что для эффективного лизиса клеток пневмококков и клостридий необходимо присутствие фосфорилхолиновых остатков на тейхоевой кислоте (Tomasz et al, 1968, Podvin et al., 1988). Замена холина на этаноламин в структуре тейхоевой кислоты приводит к тому, что клетка не автолизируется, не подвергается генетической трансформации, не лизируется в присутствии бактерицидных антибиотиков, и при этом подавляется разделение дочерних клеток (Tomasz, 1968).
В случае бацилл и стафилококков предполагаются электростатические взаимодействия между тейхоевой кислотой, отрицательный заряд которой обусловливается фосфатными группами, и автолизинами, которые в большинстве случаев являются положительно заряженными белками (Наумова, 1997). Внеклеточные литические ферменты являются орудием, направленным на деградацию клеточных стенок других бактерий, например, соседей по той или иной экологической нише (Кулаев и др., 1984, Скрябин, Кулаев, 1990). К настоящему времени известно значительное количество бактериальных литических экзоферментов, обладающих определенным спектром антибактериального действия (табл. 1). Однако ни в одном из известных случаев до сих пор не выявлен механизм действия бактериальных литических экзоферментов на бактериальные клетки-мишени. В последнее десятилетие наибольшее распространение получил структурный подход к изучению действия бактериолитических ферментов на клетки-мишени. Этот способ предполагает создание методами генной инженерии химерных литических ферментов с последующим изучением их действия на бактериальную клетку. Таким образом был предложен возможный механизм действия автолизина S. aureus, LytM автолитической эндопептидазы S. aureus, автолизина Streptococcus pneumonia, фаг-кодируемых гидролаз пептидогликана S. aureus - фіі, 80а, Twort (Diaz et al., 1989, Yother et al, 1992, Romero et al., 1993, Smith et ah, 1995, Baba, Schneewind, 1996, Baba, Schneewind, 19986, Navarre, Schneewind, 1999). Для внеклеточных бактериолитических ферментов наиболее изучено действие эндопептидазы лизостафина (Lst) на клетки S. aureus (Navarre, Schneewind, 1999). Установлено, что С-концевой CWT-домен эндопептидазы лизостафина направляет фермент к его рецептору на поверхности S. aureus, и Lst специфически связывается с клеточной стенкой бактерии посредством С-концевого домена. О роли тейхоевых, тейхуроновых кислот клеточной стенки в механизме действия эндопептидазы лизостафина и других экзоклеточньгх бактериолитических ферментов ничего не известно.
