Карбогидразы : Препаративное получение, структура и механизм действия на олиго- и полисахариды Корнеева Ольга Сергеевна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Карбогидразы, их классификация и биологическая характеристика. Гидролиз олиго- и полисахаридов 12

1.1. Общие закономерности ферментативного гидролиза олиго-и полисахаридов 12

1.2. Характеристика отдельных представителей карбогидраз и их субстратов 12

1.3. Микробный синтез карбогидраз 23

1.4. Конститутивная и индуцибельная природа карбогидраз. Индукция и репрессия синтеза 30

1.5. Физико-химические свойства карбогидраз 36

1.6. Современные представления о структуре карбогидраз 42

1.7. Структура активных центров карбогидраз 56

1.8. О механизе расщепления гликозидных связей под действием карбогидраз 65

1.9. Перспективы практического применения карбогидраз 68

Экспериментальная часть

Глава 2. Объекты и методы исследований 75

2.1. Объекты исследований

2.1.1. Культивирование ацетонобутиловых бактерий 75

2.1.2. Культивирование продуцентов |3-галактозидазы 76

2.1.3. Культивирование микромицетов - продуцентов (3-фруктофуранозидазы и инулиназы 77

2.2. Определение активности гликозидаз

2.2.1. Определение активности сс-амилазы 77

2.2.2. Определение активности глюкоамилазы 78

2.2.3. Определение активности (3-галактозидазы 79

2.2.4. Определения активности инулиназы 80

2.2.5. Определение активности |3-фруктофуранозидазы 81

2.3. Приготовление субстратов 82

2.4. Выделение и очистка карбогидраз 84

2.4.1. Получение спиртоосажденных ферментных препаратов 84

2.4.2. Фракционирование белков с помощью сульфата аммония 84

2.4.3. Ультрафильтрация 85

2.4.4. Ионообменная колоночная хроматография 86

2.4.5. Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе 86

2.4.6. Электрофорез 87

2.4.7. Очистка инулиназы 87

2.5. Кристаллизация инулиназы А. awamori-2250 88

2.6. Определение молекулярной массы ферментов 90

2.7. Определение мРНК и аминокислотной последовательности инулиназы 91

2.8. Идентификация аминокислотных остатков 92

2.8.1. Модификация имидазольной группы диэтилпирокарбонатом 92

2.9. Методы контроля ацетонобутилового брожения 93

2.10. Общие методы 94

2.11. Статистическая обработка экспериментальных данных 94

Глава 3. Биосинтез карбогидраз микроорганизмами

3.1. Влияние различных источников углерода и азота на биосинтез карбогидраз при глубинном культивировании микроорганизмов 96

3.2. Влияние влажности питательной среды и крахмалистости отрубей на биосинтез карбогидраз при поверхностном культивировании 110

3.3. Влияние некоторых физико-химических факторов на биосинтез карбогидраз 114

Глава 4. Препаративное получение карбогидраз и исследование их физико-химических свойств 128

4.1. Очистка а-амилазы и глюкоамилазы CI. acetobutylicum 128

4.2. фракционирование и очистка (3-галактозидазы и Р-фруктофуранозидазы 135

4.3. Очистка и кристаллизация инулиназы а. awamori-2250 138

4.4. Исследование каталитических свойств карбогидраз 143

4.4.1. Оптимальные значения рН и температуры для действия карбогидраз 144

4.5. Исследование кинетики кислотной и термической инактивации карбогидраз 149

4.5.1. Влияние рН на стабильность а-амилазы Clostridium acetobutylicum 149

4.5.2. Термическая инактивация а-амилазы 154

4.5.3. Кислотная и термическая инактивация глюкоамилазы, инулиназы, (3-галактозидазы и (3-фруктофуранозидазы 157

4.5.4. Термодинамические характеристики процесса инактивации карбогидраз 162

Глава 5. Особенности структуры активного центра карбогидраз и механизма их каталитического действия 167

5.1. Нуклеотидная последовательность мРНК и аминокислотная последовательность инулиназы 167

5.1.2. Гликозилирование карбогидраз 176

5.2. Идентификация каталитически активных групп карбогидраз 179

5.2.1. Идентификация каталитически активных групп карбогидраз по кривым зависимости активности от рН 179

5.2.2. Теплота ионизации каталитически активных групп карбогидраз 182

5.2.3. Идентификация имидазольной группы карбогидраз фотоокислением 183

5.2.4. Ингибирование специфическими реагентами 187

5.3. Исследование механизма ферментативного катализа олиго- и полисахаридов 190

5.4. Специфичность действия карбогидраз 199

5.4.1. Кинетика действия и субстратная специфичность инулиназы А. awamori 206

Глава 6. Применение карбогидраз в пищевой промышленности и биотехнологии 218

6.1. Применение амилолитических ферментов для снижения вязкости сбраживаемых сред в процессе ацетонобутилового брожения 218

6.2. Получение и применение биогидролизатов лактозных сиропов 223

6.3. Ферментативный гидролиз инулинсодержащего сырья 229

6.4. Использование инулиназы при сбраживании топинамбура в этанол 238

6.5. Сбраживание топинамбура дрожжами рода Kluyveromyces 240

Общие выводы 245

Список литературы 248

Приложения

• Общие закономерности ферментативного гидролиза олиго-и полисахаридов
• Культивирование ацетонобутиловых бактерий
• Влияние различных источников углерода и азота на биосинтез карбогидраз при глубинном культивировании микроорганизмов
• Нуклеотидная последовательность мРНК и аминокислотная последовательность инулиназы

Введение к работе

Актуальность темы. Исследование структуры ферментов и расшифровка механизма их каталитического действия является одной из наиболее актуальных проблем современной энзимологии. Определение первичной структуры ферментов, изучение влияния различных физико-химических факторов на конформацию и активность ферментов, идентификация функциональных групп их каталитических центров, расшифровка механизма катализа ферментов позволяют глубже представить их роль в молекулярных преобразованиях биологически активных соединений в таких научных направлениях как молекулярная генетика, генная инженерия, медицинская биохимия.

Особое внимание заслуживают исследования структуры и механизма действия карбогидраз (О-гликозид-гидролаз, КФ 3.2.1), осуществляющих гидролиз олиго- и полисахаридов. Они широко распространены в природе, играют большую роль в обмене веществ живой клетки, преобразуя сложные субстраты в более простые сахара, доступные клетке для дальнейшего катаболизма с целью получения необходимых структурных элементов и химической энергии. Карбогидразы - эффективные катализаторы, осуществляющие гидролитическую реакцию с большой скоростью и 100 %-ным выходом продукта, тогда как кислотный гидролиз требует жестких условий (большие концентрации Н⁺-ионов, высокая температура). Интерес биохимиков и биотехнологов к реакциям ферментативного гидролиза олиго- и полисахаридов объясняется тем, что подобные реакции обусловлены как сугубо фундаментальными, так и прикладными задачами. Обладая строгой специфичностью действия ферменты дают возможность получить из традиционного и нетрадиционного сельскохозяйственного сырья продукты с заданными свойствами и высокой биологической ценностью.

Изучение механизмов ферментативного катализа гидролитических ферментов, субстратами для которых служат углеводы, является одним из основных направлений научных исследований лаборатории ферментов микроорганизмов института биохимии им. А.Н. Баха РАН, отделения молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики РАН. Вопросам исследования карбогидраз посвящены работы Хорлина А.Я. (1974), Березина И.В. (1990), Клесова А.А. (1984), Reddy М. (1996), Richard J., Huber R. (1996) и других отечественных и зарубежных ученых. Однако трехмерная структура и конформация активного центра определена лишь для некоторых из них. Фруктаногидролазы в этом смысле являются благодатным объектом, так как ни для одного фермента гликозид-гидролаз из семейства 3.2.1.7 и 3.2.1.80 не установлена трехмерная структура и структура их активного центра. Механизм катализа карбогидраз во многом остается неясным; нет какой-либо обобщающей концепции их действия.

Отсутствие четких представлений о механизме функционирования карбогидраз является основной причиной, затрудняющей расшифровку специфичности их действия. В связи с этим особую актуальность приобретает вопрос о взаимосвязи между строением, свойствами и специфической каталитической функцией их активных центров, а также сопоставление полученных зависимостей для различных ферментов. Данный подход позволяет выявить общие закономерности ферментативного гидролиза олиго- и полисахаридов, что в свою очередь является необходимым условием для количественного предсказания реакционной способности карбогидраз.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы явилось выявление общих закономерностей гидролиза олиго- и полисахаридов на основании изучения физико-химических свойств и механизма действия ряда карбогидраз: а- и глюкоамилазы Clostridium acetobutylicum, (3-фрукто-фуранозидазы Aspergillus niger, Р-галактозидазы Penicillium canescens, ину-линазы Aspergillus awamori. Выбор объектов исследования диктовался тем, что данные ферменты являются индустриально важными и охватывают довольно широкий спектр гидролаз, катализирующих расщепление гликозид-ной связи в природных субстратах.

8 Исходя из цели, "были поставлены следующие задачи: изыскание активных продуцентов карбогидраз и изучение их биосинтетической способности; оптимизация условий культивирования продуцентов карбогидраз; разработка эффективных способов получения высокоочищенных ферментных препаратов карбогидраз; определение кинетических закономерностей и термодинамических параметров кислотной и термической инактивации карбогидраз; исследование конформационной структуры ферментов; идентификация каталитических групп активного центра инулиназы, а-амилазы, (3-галактозидазы, (3-фруктофуранозидазы; исследование субстратной специфичности карбогидраз и механизма их действия на олиго- и полисахариды; разработка технологических режимов гидролиза субстратов и рекомендаций по практическому применению карбогидраз.

Научная новизна. Проведены комплексные исследования физико-химических свойств и дана термодинамическая характеристика процессов кислотной и термической инактивации высокоочищенных ферментных препаратов а- и глюкоамилазы CI. acetobutylicum, (З-фруктофуранозидазы А. niger, (3-галактозидазы Р. canescens, инулиназы А. awamori.

Впервые получена кристаллическая экзо-инулиназа из А. awamori и установлена ее принадлежность к орторомбической пространственной группе P2A2i.

Впервые получен полный сиквенс инулиназы А. awamori и определены возможные участки N-и 0-гликозилирования.

Проведен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей (3-фруктозидаз из различных источников и установлена крайне высокая степень гомологии инулиназы А, awamori с фруктозилтрансферазой из А. foetidus.

Идентифицированы каталитические группы активного центра исследуемых карбогидраз и предложен механизм ферментативного катализа. На основании совпадения нескольких экспериментальных критериев (величины рК, найденные по кривым v = f(pH), рассчитанные значения АН, фотоокисление, инактивирующее действие ДЭПК, наличие Asp, Glu и His в высокогомологичных участках в аминокислотной последовательности (З-фруктозидаз) сделано предположение об участии в акте катализа карбогидразами карбоксильной и имидазольной групп.

На основании обобщения данных литературы, используя принцип ориентированной сопряженной атаки нуклеофильных и электрофильных групп, находящихся в активном центре карбогидраз, развита идея об идентичности механизма разрыва гликозидных связей исследуемыми нами карбогидразами и о специфических особенностях образования продуктов гидролиза при их действии на олиго- и полисахариды.

Разработаны способы практического применения карбогидраз в пищевой технологии и биотехнологии,

Впервые показана возможность получения фруктозо-глюкозных сиропов и фруктозы из нетрадиционного сельскохозяйственного сырья - якона путем ферментативного гидролиза входящего в его состав инулина инулина-зой А. awamori.

Научно-практическая значимость работы. Результаты исследования позволяют расширить представления о молекулярных механизмах ферментативного расщепления высокополимерных субстратов, структуре активных центров карбогидраз. На основании кинетических и термодинамических характеристик ферментативного катализа дается оценка различным типам связей и взаимодействий, участвующих в формировании структурной организации молекул карбогидраз.

Полученная методом рентгеноструктурного анализа рентгенограмма кристаллов инулиназы А. awamori 2250 является основой для дальнейшей интерпретации карт электронной плотности и определения третичной структуры фермента.

Разработаны и апробированы в лабораторных и промышленных условиях технологии с применением карбогидраз (Патент на изобретение № 2158085, Авторское свидетельство № 1604852, ТУ 9291-013-02068108-2001). Полученные данные могут найти применение при разработке технологии промышленного получения фруктозы из инулинсодержащего сырьяПо материалам диссертации издано учебное пособие с грифом УМО и монография, используемые при чтении курса биохимии на технологических факультетах Воронежской государственной технологической академии.

Апробация работы. Основные результаты исследований, выполненные автором в период 1986-2001 г.г. докладывались и обсуждались на международных, всесоюзных, республиканских и региональных конференциях и симпозиумах: III Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Кобулети, 1986, Пушино, 1986); Российской научно-практической конференции с международным участием «Проблемы ресурсосберегающих и природоохранных технологий и оборудования для переработки и хранения сельскохозяйственного сырья» (Краснодар, 1993); III Всесоюзной конференции «Биосинтез ферментов микроорганизмами» (Москва, 1993); международном симпозиуме «Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов» (Воронеж, 1995); Всероссийской научно-технической конференции «Физико-химические основы пищевых и химических производств» (Воронеж, 1996); межрегиональной научно-практической конференции "Пищевая промышленность-2000" (Казань, 1996); Всероссийской научно-практической конференции «Физико-химические основы пищевых и химических производств» (Воронеж, 1996); 2-ой международной научно-практической конференции «Продовольственный рынок и проблемы здорового питания» (Орел, 1999); межрегиональной научной конференции «Продовольственная безопасность России. Качество продуктов питания-99» (Воронеж 1999V III международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные

11 растения и перспективы их использования» (Пущино, 1999); III международной научно-производственной конференции «Интродукция нетрадиционных и редких сельскохозяйственных растений» (Пенза, 2000); международной конференции «Химия пищи и биотехнология» (Москва, 1999). Результаты научных исследований также докладывались ежегодно на отчетных научных конференциях Воронежской государственной технологической академии.

Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в монографии, учебном пособии, 2 авторских свидетельствах и патенте на изобретение и более чем 70 публикациях, в том числе обзорных статьях в академических и отраслевых журналах: «Прикладная биохимия и микробиология» РАН, «Биохимия» РАН, «Хранение и переработка сельхозсырья» РАСН, «Биотехнология» и др.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 311 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов (6 глав), заключения, выводов, списка литературы (338 источников) и приложений. Иллюстративный материал включает 63 рисунка и 41 таблицу.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Г л а в а 1

КАРБОГИДРАЗЫ, ИХ КЛАССИФИКАЦИЯ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. ГИДРОЛИЗ ОЛИГО- И ПОЛИСАХАРИДОВ

1.1. ОБЩИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА ОЛИГО- И ПОЛИСАХАРИДОВ

Карбогидразы (0-гликозид-гидролазы, К.Ф.3.2.1), катализирующие гидролитическое расщепление 0-гликозидной связи в олиго- и полисахаридах, относятся к катаболическим ферментам углеводного обмена. Это однокомпонентные ферменты со сравнительно низкой молекулярной массой (50-100 кДа), их молекулы представляют в основном одномерные субъединицы, большинство из них являются внеклеточными ферментами, что позволяет легко выделять их из среды и очищать. Эти ферменты занимают важное место в классической и физико-химической энзимологии. Исключительно велико прикладное значение карбогидраз для биотехнологии, пищевой промышленности.

Особенности строения специфических субстратов и характер действия на них фермента позволяют различать три основных типа карбогидраз: гликозидазы, эндо-гликаназы и экзо-гликаназы [146].

Действие одних приводит к сохранению конфигурации расщепляемой гликозидной связи, действие других - к обращению (инверсии) конфигурации расщепляемой гликозидной связи.

Гликозидазы действуют на олигосахара, отщепляя нередуцирую-щий остаток моносахарида. В свою очередь ферменты, действующие на гликозильные соединения, подразделяются на а- и Р-гликозидазы в зависимости от конфигурации расщепляемой связи. Это не относится к а- и |3-амилазам, т.к. их подразделяют не по типу расщепляемой связи, а по характеру аномерной формы образующихся при гидролизе крахмала Сахаров. к гликозидазам относятся исследованные нами |3-фруктофура-нозидаза, (3-галактозидаза, ос-глюкозидаза. Как а-, так и (3-гликозидазы действуют с сохранением конфигурации расщепляемой связи, причем они проявляют максимальную реакционную способность по отношению к малым субстратам и их глюкозидным производным. С удлинением цепи соответствующих олигосахаридов эффективность действия этих ферментов уменьшается или остается практически постоянной (но не увеличивается).

Гликаназы катализируют гидролиз полисахаридов и менее специфичны к олигосахаридам. Эндогликаназы расщепляют гликозидные связи, находящиеся на серединных участках молекулы полисахарида. Типичным представителем их является а-амилаза. Экзогликаназы действуют с нередуцирующего конца полисахарида, отщепляя моно- и дисахарид (глюкоамилаза, (3-амилаза). Эти ферменты действуют с обращением конфигурации расщепляемой связи и, как правило, увеличивают эффективность действия по мере увеличения степени полимеризации субстрата (в основном в диапазоне степени полимеризаци от 2 до 10-12) [66].

Как отмечает Клесов А. (1980), представители каждого из основных типов карбогидраз — гликозидаз, эндогликаназ и экзогликаназ должны, по всей видимости, обладать сходными особенностями специфичности механизма действия как следствие общей структуры их активных центров [66].

Вопрос о том, по какую сторону атома кислорода разрывается гликозидная связь, был решен в экспериментах с Нг0¹^. Установлено [48], что разрыв связи происходит по ту сторону атома кислорода, к которой примыкает нередуцирующии остаток олиго- или полисахарида и к которому карбогидраза проявляет наибольшую специфичность. Так, Р-фруктофуранозидаза отщепляет от сахарозы участок фруктозы, раз-

14 рывая связь Сг-О, соединяющую атом кислорода с фруктозой, но не связь d-0, соединяющую атом кислорода с глюкозой. Гидролиз крахмала амилазами в НгО¹⁸ показал, что гидролиз происходит по связи С,-0, но не по связи О-Сд. Ферментативный гидролиз гликозидной связи можно представить следующим образом: ~\ 18 ^Н2 -\ 18 y\^0¹⁸R ^х^ОН + R0¹⁸H

Этот гидролиз может идти с сохранением (2) или обращением (3) конфигурации при аномерном атоме углерода в результате нуклео-фильной атаки водой углеродного атома d субстрата. -О OR -О ОН

Н₂0 -ROH -О OR

Н2О -ROH

ОН (3)

В роли внешнего нуклеофильного агента может выступать другая молекула олиго- или полисахарида, в этом случае наблюдается так называемая реакция трансгликозилирования или перенос гли-козильного остатка субстрата на соответствующий акцептор. Практически во всех изученных случаях реакции гликозилирования протекают с сохранением конфигурации у аномерного атома гликоновой части субстрата: -О OR _+R'_0H -О OR'

Реакции трансгликозилирования можно рассматривать как способность карбогидраз катализировать алкоголиз гликозидов. Трансгли-козилирование свойственно ее- или |3-гликозидазам и эндогликаназам, но не экзогликаназам, действие которых сопровождается обращением конфигурации.

15 1.2. ХАРАКТЕРИСТИКА ОТДЕЛЬНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ

КАРБОГИДРАЗ И ИХ СУБСТРАТОВ В табл. 1.1 представлены исследованные нами карбогидразы и расщепляемые ими гликозидные связи.

Указанные карбогидразы являются, наиболее важными с прикладной точки зрения, они имеют первостепенное значение в пищевой технологии и биотехнологии. Этим объясняется наш интерес к данным карбогидразам.

Таблица 1.1

Карбогидразы и расщепляемые ими гликозидные связи

Амилолитические ферменты. Описание свойств и химического состава крахмала как естественного субстрата для ферментов амилолитическо-го действия приводится в ряде работ [37, 42, 63, 135]. Напомним лишь, что крахмал относится к полисахаридам и состоит из двух компонентов: амилозы и амилопектина.

Молекула амилозы имеет линейную структуру и состоит из остатков глюкозы, соединенных а-(1->4)-гликозидной связью: сн₂Он

СНоОН

СНоОН

СH₂ОН он + он I а-(1-^4)-гликозидная связь.

Один из концевых остатков a-D-глюкопиранозы (правый на рисунке, ) является редуцирующим.

Амилопектин в отличие от амилозы имеет разветвленную (древовидную) структуру; в его молекулу входит до 50000 a-D-глюкопиранозных остатков. Наряду с а-(1->4)-связями он имеет также сс-(1->6)-гликозидные связи, представляющие собой точки ветвления. Гликозидные а-(1->6)-связи составляют около 5 % общего количества связей, содержащихся в молекуле амилопектина:

СН2ОН он0^ N / ^О

К ферментам, гидролизующим крахмал, относятся а-, Р- и глю-коамилазы. а-Амилаза (а-1,4-глюкан-4-глюканогидролаза, К.Ф. 3.2.1.1) относится к эндогликаназам, гидролизует ос-1,4-гликозидные связи в крахмале и гликогене. Фермент имеет выраженное сродство к гликозидным связям, удаленным от конца молекулы. Атака субстрата носит случайный характер и может быть как единичной, так и множественной, когда от субстрата последовательно отщепляется несколько фрагментов. Механизм действия сс-амилазы на крахмал многоцепочечный, неупорядоченный; в результате образуются продукты неполного гидролиза крахмала - сс-декстрины, поэтому а-амилазу называют декстринирующим ферментом, она интенсивно разжижает крахмальный клейстер. а-Амилаза не гидролизует а-1,6-гликозидные связи в амилопектине, Конечным продуктом гидролиза амилопектина является изомальтоза. Теоретически при действии сс-амилазы на амилозу можно получить при полном гидролизе около 85 % мальтозы и 15 % глюкозы, при действии на амилопек-тин - около 70 % мальтозы, 10 % изомальтозы и 20 % глюкозы. В замкнутой системе такой выход не имеет места, так как конечные продукты гидролиза являются конкурентными ингибиторами а-амилазы. а-Амилазы условно делят на две группы: разжижающие и осаха-ривающие. К первым относят ферменты, расщепляющие в растворимом крахмале не более 40 % гликозидных связей, ко вторым - расщепляющие до 60 %. Так степень расщепления гликозидных связей бактериальными амилазами разжижающего типа составляет 16-30 %; бактериальные амилазы осахаривающего типа гидролизуют крахмал с образованием до 70 % мальтозы и глюкозы. а-Амилаза микроскопических грибов относится к осахаривающему типу, при гидролизе образуется до 87 % мальтозы и глюкозы [63]. а-Амилазы широко распространены в природе. Их находят у низших и высших животных, растений, микроорганизмов. Наибольшее практическое применение имеют а-амилазы бактерий и микроскопических грибов [38, 44, 133].

Многие а-амилазы получены в высокоочищенном или кристаллическом состоянии, весьма неустойчивы к Н⁺^ионам среды, но термостабильны. р-Амилаза ((3-1,4-глюкан-мальтогидролаза, К.Ф. 3.2.1.2) относится к экзогликаназам, катализирует последовательное отщепление мальтозы от нередуцирующего конца молекул амилозы, амилопектина, ами-лодекстринов, является сахарофицирующим ферментом. Расщепляет в крахмале только а-1,4-гликозидные связи. Амилоза гидролизуется полностью. От ветвей амилопектина отщепляется по 10-12 мальтозных остатков. Гидролиз амилопектина может идти до предпоследней связи, граничащей с точкой ветвления. Нерасщепленные фрагменты амилопектина носят название Р-амилодекстринов, или предельных декстринов. В результате гидролиза р-амилазрй из крахмала образуется 54-58% мальтозы и 42-46 % предельных декстринов. Мальтоза при отщеплении переходит в Р-форму, что объясняет название фермента.

Действие (3-амилазы осуществляется по механизму множественной атаки; молекула амилозы может быть атакована молекулой фермента несколько раз, причем каждый раз происходит распад фермент-субстратного комплекса. Данный случай является промежуточным между одноцепочечной моделью, в которой фермент остается в связанном состоянии до тех пор, пока молекула субстрата не будет полностью прогидролизована, и многоцепочечной моделью, в которой фермент отделяется от субстрата после каждого разрыва гликозидной связи.

Р-Амилаза редко используется как индивидуальный фермент. Осахаривающая способность ее существенно увеличивается при сочетании с а-амилазой. При совместном действии а- и Р-амилаз на крахмал около 95 % его превращается в мальтозу и 5 % в низкомолекулярные предельные декстрины, содержащие а-1,6-гликозидные связи. Р-Амилаза конкурентно ингибируется продуктом реакции мальтозой, что уменьшает выход мальтозы в закрытой системе.

Р-Амилазу продуцируют высшие растения, микроорганизмы. Фермент содержится в непроросшем зерне и солоде злаковых культур. Солод злаков долгое время был единственным источником (3-амилазы, используемым в практике.

Р-Амилаза менее термостабильна, но более кислотоустойчива, чем а-амилаза.

Глюкоамилаза" (а-1,4-глюкан-глюкогидролаза, К.Ф. 3.2.1.3) — зкзо- фермент, катализирующий отщепление [3-глюкозы от нередуцирующего кон- ца амилозы и амилопектина Глюкоамилаза тэасщепляет не только сх-1 4 но и Сб-1 6-гликозидные Механизм есть последовательный гшгоолиз нескольких гликозидных связей в одной молекуле субстрата Возможен цепочечный механизм когда фермент расите-

Глюкоамилаза гидролизует предпочтительно высокомолекулярные субстраты. Препараты глюкоамилазы часто содержат активную трансгликозилазу, которая катализирует синтез олигосахаридов с а-1,6-гликозидными связями. Действие трансгликозилазы особенно возрастает при повышении концентрации крахмала и продуктов его гидролиза. В результате трансферазных реакций накапливаются такие сахара, как изомальтоза, паноза, нигероза, изомальтотриоза и другие. Появление этих продуктов снижает выход глюкозы. Поэтому в закрытой гидролитической системе, где глюкоза не удаляется из сферы реакции, теоретически невозможно достичь полного превращения крахмала в глюкозу под действием глюкоамилазы. В открытой системе, при удалении глюкозы, снижается интенсивность трансферазной реакции, повышается скорость гидролиза за счет снятия ингибирования продуктом реакции. В таких условиях можно достичь практически полного гидролиза крахмала до глюкозы с помощью одного фермента. На практике предпочитают использовать глюкоамилазу для осахаривания частично декстринизированного крахмала.

Глюкоамилазы широко распространены у животных и микроорганизмов, найдены в растениях. В биотехнологии используют глюкоамилазы, продуцируемые микроскопическими грибами.

Глюкоамилазы грибов рода Mucor способны гидролизовать крахмал на 95-100 %, фермент из Penicillium и Aspergillus на 88-90 %.

Способность глюкоамилазы расщеплять в крахмале ос-1,4- и а-1,6-гли-козидные связи, высокая устойчивость к Н*-ионам и температуре ставят ее в разряд перспективных ферментов при промышленном гидролизе крахмала.

Инулиназа (инулаза, 2,1-|3-В-фруктан-фруктаногидролаза, К.Ф.3.2.1.7, К.Ф.3.2.1,80) осуществляет гидролиз инулина и других полифруктозанов до фруктозы. Молекула инулина состоит из остатков P-D-фруктофуранозы (около 95 %) и cc-D-глюкопиранозы (около 5 %) и представляет собой цепь из 20-30 фруктозных остатков, соединенных (3-(2->1)-гликозидными связями. Остаток молекулы oc-D-глюкопиранозы присоединен к концевому редуцирующему концу полифруктозидной цепи так же, как в молекуле сахарозы [42,318].

Расщепление (3-1,2-фруктозидной связи начинается с 3-D-фрук-тозного конца полимера и продолжается до последней связи. В результате этой реакции образуется единственная на молекулу инулина молекула глюкозы. При полном гидролизе инулина образуется 95 % фруктозы и 5 % глюкозы.

Инулиназа гидролизует главным образом инулин; сахароза, мели-цитоза, раффиноза, стахиоза также подвергаются гидролизу инулина-зой, но с меньшей скоростью.

Средняя молекулярная масса инулина, выделенного из различных источников, колеблется в пределах 4000-6000.

Другим типом фруктанов является леван, у которого остатки фруктозы соединены гликозидными Р-(2->6)-связями. Леван также содержит a-D-глюкопиранозный остаток, как и в инулине. Таким образом, как инулин, так и леван содержат концевой остаток сахарозы и их можно считать запасными полисахаридами - производными сахарозы. CH₂OH

НОСН. о сахароза он і і о он ' носн2 о ^он ' J п=20ч-30

НОСН₂ о

СН₂ОН сн₂он

СН₂ОН

СН₂ОН носн2 о. г— о - сн₂ п. г—о - -сн2 о сн₂он -о

Химическая структура молекул инулина (а) и левана (б)

Ни один конец полисахаридной цепи этих фруктанов не является восстанавливающим, поскольку аномерные углеродные атомы концевых моно-сахаридных остатков участвуют в образовании гликозидной связи. Цепи у левана короче, чем у инулина; обычно содержат 7-10 остатков (З-Б-фрук-тозы.

Инулиназа содержится в тех же растениях, в которых находится инулин, однако ее активность в этих растениях незначительна. Активную инули- назу синтезируют микроскопические грибы, в частности, различные виды Aspergillus, и дрожжи.

Р-Фруктофуранозидаза (2,1-P-D-фруктофуранозид-фруктогидролаза, КФ 3.2.1.26) специфически гидролизует сахарозу на глюкозу и фруктозу, смесь которых называют инвертным сахаром. Р-Фруктофуранозидаза относится к гликозидазам, обладает трансгликозилазной функцией, ее называют также инвертазой, сахаразой, фруктозидазой.

Ферментативный гидролиз сахарозы происходит по схеме: нос», О j_l₀ носн₂ о _V^й _{5н ho}nL/4 ₀>\_J^Chgoh но^^І/^д ⁺ ho\-J/ СН₂ОН он он

Сахароза a-D-Глюкоза (З-D-Фруктоза (a-D -глюкопиранозил-(2->1)-фрук-

Концентрация сахарозы в пределах 5-Ю % является оптимальной, однако Р-фруктофуранозидаза полностью гидролизует 70 %-ные растворы сахарозы, но при повышении концентрации сахарозы скорость реакции снижается. 3-Фруктофуранозидаза отщепляет концевой невос-станавливающий фруктозильный остаток не только от сахарозы, но и от других олигосахаридов в частности, раффинозы. При гидролизе раффинозы из одной её молекулы образуется по одной молекуле мелибио-зы и фруктозы. р-Фруктофуранозидаза дрожжей Saccharomyces и грибов Aspergillus обладает высокой термо- и рН-стабильностью.

Р-Галактозидаза или лактаза (1,4-Р-В-галактозид-галактогидро-лаза, К.Ф. 3.2.1.23) осуществляет гидролиз лактозы на глюкозу и галактозу:

СНoOН СНоОН СН20Н СНзОН

Л~Ц >-Q J—0

_^У^г_{\М1/он NEL/} ⁺_н^1Лн

ОН ^N он ОН ОН

Лактоза (З-В-Галактоза a-D-Глюкоза (P-D-галактопирано-зил-(1->4)-a-D-глк>копираноза)

Поскольку аномерный атом углерода остатка глюкозы не участвует в образовании гликозидной связи, лактоза представляет собой редуцирующий сахар. Она существует в а- и (З-форме. (З-Галактозидаза отщепляет остаток галактозы от нередуцирующе-го конца лактозы и других галактозидов (олигосахаридов, полисахаридов, гликолипидов, гликопептидов, мукополисахаридов). При этом расщепляется связь между Q-атомом остатка галактозы и гликозидным атомом кислорода. Ферментативный гидролиз лактозы используется в технологии пищевых молочных продуктов,

Гидролиз протекает с сохранением конфигурации субстрата. Фермент высокоспецифичен к конфигурации расщепляемой связи в структуре глика-на.

Р-Галактозидазу продуцируют животные, микроорганизмы разных таксономических групп, в растениях она встречается весьма редко [53], способность синтезировать фермент присуща многим молочнокислым бактериям. В качестве промышленных продуцентов Р-галактозидазы используют дрожжи Saccharomyces fragilis, микроскопические грибы и бактерии [63].

1.3, МИКРОБНЫЙ СИНТЕЗ КАРБОГИДРАЗ

Анализ литературных данных показал, что в качестве продуцентов карбогидраз используются культуры микроорганизмов из различных таксономических групп: бактерий, дрожжей, актиномицетов и микроскопических грибов [И, 18, 37, 50, 98, 248]. Эффективность ис- пользования микроорганизмов в качестве продуцентов карбогидраз в значительной степени зависит от их выбора, поскольку разные виды и даже штаммы одного и того же вида продуцируют различные ферменты. К микроорганизмам - продуцентам этих ферментов предъявляются следующие требования: наличие высокой ферментативной активности; преимущественный синтез фермента или группы ферментов, превращающих определенный олиго- или полисахарид; генетическая стабильность по признаку синтеза фермента; достаточно высокая скорость роста; способность активно развиваться на средах с доступными и недорогими источниками питания.

Продуценты амилолитических ферментов. Известно большое количество микроорганизмов, обладающих высокой эффективностью к биосинтезу амилолитических ферментов [37, 38, 44, 180, 212, 248]. Чаще всего в качестве промышленных продуцентов амилаз используют микроскопические грибы и бактерии [133].

Многие микроскопические грибы обеспечивают активный синтез ос-амилазы: Aspergillus awamori, А. niger [242], А. oryzae [222], А. flavus [159], А. usamii, Rhizopus delemar, R. japonicus [113], R. species [305].

Большое число бактерий способно образовывать ос-амилазу: Streptococcus bovis [203], Lactobacillus amylovorus [173, 232], Однако наиболее широкое применение нашли амилазы, продуцируемые бактериями рода Bacillus: В. subtilis [136, 176], В. licheniformis NRRL В14368 [169], В. species [230, 269]. Кичаковой Н. (1998) [64], Ивановой В. (1999) [235], Нефедовой Л. (1996) [108] исследован термофильный штамм В. licheniformis, синтезирующий активную а-амилазу осахари-вающего типа. Chakraborty К. (1997) [183], Wind R. (1994) [326] отмечают, что термофильный штамм В. stearothermophilus является перспективным продуцентом а-амилазы.

Бактерии обладают высокой продуктивностью ос-амилазы, выход ферментных препаратов в случае бактериальных продуцентов в 5-Ю раз выше по сравнению с грибными [180].

Некоторые авторы изучали биосинтез амилолитических ферментов актиномицетами, например, Streptomyces megasporus [193]. Из 450 проверенных штаммов рода Actinomyces 360 проявляли способность к синтезу а-амилазы. Hang М., Furuyoshi S. (1996) [214] отмечают, что из 26 термофильных штаммов актиномицетов штамм Streptomyces thermocyaneovilaceus IFO 14271 проявляет наивысшую способность к биосинтезу а-амилазы.

Дрожжи обладают более низкой способностью к биосинтезу а-амилазы. Так, из 177 испытанных штаммов дрожжей и подобных им микроорганизмов лишь 8 синтезировали данный фермент [304]. а-Амилаза обнаружена среди базидиомицетных дрожжей Filobasidium capsuligenum [148],

Ранее считалось, что продуцентами (3-амилазы являются лишь высшие растения. Впервые в нашей стране у микроорганизмов этот фермент был обнаружен Двадцатовой в 50-х годах в культуре Aspergillus oryzae, а впоследствии и во многих других [98]. Многочисленные работы Ray R. (1994, 1996) [287, 289], Toda Н. (1989) [308] посвящены микробным |3-амилазам.

Среди микроскопических грибов, продуцирующих Р-амилазу, следует отметить следующие: А. terreus [212], Syncephalastram racemosum [286], Myceliophthora thermophila [298]. (З-Амилазу продуцируют термофильные анаэробные бактерии Clostridium thermosulfurogenes [227, 290]. Рядом ученых изучалась |3-амилаза культур В. subtilis [205], В. polymyxa [31, 315], В. cereus [255, 265, 273], В. megaterium [287, 288]. Soni, Sandhu выделили |3-амилазу из дрожжей и дрожжеподобных микроорганизмов Trichosporon beigelii и S. cerevisiae [304].

Глюкоамилаза'синтезируется в основном микроскопическими грибами рода Aspergillus или Rhizopus: А. terreus, А. niger [240, 282, 309, 327, 329], А. awamori [13, 107, 127, 239], R. delemar, R. pygmaues [11З]. Однако продуцентами глюкоамилазы являются и другие микроорганизмы, включая грибы Endomycopsis, Neurospora, дрожжи Saccharomyces [142], бактерии Clostridium acetobutylicum [47, 69].

Сарейкайте И. (1989) с соавторами была получена глюкоамилаза из А. awamori, удельная активность которой в 4-5 раз превышала удельную активность ранее известных глюкоамилаз и составила 125000 ед/мг при 30 С [127].

Из рода Saccharomyces природными штаммами, утилизирующими крахмал, являются дрожжи S. cerevisiae [9, 10, 142].

Продуценты Р-фруктофуранозидазы. Наиболее широко изученной группой микроорганизмов в отношении Р-фруктофуранозидазы являются дрожжи Saccharomyces cerevisiae [7, 9, 83, 104, 109, 181, 320]. Отмечен биосинтез р-фруктофуранозидазы также дрожжами S. fragilis [88], Candida utilis [58], Endomycopsis fibuligera [196], Hansenula polymorpha [264]. Алексанян E. (1985) [12], Oliveira I., Park Y. (1995) [270] выделили дрожжи Auerobasidium pullulans, синтезирующие внутри- и внеклеточные Р-фруктофуранозидазы.

Имеющиеся в литературе данные показывают, что наиболее активные продуценты (3-фруктофуранозидазы встречаются среди грибов: А. japonicus [185, 218], А. awamori [127], А. oryzae [238], А. niger [45, 80, 190, 224, 314], Р. canescens [91], Р. cyaneшп [54], Fusarium оху-sporum [164, 237]. Кирилловой Л. (1997) отмечено, что сахарозотоле-рантные и осмофильные микромицеты рода Fusarium, Penicillium, Aspergillus обладают высокой инвертазной активностью [62].

Показана способность синтезировать и секретировать в среду (3-фруктофуранозидазу дрожжеподобными грибами Aureobasidium pullulans [12], Auerobasidium species [216].

Сравнительно малоизученной группой микроорганизмов в отношении образования |3-фруктофуранозидазы являются бактерии. Обнаружена (3-фруктофуранозидаза у бактерий Clostridium perfringens [231], Clostridium acetobutylicum [250], Bifidobacterium adolescentis [261], Streptococcus mutans [174], Kluyveromyces sp. [296].

Продуценты инулиназы. В настоящее время вопросы поиска эффективных продуцентов инулиназы и исследование физико-химических свойств фермента являются актуальными как за рубежом, так и у нас в стране. Микроорганизмы способны синтезировать эндо- и экзоинулина-зы. Первые расщепляют инулин с образованием преимущественно оли-госахаридов и небольшого количества моно- и дисахаридов, экзоину-линазы катализируют образование в основном моносахаридов [167, 337].

Из литературных данных, особенно из обзоров Васильева Н. (1993) [29], Pandey А. (1999) [275] и Vandamme Е. (1983) [318], извест-но, что способность к биосинтезу инулиназ проявляют многочисленные микроскопические грибы, дрожжи, бактерии. Микроорганизмы, синтезирующие инулиназу, представлены в табл. 1.2.

Как видно из таблицы, среди микроскопических грибов активными продуцентами инулиназ являются А. niger, А. ficuum, Penicillium. Xie Qiuhong и Xiang Hongyu (1996) [332, 333] проводили скриннинг 180 штаммов микроорганизмов, гидролизующих инулин до фруктозы. Наиболее активный продуцент инулиназы идентифицирован как Aspergillus niger. Kochar А. (1997) [241] путем селекции отобран штамм Aspergillus versicolor МТСС 280, продуцирующий активную термостабильную инулиназу.

Таблица 1.2 Биосинтез инулиназы некоторыми микроорганизмами

Как отмечают Gupta A., Sing D. (1994), среди дрожжей Kluyveromyces fragilis, Kl. marxianus, Pichia polimorpha, Debaryomyces cantarelli наиболее активным продуцентом инулиназы являлся Kl. fragilis [211]. Активными и широко распространенными продуцентами инулиназ считаются также дрожжи Kl. marxianus. Espinoza P., Barsana E. (1987) [197] отмечают, что дрожжи Kl. marxianus способны к биосинтезу внутри- и внеклеточной инулиназы.

В литературе приводятся также данные о ряде микроорганизмов-продуцентов инулиназ, а именно: Chrysosporium pannorum [330, 331], Arthrobacter [310], Clostridium acetobutyricum [194]. Маркосян Л. (1997) впервые выделил инулиназу из анаэробных фотосинтезирующих бактерий Ectothiorhodospirea. [95]. Корейскими авторами Park J. (1998) и др. [276 ] была выделена эндоинулиназа из Pseudomonas sp. Способность к биосинтезу инулиназы обнаружена у бактерий Clostridium thermosuccinogenes и Bacillus subtilis 430 А [321], необходимых для промышленного производства глюкозо-фруктозного сиропа. Pandy А, (1998) исследовал биосинтез инулиназы бактериями Staphylococcus [274].

Дрожжи и бактерии образуют в основном внутриклеточную ину-линазу, что осложняет технологию получения ферментных препаратов. Это связано с потерей активности на стадиях выделения фермента, необходимостью разрушения клеточной структуры, а также контролем активности инулиназы на стадии ее микробного биосинтеза.

Продуценты (3-галактозидазы. Различные микроорганизмы активно синтезируют Р-галактозидазу. (З-Галактозидазы микробного происхождения вызывают всё больший интерес из-за возможности увеличения продуктивности продуцента за счет селекции и направленного биосинтеза, сравнительно невысокой их стоимости.

Довольно полно изучена Р-галактозидаза, бактерий рода Escherichia [292, 293], Bacillus sp. [186], молочнокислых стрептококков Streptococcus thermophylus [191], Bifidobacterium [192]. Наиболее широко из перечисленных прокариотов исследована Р-галактозидаза Е. coli, ставшая классической моделью в исследованиях по индукции и репрессии синтеза ферментов [151, 317].

Однако с практической точки зрения наибольший интерес представляют эукариоты, так как способность продуцировать экзогенную Р-галактозидазу найдена только у микроскопических грибов [53]. Это облегчает выделение фермента. Наибольший интерес представляют грибы - продуценты Р-галактозидазы Culvularia inaegualis и Alternaria tenuis [90], дрожжевая культура Kl. fragilis [17, 147], Kl. marxianus [170, 260]. Среди грибов подробно исследованы представители родов Aspergillus, Mucor, Penicillium зо [53]. Микромицет P. -canescens является перспективным продуцентом грибной Р-галактозидазы [114].

В качестве продуцентов (3-галактозидазы известны Kluyveromyces lactis [165], Lactobacillus delbrueckii. Streptococcus salivarius [259], Thermomyces lanuginosus [201], Bacillus acidocaldarius [244].

Актиномицеты как возможные продуценты (3-галактозидазы изучены мало. Это связано, по всей видимости, с низким температурным оптимумом их действия. Большинство работ посвящено изучению возможности использования индуцированного синтеза |3-галактозидазы у актиномицентов рода Streptomyces [17].

С прикладной точки зрения наиболее перспективными являются продуценты, осуществляющие биосинтез внеклеточных карбогидраз.

1.4. КОНСТИТУТИВНАЯ И ИНДУЦИБЕЛЬНАЯ ПРИРОДА КАРБОГИДРАЗ. ИНДУКЦИЯ И РЕПРЕССИЯ СИНТЕЗА

Ферменты, продуцируемые микроорганизмами, подразделяются на индуцибельные и конститутивные. Биосинтез первых резко возрастает в присутствии в среде специфических индукторов. При этом отдельные компоненты питательной среды могут усиливать биосинтез одних ферментов, не влияя или подавляя биосинтез других.

Карбогидразы чаще всего имеют индуцибельную природу, и поэтому в состав сред для культивирования их продуцентов обязательно включается соответствующий индуктор. К индуцированным ферментам относятся исследованные нами карбогидразы: глюкоамилаза, а-амилаза, (3-фрукто-фуранозидаза, (3-галактозидаза, о чем подробнее будет указано ниже.

Конститутивные же ферменты синтезируются микроорганизмами в среде в отсутствии веществ, которые являлись бы потенциальными индукторами. Они катализируют основные пути метаболизма: гликолиз, цикл Кребса,

31дыхательную цепь. В 'качестве примера ферментов, синтез которых осущест вляется конститутивно, могут служить ферменты метаболизма углеводов, ко торые являются общими для большинства организмов. В противоположность им синтез ферментов, ответственных за использование источников углеводов среды, индуцибельный [18]. . /

Стройную теорию индуцированного биосинтеза ферментов создали Жакоб и Моно [41], Согласно этой теории, синтез ферментов контролируется тремя факторами: наличием гена, определяющего структуру и свойства фермента, наличием репрессора - вещества, блокирующего действие гена, и индуктора, который высвобождает ген от инги-бирующего действия репрессора. Индукторы и репрессоры в конечном счете действуют на определенный участок молекулы ДНК, в котором заключена наследственная информация о синтезе данного фермента. Чаще всего роль индуктора при биосинтезе карбогидраз выполняет субстрат соответствующего фермента или его структурный аналог. Накопление в среде продуктов ферментативной реакции подавляет синтез соответствующего фермента, так как они выполняют роль репрессора, действующего по механизму обратной связи.

Репрессию и индукцию синтеза ферментов следует рассматривать как противоположные стороны единого биохимического процесса и как адаптивные процессы, обеспечивающие выживание микроорганизма. Основываясь на этой особенности микроорганизмов, можно направлять синтез необходимых ферментов путем подбора качественного и количественного состава питательной среды [37].

Индуктором биосинтеза амилолитических ферментов, по утверждению многих авторов, является крахмал, [3-галактозидазы - лактоза, ин\^линазы инулин (3-фруктофуранозидазы - сахароза, целлюлаз -

Индуктор биосинтеза ферментов должен непосредст- обладать способностью про- т-п^тк"атТч черс**^ к*TTf^kTo^tTWT-»TP' Tvrf'TVfбтїаттт-л Tii-r*vmi-» тсттеттстт ттпо гґл/ттрт-ття Гтгтотсо'ЧЗ. как компонент среды при культивировании продуцентов карбогидраз используется редко, поскольку она часто является репрессором синтеза.

Классическим примером индуцированного синтеза фермента является биосинтез Р-галактозидазы, на основе которого Жакоб и Моно и разработали теорию индукции и репрессии. Механизм индукции и репрессии синтеза Р-галактозидазы они исследовали на культуре Е. coli. Было установлено, что индуктором р-галактозидазы Е. coli является ал-лолактоза (6-о-(3-В-глюкопираноза), образующаяся из лактозы путем изменения (3-1,4-связи в |3-1,6-связь. Предполагают, что один активный центр Р-галактозидазы отвечает за расщепление лактозы, другой - аллолак-тозы. Это служит примером метаболической индукции. Лактоза - прородный субстрат фермента - не является оптимальным индуктором у Е. coli, так как имеет низкую скорость гидролиза и слабое сродство к (3-галактозидазе. Ме-либиоза (a-D-галактозид) индуцирует клетки Е. coli. в 2 раза активнее, чем лактоза, хотя не имеет сродства к |3-галактозидазе и не гидролизуется ферментом [53].

Для дрожжей и молочнокислых бактерий наиболее эффективным индуктором является лактоза, менее эффективным - галактоза.

Для микроскопических грибов механизм индукции и репрессии синтеза Р-галактозидазы изучен в меньшей степени. Есть данные о том, что индукторы биосинтеза внутри- и внеклеточной Р-галактозидазы могут быть несколько различными, но все же в подавляющем большинстве случаев в качестве индукора биосинтеза Р-галактозидазы являются лактоза и галактоза [170, 201]. Для (3-галактозидазы Penicillium canescens, исследованной Николаевым И. (1998), индуктором биосинтеза являтся L-арабиноза [111]. Глюкоза является для многих грибных продуцентов Р-галактозидазы ингибитором [139].

В литературе имеется много сообщений о репрессии биосинтеза микробных внеклеточных карбогидраз моносахаридами по механизму обратной связи конечным продуктом. Например, Carlsen М. (1996) и др.

33 [178] показали, что-значительное угнетение а-амилазы при непрерывном культивировании А. oryzae происходит даже при незначительной концентрации глюкозы в среде. Kilikian В. (1996) исследовал биосинтез глюкоамилазы А. awamori NRRL 3112 в периодической культуре с подпиткой [239]. Субстрат, исходно содержащийся в среде в концентрации 10"² М (в пересчете на глюкозу), подавался с различной скоростью до суммарного содержания КГ¹ М. По скорости роста мицелия и выходу биомассы отличий от периодической культуры с начальной концентрацией сахара 10"' М не наблюдалось, однако продуктивность клеток возрастала на 92 %, что, по мнению авторов, связано с ослаблением катаболитной репрессии биосинтеза фермента при поддержании низкой концентрации глюкозы в среде.

Аналогичные данные были получены Cheng Wen Chang (1995) для |3-фруктофуранозидазы А. japonicus TIT-90076 [184]. При периодическом с подпиткой культивировании А. japonicus (сахароза подавалась порциями) биосинтез (3-фруктофуранозидазы был на 20 % выше чем в периодической культуре. Об ингибировании активности инвертазы высокими концентрациями сахарозы указывают Sakakibara М., Wang D. (1996) [299].

Индукция биосинтеза инвертазы сахарозой отмечена и для бактерий Clostridium perfringens [231]. В присутствии сахарозы наблюдался интенсивный биосинтез (3-фруктофуранозидазы, глюкоза и мальтоза подавляли биосинтез фермента.

Можно заключить, что, за некоторым исключением, дрожжевая и грибная (5-фруктофуранозидазы являются индуцируемыми ферментами и синтез их репрессируется глюкозой [11, 12]; бактериальная Р-фрук-тофуранозидаза не подвергается репрессии глюкозой [174].

Однако имеются данные, указывающие на различное влияние углеводов на биосинтез Р-фруктофуранозидаза в процессе роста микро- организмов, в том числе у представителей одной группы. Так, например, сообщалось, что добавление глюкозы или фруктозы в ферментативную среду не репрессирует синтез |3-фруктофуранозидазы у гриба F. oxusporum [164]. В случае дрожжей Candida utilis синтез фермента происходил независимо от источника углерода, т.е. (3-фруктофу-ранозидаза у исследованных дрожжей является неиндуцированным ферментом [58].

Исключением среди бактерий является штамм Е. colli 30047, который начинает синтезировать фермент лишь после адаптации культуры на среде с сахарозой [11].

Опубликованные в литературе данные по изучению процесса торможения синтеза и секреции (3-фруктофуранозидазы, вызванного наличием глюкозы в питательной среде, позволяют сделать предположение о возможности двух типов репрессии: истинной - блокирование гена и кажущейся - торможение секреции. Одновременно выяснено, что сравнительно низкая концентрация глюкозы (0,1%) вызывает репрессию секреции |3-фруктофуранозидазы у Saccharomyces 303 - 67.

К индуцибельным ферментам относятся также амилолитические ферменты [38, 44, 175, 220], для которых индуктором является крахмал.

Для внеклеточной а-амилазы из Bacillus licheniformis NRRL В14368 мальтоза является хорошим индуктором [169].

Природа синтеза карбогидраз зависит от вида микроорганизма-продуцента. Подтверждением этому служит биосинтез инулиназы. Такие микроорганизмы, как А. ficuum [266], А. terreus [324], синтезируют инулазу на средах, содержащих инулин. Наряду с инулином индуктором биосинтеза инулаз является сахароза. Отмечено, что сахароза индуцирует синтез инулиназы К1. marxianus [295]. Cruz V. (1998) [189] отмечает, что образование внеклеточной инулиназы А. niger стимулируется при росте штамма в присутствии инулина в качестве источника углерода. Фермент способен гидролизо-

35 вать сахарозу, раффинозу и инулин, высвобождая фруктозу. Xie Qiuhong (1996) также установлено, что индуктором биосинтеза инули-назы микромицетом Aspergillus niger служит инулин, но не сахароза, раффиноза, глюкоза или фруктоза [332, 333]. Wei Wenling (1998) изучено регулирование синтеза инулиназы культурой Р. species 91-4 [325]. Показано, что биосинтез фермента индуцировался инулином и подавлялся его катаболитами. При изучении влияния актиномицина D и актидиона на ферментативный синтез обнаружено, что подавление синтеза инулиназы происходило при уровне транскрипции. Содержание внутриклеточной АТФ было в 1000 раз выше в репрессивных условиях по сравнению с индуктивными условиями. Отмечено, что уровень АТФ оказывает существенное влияние на регулирование синтеза инулиназы в грибах.

Конститутивную природу синтеза инулаз микроорганизмами, когда фермент образуется в среде в отсутствие веществ, которые являлись бы потенциальным индуктором биосинтеза, отмечают японские исследователи, например, Nakamura Т. (1994) утверждает, что конститутивную эндоинулиназу продуцирует А. niger [262].

Следует отметить, что микромицеты могут обладать трансглико-зилирующей активностью, с помощью которой синтезируются сахара, являющиеся индукторами биосинтеза карбогидраз. Таким образом, природа биосинтеза карбогидраз зависит от вида продуцента, наличия в них транспортных систем потребления тех или иных источников углерода.

1.5. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КАРБОГИДРАЗ

В исследовании физико-химических свойств ферментов, в частности карбогидраз, важное значение как с теоретической, так и с практической точки зрения имеют характеристики оптимальных условий их действия (рН, температура), стабильность ферментов. Важной характеристикой ферментов является также величина их молекулярной массы.

Молекулярная масса карбогидраз. Анализ литературных данных показывает, что молекулярная масса карбогидраз микробного происхождения колеблется в широких пределах: от 30 до 200 кДа (табл. 1,3).

Таблица 1.3 Молекулярная масса карбогидраз A. awamori S. fragilis

Р-фруктофуранозидаза

Как видно из таблицы, а-амилаза и (3-амилаза имеют довольно низкую молекулярную массу:'35-75 кДа, молекулярная масса глюкоамилазы и ину-линазы немного выше - 60-80 кДа. Внеклеточная (3-галактозидаза грибов имеет молекулярную массу 115-180 кДа, бактериальная - 40 кДа. Микроми-цеты синтезируют р-фруктофуранозидазу с молекулярной массой 60-90 кДа, дрожжи - с высокой молекулярной массой (200 кДа).

Влияние рН и температуры на активность карбогидраз. На каталитическую активность карбогидраз большое влияние оказывает рН среды. Для каждого фермента существует оптимальное значение рН среды, при котором он проявляет максимальную активность. Переход к большей или меньшей (по сравнению с оптимальной) концентрации водородных ионов сопровождается более или менее равномерным падением активности фермента.

Влияние рН среды на каталитическую активность ферментов осуществляется за счет изменения ионизации отдельных компонентов ферментативной реакции. Такие изменения могут происходить в нативном ферменте, фермент-субстратном комплексе или субстрате. Показано, что рН влияет на скорость ферментативной реакции тремя способами: воздействием на величину максимальной скорости ферментативной реакции (Vmax)? на образование фермент-субстратного комплекса и на устойчивость моолкулы фермента [27,28].

Карбогидразы содержат большое количество ионизирующихся групп, поэтому они могут находиться в виде целого ряда различных ионных форм, однако каталитическая активность ферментов проявляется, как правило, в узком интервале рН. В связи с эти можно предполагать, что только одна из ионных форм фермента (точнее, его активного центра) каталитически активна. При этом распределение всего количества фермента между этими ионными формами зависит от рН и констант ионизации (рК) отдельных групп, расположенных в самом активном центре или около него.

Данные по физико-химическим свойствам а-амилаз широко представлены в литературе. Olama Z. (1998) [269] выделен и идентифицирован новый бактериальный штамм В. species II, продуцирующий термостабильную

38 а-амилазу. Фермент был активен даже при 80 С. Показано, что оптимум активности наблюдался при 60 С и в широком диапазоне рН 6,0-9,0. Deweer Р. с соавт. (1996) была выделена термо- и кислотостабильная а-амилаза из Sulfolobus sp. [160]. Фермент имел оптимум действия при рН менее или равном 4 5 и температуре 90-120 С был способен разжижать крахмал при тем-пературе выше 110 С, не требовал присутствия яовышенных концентраций ионов Са²⁺. а-Амилазы обычно стабильны в интервале рН 5,5-8,0, а также при экстремальных значениях рН в присутствии кальция. Многие амилазы содержат кальций, его концентрация составляет от 1 до 30 г-атомов на моль белка. Кальций существен для проявления активности и стабильности амилаз [44]. Наличие кальция более характерно для амилаз разжижающего типа.

В последние годы интенсифицировались работы по генной инженерии, получены обнадеживающие результаты по увеличению биосинтеза ферментов и изменению их физико-химических свойств. Так, путем замены аргинина на остаток пролина у а-амилазы Bacillus sp. KSM 1378 был получен новый фермент с оптимумом действия в щелочной зоне рН с удельной активностью, превышающей таковую фермента Bacillus licheniformis в 5 раз. При этом была повышена термостабильность а-амилазы [230]. Igarashi К. с соавт. (1998) указывают, что повышение термостабильности а-амилазы Bacillus KSM-1378 при деле-нии Arg-Glu вызывается усилением связывания С^²⁺, а не повышением гидрофобности [229]. Повышение стабильности а-амилазы в присутствии ионов Са"^ отмечают также Aksoy S. (1998) [161], Olama Z. (1998) [269] и др.

В табл. 1.4 представлены оптимальные значения рН и температуры для действия карбогидраз.

Анализ литературных данных (табл. 1.4) показывает, что бактериальные а-амилазы обладают более высокой термостабильностью по сравнению

39 С грибными ос-амилаз'ами. Однако ; амилазы микромицетов проявляют максимальную активность при более низких значениях рН.

Оптимальная температура для действия амилазы мезофильных штаммов микроорганизмов обычно не превышает 70 С. Амилазы микроскопических грибов и актиномицетов имеют оптимум в интервале 30-60 С. Термофильные бактерии могут синтезировать фермент с оптимумом 85-120 С. Такие ферменты особенно ценятся в промышленном биокатализе.

Максимальная активность у большинства (3-амилаз проявляется при рН 6,0-7,0, оптимальная температура действия фермента из разных штаммов колеблется в пределах 50-60 С. Бактериальные Р-амилазы стабильны при рН 5,0-9,0 и температуре не выше 55 С.

Глюкоамилазы большинства продуцентов проявляют максимальную активность при рН 4,5-5,0 и температуре 40-60 С; глюкоамилазы обладают высокой рН- и термостабильностью.

Изучение влияния рН на активность карбогидраз показало, что для дрожжевых инулиназ оптимальным является рН 5,0-5,5, для действия инулиназ микробного происхождения оптимальное значение рН находится в интервале 4,0-5,0, совпадающем с зоной наибольшей стабильности фруктозы, что делает перспективным их использование при получении фруктозы из инулинсодержащего сырья.

Однако встречаются инулиназы, проявляющие активность в щелочной зоне рН. Так, Маркосян Л. с соавт. (1997) впервые обнаружили инулиназу с максимальной активностью при рН 9,0 [95].

Максимальная активность инулиназ проявляется при температуре 45-55 С и заметно снижается при температуре выше 70 С.

Таблица 1.4

Физико-химические свойства карбогидраз

Литература [З-Фруктофурайозидаза дрожжей-сахаромицетов и гровГрода Aspergillus проявляет максимальную активность в тех же интервалах рН, что и инулиназы - 4,0-4,5 и температуре 50-55 С, проявляет высокую стабильность к Н^-ионам при температуре до 60 С. Кислото-устойчивость бактериальных Р-фруктофуранозидаз значительно ниже. Дрожжевые (3-фруктофуранозидазы требуют для стабилизации присутствия сахарозы или глицерина. Необходимость в стабилизаторах объясняется тем, что внутриклеточные ферменты при переходе из связанного состояния в свободное утрачивают стабильность, которая внутри клетки обеспечивалась естественной иммобилизацией на соответствующих структурах.

Сравнительный анализ физико-химических и каталитических свойств (3-галактозидаз микроскопических грибов, дрожжей и бактерий показал большие различия у ферментов микроорганизмов даже внутри группы эукариотических микроорганизмов. Расхождения, вероятно, обусловлены прежде всего локализацией фермента и в меньшей степени принадлежностью продуцента к эукариотам или прокариотам [53]. Препараты (3-галактозидазы, полученные из микроскопических грибов, имеют более высокие термостабильность и температурные оптимумы (60-65 С), чем ферменты из дрожжей (30-35 С) или Е. coli (35-40 С). Грибные препараты выдерживают температурное воздействие 50 С в течение часа с относительно небольшой потерей активности (около 20 %). (З-Галактозидазы мицелиальных грибов более устойчивы к изменениям рН среды, чем дрожжевые или бактериальные ферменты. Ферменты из грибов сохраняют 80 % активности при рН 2,8 или 5,4, дрожжевые же ферменты более лабильны, при данных значениях рН их активность резко снижается. Оптимальный рН действия для грибных Р-галактозидаз 3,6-5,3. Исходя из этих данных, следует отметить, что

42 для практического применения грибные препараты (3-галактозидазы представляют наибольший интерес.

Обобщая литературные данные, можно сделать вывод о том, что микроорганизмы продуцируют карбогидразы с различными физико-химическими свойствами. Регулируя рН реакционной среды и температуру ферментативной реакции, можно добиться максимальной активности карбогидраз.

1.6. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О СТРУКТУРЕ

КАРБОГИДРАЗ

Исследование структуры и функции ферментов, механизма их действия является важнейшей проблемой современной энзимологии. Важное место отводится при рассмотрении структуры фермента его активному центру, определению локального участка полипептидной цепи фермента, обладающего каталитическим действием, и расшифровке механизма его участия как в образовании фермент-субстратного комплекса, так и в акте превращения субстрата в продукты реакции.

Основная цель исследований структуры ферментов заключается в том, чтобы установить ее взаимосвязь с функцией ферментов. На современном этапе развития физики и химии белка эта задача вполне разрешима, хотя некоторые вопросы имеют определенные трудности. Чем выше молекулярная масса фермента, чем больше степень упорядоченности структуры, тем больше осложнений в ее расшифровке.

В этих исследованиях решающую роль играют физико-химические методы, причем наиболее ценная информация может быть получена в случае их комплексного использования. Такой подход дает возможность получить либо взаимодополняющую информацию, либо независимые экспериментальные критерии, позволяющие получить

Представления о -структуре фермента и ее конформационных изменениях.

Ферменты - вещества белковой природы, состоят из аминокислот и имеют, как минимум, три, а некоторые и четыре уровня структуры. Каталитическая функция ферментов зависит от третичной структуры, ее деформация или разрушение приводит к частичной или полной потере этой функции. В формировании всех уровней структуры ферментов принимают участие самые различные типы связей и взаимодействий: водородные, электростатические и гидрофобные взаимодействия.

Многие из боковых групп в аминокислотах полярны и могут вступать в слабые взаимодействия, сопровождающиеся частичным или полным переносом протонов. Способность связывать протон характеризуется величиной рК. Частичный перенос приводит к образованию водородной связи, а полный - к образованию иона. Например, карбоксильные группы глутаминовой и аспа-рагиновой кислот легко отдают протон с образованием иона (кислотные группы): -С^ -С^ +Н+

С другой стороны, значительное число аминокислотных боковых групп, таких, как е-амино- и гуанидиниевая группы лизина и аргинина, могут присоединять протон и становятся при этом положительно заряженными (основные группы): —NHs + H^-^NH₃⁺

Если положительно и отрицательно заряженные группы расположены близко друг от друга, они вступают в энергетически выгодное электростатическое взаимодействие и образуют ионную пару. В действительности характер взаимодействия является промежуточным между двумя предельными случаями: ионной парой и водородной связью. Все группы, участвующие в таких взаимодействиях, могут также связывать молекулы воды (гидрофильные группы). В физиологических условиях в

44 нейтральных растворах «-карбоксильная и сс-аминогруппы аминокислот также заряжены в форме "H₃N—CHR—СОг".

Однако многие боковые группы аминокислот не заряжены, в водной среде они не диспергируются, а стремятся собраться вместе (гидрофобные группы). К аминокислотам, содержащим неполярные алифатические или ароматические боковые группы, относятся аланин, лейцин, изолейцин, валин и фенилаланин. Гидрофобным взаимодействиям между неполярными боковыми группами аминокислот принадлежит важная роль в обеспечении стабильности и сохранении структуры белков [144].

В молекуле фермента различные типы взаимодействий теснейшим образом связаны между собой, существенное влияние на них оказывает растворитель - вода. В конечном счете в молекуле фермента устанавливается тесное равновесие сил, соответствующее минимальной свободной энергии.

Методы и приемы исследования первичной структуры ферментов. Расшифровка первичной структуры ферментов - основа для получения предварительной информации о более высоких уровнях структуры (вторичной, третичной, четвертичной), для выяснения топографии функциональных групп фермента и построения модели его функционирования.

Первым шагом в этой расшифровке является получение препарата фермента в высокоочищенном гомогенном состоянии. При определении аминокислотной последовательности фермента прежде всего разделяют его полипептидные цепи (если макромолекула состоит из нескольких цепей), затем определяют аминокислотный состав цепей (N, С-концевые аминокислотные остатки). При определении аминокислотной последовательности полипептидные цепи подвергаются специфическому расщеплению протеолитиче-скими ферментами или химическими реагентами. Смесь образовавшихся фрагментов разделяют и для каждого из них определяют аминокислотную последовательность. При необходимости крупные фрагменты дополнительно расщепляют каким-либо способом на более мелкие. Порядок расположения фрагментов выясняют путем расщепления молекулы фермента по другим связям и анализа образующихся при этом "перекрывающихся" фрагментов.

Анализ аминокислотного состава включает полный гидролиз исследуемого фермента и количественное определение всех аминокислот в гидро-лизате. Для гидролиза обычно используют раствор соляной кислоты, а при анализе содержания триптофана, неустойчивого в кислой среде, - раствор щелочи. Количественное определение аминокислот в гидролизате проводят с помощью аминокислотного анализатора. В большинстве таких приборов смесь аминокислот разделяют на ионообменных колонках, детекцию осуществляют спектрофотометрически с использованием флуорескамина или орто-фталиевого диальдегида.

Наибольшее распространение для определения N-концевых остатков находит дансильный метод. Его первая стадия - присоединение дансилхло-рида (1-диметиламинонафталин-5-сульфохлорида) к непротонированной ос-аминогруппе с образованием данейлпептида (ДНС - пептида). Затем последний гидролизуют 5,7 N раствором соляной кислоты при 105 С, в результате чего освобождается N-концевая сс-ДНС-аминокислота, которая обладает интенсивной флуоресценцией в УФ-области спектра.

Для определения С-концевых остатков чаще всего используют гидролиз карбоксипептидазой, которая специфически расщепляют пептидные связи, образованные С-концевыми остатками. Поскольку после отщепления первой С-концевой аминокислоты фермент атакует последующие пептидные связи, измерение скорости отщепления отдельных аминокислот позволяет анализировать также и С-концевую аминокислотную последовательность.

Среди ферментативных методов расщепления полипептидной цепи на фрагменты широко используется трипсин, который гидролизует связи, образованные карбоксильными группами основных аминокислот - лизина, аргинина; химотрипсин, который гидролизует пептидные связи, образованные карбоксильными группами ароматических аминокислот - тирозина, фенила-ланина и триптофана,

При выборе методов разделения пептидов используют ионообменную хроматографию, электрофорез, жидкостную хроматографию высокого разрешения [43, 99, 119].

В исследовании последовательности аминокислот используют их химическое отщепление по методу Эдмана (с применением фенилизотиоциана-та). Этот метод позволяет последовательно отщеплять N-концевые аминокислоты в виде фенилтиогидантоинов, которые абсорбируют свет в УФ-области с максимумом поглощения 265 - 270 нм. Идентификацию фенилтиогидантоинов осуществляют с помощью тонкослойной хроматографии, жидкостной хроматографии высокого разрещения, а также масс-спектроскопии. Используют также прием, сочетающий метод Эдмана с анализом N-концевых остатков аминокислот в виде их ДНС-производных.

Для непосредственного анализа первичной структуры ферментов используют секвенатор - прибор, осуществляющий последовательное автоматическое отщепление N-концевых остатков аминокислот по методу Эдмана.

Определение аминокислотного состава, N-, С-концевых аминокислот, их последовательностей в молекуле фермента позволяет расположить аминокислоты в той последовательности, в которой они были в исходной молекуле белка. Особенно важно найти те участки, в которых пептиды второго частичного гидролиза (химотрипсином) перекрывают пептиды первого частичного гидролиза (трипсином).

Методы и приемы исследования пространственной структуры ферментов. При исследовании вторичной, третичной и четвертичной структур существуют два принципиальных подхода; исследование в растворе и в кристаллическом состоянии. Основной метод, позволяющий получить неносредственную информацию о пространственном расположении атомов в молекуле фермента, является рентгеноструктурный анализ. Метод основан на дифракции рентгеновских лучей электронами, окружающими ядра атомов в кристалле белка, поскольку длина волны рентгеновского луча соизмерима с межатомными расстояниями в кристалле фермента. На фото- пленке, помещенной за кристаллом, рентгеновское излучение дает дифракционную картину, характерную для третичной, вторичной структур фермента. Рентгеноструктурный анализ применим только для хорошо кристаллизующихся ферментов.

Информацию о строении активных центров ферментов и расположении в них субстратов получают в первую очередь путем рентгеноструктурного анализа самого фермента и его комплекса с каким-либо близким аналогом субстрата, который достаточно похож на субстрат, чтобы располагаться в активном центре сходным с ним образом, но не может подвергаться ферментативному превращению. Такой комплекс может быть закристаллизован и использован для получения необходимого набора данных по дифракции рентгеновских лучей.

Все данные о структурных особенностях ферментов и механизме их действия были получены при исследовании кристаллических белков. Идентичность структуры ферментов в растворе и в кристаллах подтверждается многими данными. Разница лишь в том, что если в растворе фермент находится в нескольких разных конформациях, то, как правило, кристаллизуется только активная форма фермента.

Одной из интересных физико-химических характеристик белков является их способность вращать плоскополяризованный луч света. Величина этого вращения представляет собой сумму двух слагаемых: а) оптической активности, присущей ассиметрическому углероду остатков аминокислот (конфигурационной оптической активности); б) оптической активности, обусловленной расположением этих остатков относительно друг друга, т.е. упорядоченности вторичной структуры (конформационной оптической активности).

Поскольку конфигурационная оптическая активность мало зависит от молекулярной массы белков, основную роль в изменении вращения играет конформация полипептидной цепи. Конформационная оптическая активность изменяется с длиной световой волны. Это изменение получило назва- ние дисперсии оптического вращения (ДОВ). Исследование ДОВ - один из наиболее важных методов изучения конформации белков в их водных растворах. Измерение угла вращения плоскополяризованного света проводят на спектрополяриметре. Сущность метода заключается в следующем: полипептидная цепь, находясь в виде беспорядочного клубка, вращает плоскость поляризации влево; а - спираль и (3-структура - вправо. Чем больше степень упорядоченности, т.е. а - и (3-структур в белке, тем больше правое вращение. С помощью метода ДОВ были обнаружены определенные корреляции между характером первичной структуры полипептида и типом его вторичной структуры. В ряде случаев обнаружена связь между изменением степени упорядоченности пространственной структуры белков и их биологическими функциями. Однако и метод ДОВ имеет ограниченность. Это связано с тем, что во многих белках а- и Р-структуры отнюдь не являются доминирующими, существенный вклад в формирование пространственной структуры этих белков вносят ван-дер-ваальсовы силы гидрофобные взаимодействия.

Совокупность экспериментальных данных по рентгеноструктурному анализу и методу ДОВ может дать более исчерпывающую информацию о структуре и функциях белка.

В исследованиях вторичной структуры используется также спектрофо-тометрия. Метод основан на гипохромном эффекте, т.е. понижении поглощения света при длине волны 190 им белком, имеющим ос-спирали и (3-структуры по сравнению с беспорядочным клубком. При 190 им имеет место максимум поглощения пептидными группами. По наличию гипохромного эффекта можно судить о степени спирализации белка: чем он выраженнее, тем выше спирализация.

При исследовании доменов в молекуле белка рентгенографический анализ является наиболее достоверным методом. С успехом может быть использована и электронная микроскопия. В этом случае для повышения контрастности (электронной плотности) белков используют специальные покрытия, которые адсорбируются поверхностью белка. При облучении таких бел-

49 ков пучком электронов происходит их поглощение контрастирующими веществами (на пленке они темные), которые покрывают домены. Применяют также ограниченный протеолиз, который проводят в мягких, неденатури-рующих условиях, в которых гидролизуются исключительно пептидные связи, находящиеся на поверхности белковой глобулы. Таким образом получают информацию о доменной структуре белка.

Таким образом, изложенные выше подходы в исследовании структуры ферментов, позволяют получить достаточно глубокую, исчерпывающую информацию о структуре и найти определенную связь с ней каталитической функции фермента.

Особенности структуры карбогидраз. В настоящее время успехи, достигнутые в области рентгеноструктурного анализа, кинетики переходных процессов ферментативной реакции и химического катализа, позволили рассмотреть вопросы взаимосвязи между структурой фермента и механизмом ферментативного катализа. Многие карбогидразы получены в гомогенном или кристаллическом состоянии. Установлены первичные последовательности для более, чем десятка сс-амилаз, нескольких (3-амилаз, ос-гликозидаз, глюкоамилаз, циклодекстринглюка-нотрансфераз, а также инвертаз из разных источников.

Расшифровка первичной структуры ферментов является результатом многолетнего труда исследователей. Все расшифрованные кова-лентные структуры приводятся в Атласе аминокислотных последовательностей и структур белков [191а]. Данные об известных пространственных структурах передаются в «банк данных» о белках [283].

Что же касается карбогидраз, то трехмерная структура и кон-формация активного центра определена лишь для некоторых из них, а из числа фруктаногидролаз ни для одного фермента из семейства 3.2.1.7 и 3.2.1.80 не установлена трехмерная структура и структура их активного центра.

Изучение механизмов ферментативного катализа гидролитических ферментов, субстратами для которых служат углеводы, является одним из основных исследований лаборатории ферментов микроорганизмов института биохимии им. А.Н. Баха РАН [18].

Научные исследования отделения молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики РАН включают ЯМР- и рентгеноструктурный анализ карбогидраз, на основе которых развиваются представления о механизме их катализа. Широко развернуты работы по кристаллизации этих ферментов и их комплексов с ингибиторами [105, 107, 126, 129].

Выполнен большой цикл работ по изучению фермента глюкоа-милазы. В 1990 году фермент был получен в кристаллическом виде и в 1991 г. определена трехмерная структура с разрешением 0,22 нм. В 1992-1995 г.г. получены структуры комплексов с рядом лигандов [300]. К настоящему времени ген глюкоамилазы клонирован и секвенирован и идет создание экспрессионных систем для направленного изменения структуры и свойств фермента методом сайт-специфического мутагенеза. ЯМР-спектроскопия обмениваемых протонов фермента и его комплексов с ингибиторами дополнила рентгеноструктурные данные важными сведениями о сети водоDOUHbTX связей в CTDукTvne (Ъермента [13]

Эти резУТТКТЯТЫ STв TTSTTOTP Я осноROH ГТТТ5Т будуших работ по улучшению

ТЄхноЛОРИЧЄСКИХ свойCTR глюкоамила^Ы так кЛТС 'Этот гЬермЄНТ ЯRЛяЄTся инд\^стТ)иаЛЬНО вS-TKнbTrVT и вхоДИТ в грVnпу самЫХ ПРоИЗВОДИМЫХ (t)GT3-менTOR в мИТ) е

Анализ карт электронной плотности, рассчитанный в ходе рент-геноструктурного анализа, показал, что многие белки состоят из нескольких глобулярных областей, довольно слабо связанных между собой. Эти области, четко ограниченные на картах электронной плотности, получили название структурных доменов.

Все амилолитические ферменты, полученные к настоящему времени в кристаллической форме, имеют строение а/^-баррела (рис. 1.1), состоящего из восьми взаимно параллельных [3-структур, образующих внутренний цилиндр (кор), и восьми а-спиралей, формирующих внеш-нюю цилиндрическую поверхность. Восемь периферийных спиралей также взаимно параллельны друг другу, но приблизительно антипарал-лельны набору спиралей внутреннего кора. Глобула глюкоамилазы Aspergillus awamori (ОАТГ) образована а/а-баррелом [13].

На рис. 1.2 представлена конформация полипептидной цепи глюкоамилазы А. awamori [13, 300]. Основным элементом вторичной структуры является а-спираль (51 %). Только 16 % остатков входит в состав (З-структур, причем большинство из них образуют шпильки, соединяющие соседние сс-спирали. Остатки 49-52, 107-110, 113-116 образуют трехцепочечную антипараллельную (3-складчатую структуру, все другие (3-структуры - 8 коротких двухцепочечных антипаралельных шпилек.

Рис. 1.1. Топологические диаграммы для а/(3-баррела (1) и а/а-баррела (2). Спиральные участки представлены кружками, |3-структуры — квадратами, С и N — концевые аминокислоты

Рис. 1.2. Схематическое представление полипептидной цепи глю-коамилазы А. awamori. Цилиндры обозначают спиральные участки. Центры О-гликозилирования показаны одиночными шестиугольниками, центры N-гликозилирования символизируются цепочками из трех шестиугольников

53 На рис. 1.3 представлена третичная структура ос-амилазы, продуцируемой А. oryzae (така-амилаза А) [149]. Молекула представляет эллипсоид (8,4-4,5-4,5 нм), содержит 452 аминокислотных остатка, чередование которых выяснено, а также олигосахарид, составленный из 2 остатков глюкозамина и 6 остатков маннозы. Имеет ярко выраженную двухдоменную структуру; на границе доменов располагается активный центр (А), включающий радикалы аспарагиновой кислоты и гистидина, и Са²⁺-связывающий центр (С); остаток тирозина, нависающий над активным центром, принимает, как и Са²⁺, участие в связывании субстрата. Третичная структура фиксируется четырьмя -S-S-мостиками (S1-S4). 8 а-спиралей обозначены прямоугольниками (Н1-Н8), а 8 (З-слоев -стрелками.

Рис. 1.3. Третичная структура а-амилазы, продуцируемой Aspergillus oryzae (така-амилаза А). Разрешение 0,3 нм. Micami В, (1995) [255] с соавторами исследовали структуру Р-амилазы В. cereus. Показано, что кристаллы Р-амилазы относятся к пространственной группе Р2(1) со следующими размерами ячейки: а=5,77; Ь=9,29; с=6,59 и <і=10Д9нм. Окончательная модель связанной с мальтозой Р-амилазы включала 516 аминокислотных остатков, 4 молекулы мальтозы, 275 молекул Н₂0, один катион Са²⁺, один ацетатный и один сульфатный анионы. Пространственная структура Р-амилазы состоит из корового (P/а₈) - бочонкообразного домена (остатки 5-434), и С-концевого домена (435-613), связывающего гранулы крахмала. Предполагается, что способность Р-амилазы из Bacillus cereus расщеплять гранулы сырого крахмала обусловлена дополнительными двумя мальтозосвязывающими участками вне активного центра.

Кристаллическая структура Р-амилазы В. cereus var. micoides с разрешением 0,22 нм была получена и другими авторами [273], Молекула фермента содержит три домена: N-концевой имеет структуру бочонка (Р/аg); второй домен является выступом первого; третий, С-концевой домен состоит из двух почти антипараллельных Р-структур, Щель активного центра, содержащая предполагаемые каталитические остатки Glu 172 и GIu 367, находится на С-концевой стороне центрального Р-листка в бочонке, как и в большинстве амилаз. Вдали от активного центра связан один атом Са²⁺. С-концевой домен имеет укладку связывающих крахмал доменов в циклодекстрингликозил-трансферазе и глюкоамилазе.

Японскими авторами Fuujimoto Zui, Takase Kenji (1998) [205] установлена кристаллическая структура мутанта ос-амилазы из В. subtilis в комплексе с мальтопентаозой. Показано, что белок состоит из трех доменов, имеющих форму (Р/а8)-бочонка. Описана конформация субстрата и ингибитора, находящихся в каталитической щели, имеющей L-форму

Igarashi Kazuaki (1998) с соавторами [228] установили нуклеотидную и аминокислотную последовательности для разжижающей а-амилазы из Bacillus. Harayuki leffuji (1996) [217] клонирована и секвенирована кДНК а-амилазы, продуцируемой Cryptococcus sp. S-2. Обнаружена открытая рамка считывания для белка длиной 611 остатков с сигнальным пептидом длиной 20 остатков. N-концевая область а-амилазы (до остатка 496) на 49,7 % гомологична амилазе из А. oryzae, а С-концевая область похожа на С-концевую область глюкоамилазы из А. niger. Мутант, лишенный С-концевого домена, не способен связывать и гидролизовать крахмал и утратил тепловую стабильность. Авторы предполагают, что домен связывания крахмала в а-амилазе участвует не только в гидролизе крахмала, но и влияет на термостабильность.

Установлено, что по своей структуре (З-фруктофуранозидазы из различных микроорганизмов отличаются друг от друга. Молекула (З-фруктофуранозидазы из Streptococcus mutans состоит из одной полипептидной цепочки. У дрожжей она представлена димером, а молекула (З-фруктофуранозидазы из грибов состоит из четырех субъединиц, со-стоящих из двух типов полипептидных цепочек [11]. Достаточно подробно изучен аминокислотный состав р-фруктофуранозидазы

Отмечено клеточная) в молекуле фермента у дрожжей и грибов преобладающими аминокислотами являются аспарагиновая и глутаминовая кислоты сєрин и треонин. Характерной особенностью всех исследованных р-фруктофуранозидаз STRTTSTGTCSf OTOVrPTRT/TP иTTTT TTW4TCOG соТТРТЛ^ТСаТ-ТМР ТТМОТИМЯ V\ ТТИСТРРГНЯ С")гГТ-ГЯКО ПО- следовательность идентифицированных аминокислот для большинства Р-фруктосЬуранозидаз остяртря* неiT4Rеf⁴T^,T-TOLT ил/геется тттхтттт хтарттлч'т-тор ттетт- первичной структуре фермента Rouwenhorst R. (1990) [295], исследуя структуру и свойства инулина-зы Ю. marxianus, установил две формы инулиназы: секретируемую в культу-ральную жидкость и локализованную в клеточной стенке дрожжей. Внеклеточный фермент представлял собой димер, фермент, содержащийся в кле- точной стенке дрожжей, - тетрамер. Различия в олигомеризации не влияли на кинетические характеристики по отношению к сахарозе и раффинозе.

1.7. СТРУКТУРА АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ КАРБОГИДРАЗ

Ферментативный катализ происходит на определенном участке поверхности белковой макромолекулы на расстоянии порядка длины химической связи. Этот участок и носит название активного центра фермента. Активный центр представляет уникальную комбинацию аминокислотных остатков в молекуле фермента, обеспечивающую непосредственное связывание ее с молекулой субстрата и прямое участие в акте катализа [14]. В активном центре условно различают так называемый каталитический участок, непосредственно вступающий в химическое взаимодействие с субстратом, и связывающий участок, или контактную «якорную» площадку, которая обеспечивает специфическое сродство к субстрату и формирование его комплекса с ферментом. Однако нельзя провести четкую грань между активным центром фермента и остальной частью его молекулы. Различные типы взаимодействий, сбалансированные между собой, охватывают всю молекулу фермента в целом; и если под действием какого-либо физического или химического фактора будет иметь место усиление или ослабление одного типа взаимодействия, то моментально наступит разрущение этого сбалансированного равновесия что приводит к существенным изменениям топологии функциональных групп в активном центре фермента. Этим можно объяснить основную причину высокой лабильности активного центра к всевозможного рода взаимодействиям.

В формировании активного центра фермента принимают участие отдельные аминокислотные остатки, содержащие разнообразные по реакционной способности функциональные группы (гистидина, аргинина, триптофана и др.). В третичной структуре эти группы фиксированы в сближенном состоянии, удобном для одновременного их взаимодействия с сорбированной молекулой субстрата [23].

Определнную жесткость такой конструкции придают а-спирали и Р-структуры, дисульфидные мостики и другие взаимодействия. Кроме того, в формировании активного центра принимают участие молекулы воды, входящие в гидратационные слои, а также в ряде случаев катионы металлов (F^ , Cu²^, Мо²⁺,Са"^, Mg"^ Mп²⁺ и др.) или органические кофакторы (коферменты). У одних ферментов кофакторы присоединены к белковой части (апоферменту) ковалентно, у других - при участии ряда более слабых сил (водородных связей, гидрофобных или ион-ионных взаимодействий), которые и ориентируют эту каталитически активную группу по отношению к полипептидной цепи [27].

Важнейшим подходом в исследовании каталитического действия карбогидраз является идентификация функциональных групп активного центра, принимающих участие в расщеплении гликозидных связей. Один из методов обнаружения функциональных групп - подавление активности ферментов специфическими реагентами, которые блокируют эти группы, образуя стабильные соединения. Если группа участвует в акте катализа, то модифицированный фермент теряет свою активность. Однако трудно найти такой реагент, который вступал бы во взаимодействие лишь с какой-либо определенной группой. Поэтому данные по идентификации групп химическими методами ненадежны, иногда противоречивы.

Каталитически активные группы Р-фруктофуранозидазы.

Р-Фруктофуранозидаза относится к сравнительно хорошо изученным ферментам. Что же касается данных о строении активного центра (3-фруктофуранозидаз, то они немногочисленны и подчас противоречивы. Алексанян Е, и Маркосян Л. (1986) в обзоре по Р-фрукто-фуранозидазам микроорганизмов [11] отмечают, что ряд авторов на основании результатов опытов по связыванию сульфгидрильных групп различными специфическими ингибиторами указывают на отсутствие тиоловых аминокислот в активном центре фермента. Имеются также данные, свидетельствующие об ингибировании активности Р-фрукто-фуранозидазы ионами двухвалентных металлов, что, казалось бы, говорит о противоположном. Однако можно согласиться с предположением Кидбая о том, что в этом случае имеет место связывание не тиоловых, а амино- и имидазольных групп аминокислот. Наличие имидазольных групп в активном центре фермента подтверждается в опытах по фотоокислению указанных групп, сопровождающемуся инактивацией фермента.

Об ингибирующем действии одно- и двухвалентных ионов металлов на активность дрожжевой инвертазы указывают и другие авторы. Так, серебро и ртуть в концентрации ю-⁵М инактивировали фермент на 40 и 60 % соответ-ственно [100]. л-ХМБ и ЭДТА в концентрации 10' М также являлись ингибиторами фермента. Однако чувствительность инвертазы к ионам серебра можно объяснить не связыванием металла сульфгидрильными группами фермента, а соединением с гистидином боковых цепей молекулы фермента, являющимся главным звеном в активном центре инвертазы.

По утверждению Reddy А., Maley F. (1996) [290], в каталитический центр инвертаз входят три остатка: Asp, Glu и Cys. Pons Т., Olmea О. (1998) [281] предполагают участие еще одного остатка (Asp 162) в каталитическом механизме ферментов гликозид-гидролаз семейства 32.

Таким образом, сведения об активных группах Р-фрукто-фуранозидазы недостаточно экспериментально обоснованы,

Каталитически активные группы Р-галактозидазы. Несмотря на большое количество имеющихся в литературе сведений о микробных Р-галактозидазах, данные о строении каталитических центров этих ферментов немногочисленны, противоречивы, особенно это касается идентификации функциональных групп активных центров Р-галактозидаз, выделенных из микромицетов [51, 147]. Механизм действия Р-галактозидаз на различные га- лактозиды ни для одного из выделенных ферментов с достоверностью не доказан.

У внеклеточной Р-галактозидазы Curv. inaegualis [51] выявлено участие карбоксильной группировки в каталитическом центре этого фермента, так как специфический ингибитор на., эту группу |3-1>-галактопира-нозилэпоксиэтан полностью ингибировал гидролитическую функцию фермента. Фермент не содержит в активном центре сульфгидрильных групп, поскольку он не инактивируется и-ХМБ в концентрации 10"⁴ М в течение 30 мин.

Однако в других исследованиях дается заключение о важной роли у одних Р-галактозидаз SH-группы [99, 147], у других карбоксильной группы [51], у третьих - имидазольной группы [51, 146].

Часто заключение о характере каталитически активных групп в активном центре фермента делается на основании изучения их констант ионизации (рКа), теплоты ионизации, влияния рН и ионной силы на активность фермента [51, 87, 90]. Например, NaCl является активатором действия (3- галакто-зидазы Е. соИ при низких значениях рН, а при рН выше 8,0 активирования не наблюдается. Эти данные могут свидетельствовать о наличии в активном центре фермента имидазола гистидина или ос-аминной группы цистеина. Однако анализ N-концевых групп Р-галактозидазы и значения теплоты диссоциации (около 7 20 ккал/моль⁴) свидетельствуют о том что в процессе катализа участвует имидазол гистидина Значение тзК имидазола как и оптимум dH сдвигается в присутствии NaCl и КС1 в кислую сторону Щелочные ионы при этом окружают близлежащие карбоксильные группы и таким образом защищают имидазол от их влияния активность фермента при этом увеличивается. Эти данные согласуются с результатами исследований Roth N. (1998) [294] указывз-Юшсго нз. присутствие His 357 в активном iiеhtdе В~Гшз.кто-Escherichia coli.

Вторая, способная к диссоциации при рН 8,9—9,1 (при 20 С) группа активного центра Р-галактозидазы Е. coli идентифицируется как сульфгид- рильная. Наличие ее в активном центре подтверждается торможением активности 3-галактозидазы ионами тяжелых металлов (в убывающей последовательности: Hg²⁺ > Ag^ > Cd²⁺ > Zn²⁺ > Pb²⁺ > Cu²⁺) и Л-ХМБ [138]. Всего находят 95±5 сульфгидрильных групп на одну молекулу фермента Е. coli.

Влияют на акт катализа SH-группы и у других олигомерных внутриклеточных Р-галактозидаз, например у дрожжей. Исследования, проведенные с дрожжевой (З-галактозидазой Kl. fragilus, показали, что л-ХМБ в концентрации 0,47 мМ при 20 С (за 15 мин) полностью инактивирует фермент, что свидетельствует об участии SH-групп в качестве протон-донорной группировки в активном центре фермента [87].

Специфический необратимый ингибитор (З-Л-галактопиранозил-эпоксиэтан, способный соединяться с СООН-группой, не уменьшает каталитическую активность дрожжевой (З-галактозидазы, т.е. карбоксильная про-тон-донорная группировка, влияюшая на акт катализа, в ферменте не обнаружена [138, 147].

У грибных внутриклеточных (3-галактозидаз SH-группы также важны для проявления их каталитической способности, а внеклеточные ферменты имеют в активном центре СООН-группу [51, 90, 138].

Одним из современных методов определения аминокислотных остатков, входящих в активный центр ферментов, является применение сайт-специфического мутагенеза. Механизм катализа реакции гидролиза Р-галактозидов подробно обсуждается в работах Richard J., Huber R. (1996) и др. [236, 292, 293]. Авторами изучена кинетика гидролиза различных субстратов Р-галактозидазой из Е. coli и ее мутантами (интермедиатами галакто-зил-фермент). Установлено, что мутантная (E461G) Р-галактозидаза изменяет специфичность по отношению к углеводным субстратам. Из полученных данных сделан вывод о том, что в расщеплении галактозидов участвуют карбонильная группа Glu 461 и ионизированная карбоксильная группа Glu 537, т.е. при расщеплении гликозидной связи карбоксильная группа Glu 461 явля- ется донором протона, а в качестве основания выступает ионизированная карбоксильная группа Glu 537. Эти данные, на наш взгляд, остаются спорными. Чтобы успешно прошла электрофильно-нуклеофильная атака глико-зидной связи и ее разрыв системой Glu 461-COOH...OOC-Glu 537, значение АрК должно быть в пределах как минимум 2-3 единицы. При разрыве глико-зидной связи обе группы должны быть сближены на длину этой связи. Трудно представить, чтобы карбоксильные группы с малыми значениями рК различались на достаточно большую величину АрК. Близко расположенные к ним другие химические группы должны оказывать практически одинаковое влияние на их ионизацию.

Таким образом, в отношении каталитически активных протон-донорных группировок (3-галактозидазы получены следующие сведения: SH-группы влияют на функции внутриклеточных ферментов, но не внеклеточных. Карбоксильные группировки не существенны для каталитического акта дрожжевой 3-галактозидазы, но важны для внеклеточного фермента микромицетов. В качестве нуклеофильной группировки входящей в активный центр внутриклеточных Р-галактозидаз имеет значение имидазольное кольцо гистидина (табл. 1.5).

Таблицах.5

Каталитические группы активных центров [3-галактозидаз, идентифицированные или предполагаемые (*) *(+) - присутствует, (-) - отсутствует каталитическая группа в активном центре (3-галактозидазы.

Следует подчеркнуть, что при идентификации каталитически активных групп Р-галактозидаз в работах был использован в основном один экспериментальный критерий, по которому трудно судить о достоверности участия той или иной группы в активном центре фермента.

Каталитически активные группы амилаз. Литературные данные о функциональных группах а-амилаз, ответственных за катализ, противоречивы. В более обстоятельных работах [20, 226] было показано, что в акте катализа принимают участие имидазольная и карбоксильная группы. Hasegawa К., Kubota М. (1999) [215] определили с разрешением 0,2 нм кристаллическую структуру ос-амилазы Pseudomonas stutzeri. Анализ показал, что Asp 193 служит, главным образом, как нуклеофильное основание, располагающееся рядом с атомом С1 глюкозы (Glc4), и участвует в образовании интермедиата реакции гидролиза. Остаток Asp 294 прочно связывает субстрат, вращая и деформируя конформацию цикла Glc4. Во всех случаях имеется Н-связь между боковой группой Glu 219 и атомом 01 Glc4, обеспечивающая взаимодействие через водород, что подтверждает общепризнанную роль этого остатка как кислотного катализатора (донора протона). Fujimoto Zui (1998) [205] установлена кристаллическая структура мутанта (Е208 Q) по каталитическому центру а-амилазы из Bacillus subtilis в комплексе с мальтопентаозой. Описана конформация субстрата и ингибитора, находящихся в каталитической щели, имеющей L-форму. В связывании олигосахаридов участвуют Туг 62, Asp 176, Ala 177, Gin 208 и Asp 269, причем Gin 208 действует как кислота, а Asp 176 как основание при кислотно-основном катализе. В состав комплекса входят также 3 иона Са , один их них находится вблизи сайта связывания субстрата и стабилизирует структуру переходного состояния.

О наличии сульфгидрильных групп в активном центре (3-амилазы В. polymyxa указывают Mikami В. (1999) [256, 257] и Uozumi N. (1991) [315].

Роль SH и S-S-групп в активном центре (3-амилазы Bacillus cereus исследовал Nomura К. (1995) [265]. Он установил, что SH-группа цистеина Сус 331 входит в активный центр фермента. Ray R. (1994, 1996) [288-289] на основании результатов по ингибирующему действию и-хлормеркурибензоата на |3-амилазу В. megaterium также приходит к заключению о наличии в активном центре фермента SH-rpynn.

Противоречивы данные о функциональных группах активного центра глюкоамилаз [83]. Некоторые авторы отмечают роль имидазольной или SH-группы в акте катализа, убедительные данные получены в работах [20, 39, 44], где также отводится важная роль имидазольной и карбоксильной группам в активном центре глюкоамилаз микроскопических грибов. Для большинства амилолитических ферментов установлено, что активные центры образованы имидазолом гистидина, карбоксильными группами аспарагиновой и глутаминовой кислот, а также тирозина [145]. Последнему приписывают функцию связывания субстрата, а первым трем - каталитическую функцию.

Каталитически активные группы инулипаз. Литературные данные о функциональных группах инулиназ, ответственных за катализ, весьма малочисленны. Gupta А. (1998) из культуры Aspergillus oryzae, растущей на среде с инулином, выделил и очистил до гомогенного состояния на колонках с КМ-целлюлозой и сефадексом G-200 внеклеточную инулиназу. Очищенный фермент катализировал отщепление (3-связанной фруктозы от инулина и сахарозы в соотношении S/I=2,4 [208]. Ионы 804²" и Fe"^ ингибировали реакции, тогда как Ва"^ активировал их. Ионы Hg"^ ингибировали гидролиз сахарозы и стимулировали гидролиз инулина. Выдвинуто предположение о том, что инулиназа содержит различные центры связывания инулина и сахарозы, перекрывающие друг друга или близко расположенные, при этом SH-группы присутствуют только в зоне связывания сахарозы. Поэтому их модификация HgCl₂ приводит к увеличению гидролитической активности в отношении инулина. При совместном присутствии сахарозы и инулина оба субстрата конкурируют друг с другом, что приводит к снижению ферментативной активности.

Следует отметить, что практически для всех микробных инулиназ ионы Hg²⁺ и л-хлормеркурибензоат не оказывали ингибирующего действия, за исключением инулиназ из Р. species и А. niger [318], которые сильно игиби-руются ионами Hg"^.

На основании литературных источников можно утверждать, что функции SH-групп остатков цистеина весьма разнообразны [44, 84]. В некоторых случаях они играют каталитическую роль, то есть непосредственно участвуют в образовании промежуточных соединений. В других случаях SH-группы могут входить в состав «контактной площадки» апоферментов. Наконец, в некоторых случаях SH-группы участвуют в стабилизации каталитически активной конформации белковой молекулы фермента.

Ковалева Т. (1998) [68], исследуя структуру активного центра инулина-зы, показала, что инкубация раствора фермента с карбодиимидом в течение 10 минут приводит к снижению активности инулиназы до 69,8 %, а при 40-минутном взаимодействии сохранение активности составило лишь 1,29 % по сравнению с активностью исходного ферментного препарата. Полученные данные свидетельствуют о том, что в присутствии реагента модифицируется карбоксильная группа аспарагиновой кислоты. Полученные данные согласуются с данными Ohta К. и Akimoto Н. (1998), предполагающих, что в активный центр эндоинулиназ А. niger и Р. purpurogenum входят карбоксильные группы аспарагиновой и глутаминовой аминокислот [267].

Таким образом, литературные данные о структуре карбогидраз весьма малочисленны, противоречивы, не достаточно экспериментально обоснованы. Вопросы, связанные с идентификацией каталитических групп активного центра карбогидраз и их структурой, требуют дальнейшего исследования.

65 1.8. О МЕХАНИЗЕ РАСЩЕПЛЕНИЯ ГЛИКОЗИДНЫХ СВЯЗЕЙ ПОД ДЕЙСТВИЕМ КАРБОГИДРАЗ Механизм расщепления гликозидных связей олиго- и полисахаридов под действием карбогидраз во многом остается мало выясненным, особенно это касается представлений о нем на атомно-электронном уровне. В результате кристаллографических и химических исследований более подробно выяснен механизм действия лизоцима [24, 65, 144]. Активный центр лизоцима представляет собой четко выраженную полость, обусловливающую более прочное связывание и специфичность действия фермента на субстрат. Его связывание требует некоторое предшествующее изменение конформации и фермента, и субстрата. Это способствует приобретению субстратом конформации переходного состояния, свободная энергия которого зависит как от энтропийного, так и от энтальпийного факторов.

Предполагается, что в лизоциме гликозидную связь атакуют две карбоксильные группы, которые расположены подходящим образом относительно (3-1,4-гликозидного фрагмента, в котором один из циклов сахара стерически деформирован в сторону переходного состояния. На рис. 1.4 показана общая кислотная атака глутаминовой кислотой 35 и связанный с ферментом карбониевый ион, который возникает и стабилизируется благодаря деформации сахара и соседству нуклеофильной аспарагиновой кислоты 52, при гидролизе лизоцимом. Glu35 фермент фермент о" о- фермент фермент Asp 52

Рис. 1.4. Механизм перегруппировки связей при катализе лизоцимом в большинстве' случаев оказывается, что и сам фермент деформирован или испытывает «индуцированное пространственное приспособление» при связывании субстрата, сопровождающееся значительным смещением некоторых каталитических групп.

Знание структуры ферментов может указать, как различные факторы изменяют энтропию и энтальпию переходного состояния, приводя его к более низкой свободной энергии и, следовательно, к увеличению скорости катализируемой реакции.

Прежде чем говорить с какой-либо определенностью о механизме действия карбогидраз, необходимо выяснить два обстоятельства: во-первых, какая именно связь в молекуле субстрата расщепляется под действием фермента и, во-вторых, сопровождается ли расщепление сохранением или инверсией конфигурации превращаемой связи. Для выявления полной картины действия фермента на электронно-молекулярном уровне, несомненно, только этих сведений недостаточно; для этого обычно необходимы исследования скоростей реакций в тяжелой воде, изучение влияния индукционных, стерических и гидрофобных факторов на эффективность реакций, рН, температуры, ионной силы, диэлектрической проницаемости, давления [65].

Как уже было отмечено, эксперименты с использованием ¹⁸О показали, что во многих реакциях гидролиза, катализируемых гликозида-зами, происходит разрыв Ci-0-связи. Это доказано для большого числа карбогидраз: а-глюкозидазы дрожжей, (3-глкжозидазы горького миндаля, Р-галактозидазы Е. сoli, а также ряда гликозидаз, расщепляющих высшие полиозы, таких как [3-амилаза ячменя и сладкого картофеля, ос-амилаза В. subtilis, глюкомилаза А. niger [135]. Формально эти реакции представляют собой нуклеофильное замещение при насыщенном л^глетэоде и моrvT проходить с инверсией или сохранением конфигура-ции расщепляемой связи. Карбогидразы представляют достаточно много примеротч реатсттий тто тоmv и дрvroMV THпу [146] но для большинства эндогликогидролаз оказалось, что катализируемые ими реакции осуществляются с сохранением конфигурации расщепляемой связи.

К карбогидразам, гидролизующим гликозидную связь с обращением конфигурации у Сі, относятся: (3-амилаза, така-мальтаза, глюкоамилаза из А. niger и Rh. delemar.

Ко второй группе карбогидраз, сохраняющих конфигурацию у Сь относятся: (З-галактозидаза Е. coli, дрожжевая инвертаза; а-глюкозидаза пекарских дрожжей, (3-глюкозидаза из М. verrucaria, панкреатическая мальтаза.

Различия в действии этих групп карбогидраз некоторые авторы связывают с различными механизмами их действия [135, 301].

Изменение конфигурации (вальденовское обращение) при нуклео-фильном замещении обычно происходит вследствие приближения нуклео-фильной частицы (анионоидной группы) и вхождения ее в молекулу со стороны, противоположной расположению уходящей анионоидной группы.

Сложнее обстоит дело при сохранении конфигурации при гидролизе. Существует две точки зрения, объясняющих сохранение конфигурации. Согласно одной из них такой гидролиз является двустадийным. Первая стадия заключается в связывании нуклеофильной группы субстрата с ферментом с образованием фермент-субстратного комплекса, в котором гликозильный компонент имеет обращенную конфигурацию. Во второй стадии этот комплекс вступает в реакцию с водой или другим гидроксильным соединением, давая продукт с той же конфигурацией, что исходный гликозид (олигосаха-рид). Такой механизм, представления о котором развивались Кошландом [41], называется механизмом двойного замещения (двойной инверсии). Необходимо, однако, подчеркнуть, что до сих пор экспериментальные данные, подтверждающие образование гликозил-энзимных комплексов, детально описаны в литературе только для лизоцима.

Другие теории механизма гидролиза включают предположение, что электростатическое экранирование или спаривание ионизированных групп фермента предохраняет от атаки на а- или (3-направление промежуточного

68 катиона гликозила. Часто такими каталитическими группами являются карбоксильная и имидазольная группы фермента.

Аналогичные группы, по мнению многих авторов, действуют как в инвертирующих, так и в неинвертирующих энзимах, в частности в а- и (3-ами-лазах. Так как зависимость обоих ферментов от рН также очень близка, можно думать, что в этих случаях различия зависят от стереохимического расположения пары ионов - карбониевого гликозила и карбоксилатного фермента, что приводит к атаке карбониевого иона водой в разных направлениях. Вообще же, к настоящему времени нет единой теории, объясняющей механизм действия всех карбогидраз.

1.9. ПЕРСПЕКТИВЫ ПРАКТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЕ КАРБОГИДРАЗ

В настоящее время ферментные препараты находят широкое применение во многих отраслях народного хозяйства. В технологии пищевых продуктов и переработке растительного сырья особенно велико значение карбогидраз [115, 117, 130, 132]. Высокая специфичность ферментов, наличие в живых организмах полиферментных систем, катализирующих последовательные превращения субстратов, позволяют существенно изменить, интенсифицировать и усовершенствовать многие существующие технологии и получить целевые продукты заданного качества наиболее экономичным путем. Расшифровка механизма действия ферментов при гидролизе сложных природных субстратов, характер влияния физико-химических факторов на кинетику ферментативных реакций в полидисперсных системах, образующихся при переработке растительного сырья, позволили создать теоретическую базу ферментации растительного сырья, основ высокоэффективной его переработки.

Карбогидразы широко применяются в таких отраслях, как виноделие, пивоварение, спиртовая, крахмалопаточная, молочная, хлебопекарная промышленность, в сельском хозяйстве [8, 59, 63].

Роль амилаз в технологии спирта. В спиртовом производстве применение термостойкой а-амилазы позволяет сократить затраты на разжижающий фермент на 30 %, снизить расход тепловой энергии на 15-20 %, увеличить выход спирта на 0,5 % [140]. Применение карбо-гидраз в производстве пива и этанола способствует повышению выхода конечного продукта из единицы сырья и интенсифицирует процесс гидролиза и сбраживания.

Показана возможность эффективного использования глюкоамила-зы гибридного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae Y-717 в спиртовом производстве с целью сокращения осахаривающих средств [142].

Р-Галактозидаза, ее применение в пищевой промышленности. Молочная сыворотка, являясь отходом предприятий молочной промышленности, представляет собой ценный продукт, богатый витаминами, белком, минеральными солями, жиром. Основную массу сухих веществ составляет лактоза (в среднем 4,5 %).

Однако из общего объема в мировом масштабе перерабатывается около 50 % молочной сыворотки, а в России лишь 20 %. Лактоза обладает низкой сладостью, сладость ее составляет около 20 % сладости свекловичного сахара, в связи с чем она не используется в качестве поделстителя. Сравнительно низкая растворимость молочного сахара (около 180 г/л) ведет к кристаллизации лактозы из концентрированных растворов. Она обладает плохой сбражи-ваемостью, только определенные виды микроорганизмов могут вызвать ферментацию лактозы, что ограничивает ее использование в бродильной промышленности. Все это приводит к сбрасыванию сыворотки в канализацию. А очистка 1м^ сточных вод с высоким содержанием сыворотки приравнивается к очистке 400 м типичных промышленных вод. Часто встречается лактозо-интолерантность - непереносимость лактозы человеческим организмом.

Улучшить функциональные свойства дисахарида лактозы и обеспечить таким образом возможность использования больших объемов сыворотки и ее фильтратов в пищевой промышленности возможно путем гидролиза.

Наиболее перспективным с точки зрения аппаратурного оформления и качества готового продукта является ферментативный способ гидролиза лактозы Р-галактозидазой,

Сывороточные сиропы с гидролизованной лактозой - прекрасные заменители свекловичного сахара в составе различных пищевых продуктов. Гидролизованная молочная сыворотка используется в производстве мороженого, что предотвращает кристаллизацию молочного сахара. При производстве хлеба применение сыворотки с гидролизованной лактозой приводит к интенсификации технологического процесса приготовления теста, улучшению качества, вкуса, аромата хлеба и экономии муки и сахара.

Моносахариды, образующиеся в результате расщепления лактозы, легко сбраживаются, что создает возможность использования гидролизованной молочной сыворотки в бродильных производствах.

Таким образом, использование |3-галактозидазы для гидролиза лактозы молочной сыворотки является экономически выгодным и перспективным способом ее переработки.

Ферментативный гидролиз инулинсодержащего сырья. В настоящее время разработка технологии получения пищевых продуктов диабетического и профилактического назначения приобретает все больщее значение. В связи с этим возрос интерес к фруктозе. Фруктоза в 1,5-2 раза слаще сахарозы, она может быть широко применена в диетическом питании больных сахарным диабетом, кариесом. Фруктозу, как правило, получают из крахмала с использованием многостадийного процесса, включающего расщепление до глюкозы с последующей обработкой глюкозы глюкозоизомеразой и хроматографическим разделением фруктозы и глюкозы [102, 115]. Перспективным направлением является получение фруктозы из растительного инулинсодержащего сырья, в особенности топинамбура и цикория. Биотехнологические аспекты переработки топинамбура приводятся рядом авторов [24, 34, 35, 56, 276]. Весьма перспективным является производство фруктозо- глюкозного сиропа, поскольку в клубнях топинамбура содержание инулина достигает 16-20 %, а сироп при этом содержит не менее 70 % фруктозы [1,3].'

В настоящее время ведущие фирмы Англии, США, ФРГ, Японии проводят исследования по получению, этилового спирта из нетрадиционного сырья, в том числе и из топинамбура. Переработка топинамбура на спирт сводится прежде всего к гидролизу инулина до сбраживаемых углеводов. Применение дрожжей с инулиназной активностью является перспективным методом для получения спирта из инулинсодержащего сырья [85, 253].

Еще одним видом нетрадиционных сельскохозяйственных культур является якон (Polymnia sonchifolia Роерр. & Endl) - корнеплод, родственник подсолнечника и топинамбура. Родина якона - горные леса восточных склонов северо-восточной Аргентины. В настоящее время якон интродуцирован в США, Новой Зеландии, Японии, Западной Европе, России и Молдове.

В России якон впервые начал интродуцироваться в 1995 г. сотрудниками Всероссийского научно-исследовательского института селекции и семеноводства овощных культур (ВНИИССОК) в Подмосковье [69]. Характерной особенностью корнеплодов якона является наличие в них Сахаров, которые состоят в основном из полифруктозида инулина. В результате кислотного или ферментативного гидролиза инулина образуется фруктоза.

При исследовании углеводного состава корнеплодов якона было установлено, что после двух месяцев хранения содержание Сахаров в корнеплодах составило 46,0 % на сухое вещество, или 7,5 % в пересчете на сырую массу. Содержание фруктозы (свободной и в составе оли-госахаридов) составило 31,8 % от сухой массы [69]. Благодаря высокому содержанию инулина якон ценится в качестве диетического продукта для больных сахарным диабетом.

Гидролиз инулина до фруктозы может быть осуществлен кислотным или ферментативным способами. С точки зрения выхода и качества продукта более перспективен ферментативный гидролиз, основанный на применении специфического фермента инулиназы [71, 72, 337].

Таким образом, применение карбогидраз при переработке сельскохозяйственного сырья позволяет значительно ускорять технологические процессы, увеличивать выход готовой продукции, повышать ее качество, экономить сырье.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Карбогидразы катализируют гидролитическое расщепление 0-глико-зидной связи в олиго- и полисахаридах. Они являются наиболее важными с прикладной точки зрения, имеют первостепенное значение в пищевой технологии и биотехнологии. Вопросы поиска эффективных продуцентов карбогидраз и исследование их физико-химических свойств являются актуальными как у нас в стране, так и за рубежом. В качестве продуцентов карбогидраз используются культуры микроорганизмов из различных таксономических групп. С целью биосинтеза амилолитических ферментов целесообразно применять микроскопические грибы и бактерии, (3-фруктофуранозидазы и инулиназы - микроскопические грибы и дрожжи, (3- галактозидазы - микроскопические грибы. Наиболее перспективными являются продуценты, осуществляющие биосинтез внеклеточных ферментов.

Карбогидразы чаще всего имеют индуцибельную природу, поэтому в состав сред для культивирования их продуцентов включают соответствующий индуктор. Как правило, роль индуктора при биосинтезе карбогидраз выполняет субстрат соответствующего фермента или его структурный аналог. Глюкоза является для многих микробных внеклеточных карбогидраз катабо-литным ингибитором, так как наблюдается репрессия биосинтеза ферментов по механизму обратной связи конечным продуктом.

Из данных литературы известно, что биохимические и физико-химические свойства карбогидраз хорошо изучены. Сравнительный анализ физико-химических и каталитических свойств отдельных представителей карбогидраз показал, что для разных карбогидраз наряду со сходными чертами характерны существенные отличия (оптимальная температура действия, рН-оптимум, термо- и рН-стабильность, константа скорости реакции), позволяющие им оптимально выполнять свои метаболические функции.

Существующие в настоящее время различные методы и приемы позволяют расшифровать первичную структуру ферментов, являющуюся основой для получения предварительной информации о более высоких уровнях структуры и построения модели их функционирования. Многие карбогидра-зы получены в гомогенном или кристаллическом состоянии. Установлены первичные аминокислотные последовательности для более чем десятка ос-амилаз, нескольких (3-амилаз, а-гликозидаз, глюкоамилаз, а также инвертаз из разных источников, однако трехмерная структура и конформация активного центра определена лишь для некоторых из них. Что же касается фрукта-ногидролаз из семейства 3.2.1.7 и 3.2.1.80, то таких данных нет ни для одного фермента.

Обобщая изученную информацию, отметим, что данные о структуре активного центра и механизме каталитического действия карбогидраз немногочисленны, недостаточно экспериментально обоснованы и противоречивы, в связи с чем остается не решенным вопрос о взаимосвязи их структуры со специфической каталитической функцией, В настоящее время не существует обобщающей концепции механизма разрыва гликозидных связей в субстратах под действием карбогидраз. Решение указанных вопросов позволит расширить представления о структуре активных центров карбогидраз и молекулярных механизмах расщепления олиго- и полисахаридов

В связи с этим основной задачей наших исследований явилось выявление общих закономерностей гидролиза олиго- и полисахаридов

ПОД действием ряда'карбогидраз на основании исследования их структуры, физико-химических свойств и механизма действия на субстраты.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Общие закономерности ферментативного гидролиза олиго-и полисахаридов

Карбогидразы (0-гликозид-гидролазы, К.Ф.3.2.1), катализирующие гидролитическое расщепление 0-гликозидной связи в олиго- и полисахаридах, относятся к катаболическим ферментам углеводного обмена. Это однокомпонентные ферменты со сравнительно низкой молекулярной массой (50-100 кДа), их молекулы представляют в основном одномерные субъединицы, большинство из них являются внеклеточными ферментами, что позволяет легко выделять их из среды и очищать. Эти ферменты занимают важное место в классической и физико-химической энзимологии. Исключительно велико прикладное значение карбогидраз для биотехнологии, пищевой промышленности.

Особенности строения специфических субстратов и характер действия на них фермента позволяют различать три основных типа карбогидраз: гликозидазы, эндо-гликаназы и экзо-гликаназы [146].

Действие одних приводит к сохранению конфигурации расщепляемой гликозидной связи, действие других - к обращению (инверсии) конфигурации расщепляемой гликозидной связи.

Гликозидазы действуют на олигосахара, отщепляя нередуцирую-щий остаток моносахарида. В свою очередь ферменты, действующие на гликозильные соединения, подразделяются на а- и Р-гликозидазы в зависимости от конфигурации расщепляемой связи. Это не относится к а- и 3-амилазам, т.к. их подразделяют не по типу расщепляемой связи, а по характеру аномерной формы образующихся при гидролизе крахмала Сахаров. к гликозидазам относятся исследованные нами 3-фруктофура-нозидаза, (3-галактозидаза, ос-глюкозидаза. Как а-, так и (3-гликозидазы действуют с сохранением конфигурации расщепляемой связи, причем они проявляют максимальную реакционную способность по отношению к малым субстратам и их глюкозидным производным. С удлинением цепи соответствующих олигосахаридов эффективность действия этих ферментов уменьшается или остается практически постоянной (но не увеличивается).

Гликаназы катализируют гидролиз полисахаридов и менее специфичны к олигосахаридам. Эндогликаназы расщепляют гликозидные связи, находящиеся на серединных участках молекулы полисахарида. Типичным представителем их является а-амилаза. Экзогликаназы действуют с нередуцирующего конца полисахарида, отщепляя моно- и дисахарид (глюкоамилаза, (3-амилаза). Эти ферменты действуют с обращением конфигурации расщепляемой связи и, как правило, увеличивают эффективность действия по мере увеличения степени полимеризации субстрата (в основном в диапазоне степени полимеризаци от 2 до 10-12) [66].

Как отмечает Клесов А. (1980), представители каждого из основных типов карбогидраз — гликозидаз, эндогликаназ и экзогликаназ должны, по всей видимости, обладать сходными особенностями специфичности механизма действия как следствие общей структуры их активных центров [66].

Вопрос о том, по какую сторону атома кислорода разрывается гликозидная связь, был решен в экспериментах с Нг01 . Установлено [48], что разрыв связи происходит по ту сторону атома кислорода, к которой примыкает нередуцирующии остаток олиго- или полисахарида и к которому карбогидраза проявляет наибольшую специфичность. Так, Р-фруктофуранозидаза отщепляет от сахарозы участок фруктозы, раз 14 рывая связь Сг-О, соединяющую атом кислорода с фруктозой, но не связь d-0, соединяющую атом кислорода с глюкозой. Гидролиз крахмала амилазами в НгО18 показал, что гидролиз происходит по связи С,-0, но не по связи О-Сд. Ферментативный гидролиз гликозидной связи можно представить следующим образом:

Культивирование ацетонобутиловых бактерий

Основными объектами исследований служили чистые культуры мик-ромицетов из Всесоюзной коллекции микроорганизмов (ВКМ, Москва), анаэробные бактерии Clostridium acetobutylicum - продуценты органических растворителей (ацетона, н-бутилового и этилового спирта) из Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ, Москва), а также микроорганизмы из коллекции культур кафедры микробиологии и биохимии Воронежской государственной технологической академии.

Используемые в работе анаэробные бактерии Clostridium acetobutylicum были заготовлены в виде спор на мучных и паточных средах. Культуру хранили в запаянных ампулах в холодильнике при температуре 4-5С.

Оживление споровой культуры CI. acetobutylicum проводили на б % -ном мучном заторе из ржаной обойной муки. Затем на второй генерации проводили опытное брожение на 8 %-ном мучном заторе. Питательною среду разливали в бутыли вместимостью 250-500 см3 с коэффициентом заполнения 0,9, разваривали в течение 60 минут на водяной бане, стерилизовали при 0,15 МПа в течение 1,5 часа и после охлаждения до 37С в нее вносили 5 об. % 24-часовой культуры бактерий. Брожение проводили в течение 72 часов при 37С. Способность анаэробных микроорганизмов CI. acetobutylicum к биосинтезу амилолитических ферментов была изучена нами в процессе аце-тоно-бутилового бражения. Через определенные промежутки времени стерильно отбирали пробы и определяли в них активность ос-амилазы и глюкоа-милазы (АС и ГлА), содержание несброженных Сахаров и содержание растворителей,

Чистые культуры грибов родов Aspergillus, Penicillium, обладающих способностью синтезировать 3-галактозидазу, поддерживали на авизированной среде Чапека, содержащей 3 % лактозы и 0,01 % кукурузного экстракта. Культуры выращивали при 30 С в течение 5 суток и затем хранили в холодильнике при 4-6 С.

Для подбора продуцента (3-галактозидазы использовали среду, разработанную в институте биохимии им. А.Н. Баха, имеющую следующий состав

(% мае): соевая мука - 2; Na2HPCV12H20 - 1,74; лимонная кислота - 1,67; (NH4)2S04 - 0,2; MgS04 - 0,015; КС1 - 0,05; рН среды 5,0.

Объём питательной среды составлял 100 см3 в конических колбах ёмкостью 700 см3, Среды стерилизовали в течение 40 минут при 0,1 МПа, охлаждали до 30 С и засевали водной суспензией конидий в количестве не менее 2 млн конидий на 1 см среды. Культивирование проводили в глубинных условиях на лабораторной качалке с частотой вращения 4 с"1 (уровень аэрации 1,4 г 02/дм3 ч), в течение 96 ч при 28 С.

Микромицет Penicillium canescens F-436, обладающий наивысшей способностью к биосинтезу р-галактозидазы, культивировали на полусинтетической среде следующего состава (% мае): NaN03 - 0,2; КН2РО4 - ОД; КСl- 0,05; MgS04 - 0,05; в качестве ростового фактора использовали 0,02 % кукурузного экстракта, рН среды 5,0. Время культивирования 96 ч, температура 29 ± 1С.

При выборе производственной питательной среды для глубинного культивирования Р. canescens F-436 в качестве контрольной использовали комплексную среду следующего состава (% мае): соевая мука - 3,0; Na2HP04- 2,5; (NN4)2S04 - 0,2; КСl - 0,05; MgS04 - 0,015.

Чистые культуры микроорганизмов, способные синтезировать р-фруктофуранозидазу и инулиназу, выращивали на сусло-агаре в течение 6-7 суток при температуре 30-32 С. Для подбора продуцентов (3-фрукто-фуранозидазы и инулиназы использовали твердую питательную среду из пшеничных отрубей. Пшеничные отруби увлажнялись до 60 % добавлением водопроводной воды, раскладывались в колбы Эрленмейера объемом 750 см слоем толщиной 1,5-2,0 см по 20 г среды в каждую колбу. Среду стерилизовали при давлении 0,1-0,2 МПа в течение 1 ч, охлаждали до 30-35 С и засевали суспензией конидий микромицетов. На каждую колбу расходовали 3-5 см3 суспензии, чтобы на 1 г среды (по воздушно-сухой массе) приходилось не менее 6-7 млн. конидий. Культивирование вели при 30 С в течение 96 ч. В конце выращивания из средней пробы брали две навески для определения влажности, инулиназной и (3-фруктофуранозидазной активностей. Активность исследуемых ферментов определяли в вытяжке из поверхностной культуры с массовой долей 5 %.

Амилолитическую активность (АС) определяли в сбраживаемой среде колориметрическим методом (по ГОСТ 20264.4-72) [124]. За единицу амило-литической активности принимали такое количество фермента, содержащегося в 100 см3 культуральной жидкости, которое в стандартных условиях (рН 6,0; продолжительность реакции 10 мин; концентрация субстрата 1 %) гид-ролизует до декстринов 1 г растворимого крахмала при 30 С в течение 1 чч

Влияние различных источников углерода и азота на биосинтез карбогидраз при глубинном культивировании микроорганизмов

Путем скрининга микроорганизмов различных таксономических групп (40 штаммов микроскопических грибов рода Aspergillus, Rhizopus, Penicil-lium и 68 штаммов ацетонобутиловых бактерий CI. acetobutylicum) нами были выбраны активные продуценты следующих карбогидраз: а- и глюкоами-лазы, р-галактозидазы, (З-фруктофуранозидазы и инулиназы. В результате сравнительной оценки биосинтетической способности микроорганизмов бы ЛО VCTclHOBJICHO ЧТО МШССИМсШЬНУЮ 3-КТИВНОСТЬ 0С-З.МИЛЗЗЫ и ГЛЮКОЗ.МИЛЗЗЫ бактерии Clostridiurn acetobutylicurn Т-14П Р-галактозидазы мик ППІМИТТРТ Penicillium РЯПe ;cРП ; F-Д З6 Р-ffanvrrrnrhvnnwmi/rrm wr АЧПРГСГЇІІІИ; ni 99 SQ хтил/ттиия зч Asпргаіllus aшятплгі 995П С л/тгя зститлл/ги ттотгиттен

Как известно, с целью получения препаратов карбогидраз применяют два основных способа культивирования микроорганизмов - глубинный и поверхностный (твердофазный). Выбор способа культивирования определяется в основном физиологическими особенностями микроорганизма и свойствами сырья для направленного биосинтеза ферментов.

При глубинном культивировании в состав питательных сред входят источники азота и углерода, минеральные соли и стимуляторы роста. Концентрация питательных компонентов в средах обычно составляет 5-Ю % от массы среды. Поскольку большинство продуцентов являются аэробами, культивирование ведут при интенсивной аэрации питательной среды. Питательные среды стерилизуют.

Преимуществами глубинного способа культивирования являются: возможность осуществлять высокий уровень механизации и автоматизации процесса, вести процесс в условиях стерильности, регулировать состав питательной среды, ее температуру и рН. Так, например, Chen W. (1996) показано [185], что при периодическом с подпиткой культивировании А. japonicus (сахароза подавалась порциями) уровень биосинтеза 3-фруктофуранозидазы на 20 % выше, чем при периодическом культивировании. Глубинный способ позволяет вести процесс в непрерывном режиме, при котором обеспечивается генетическая стабильность микроорганизмов-продуцентов карбогидраз. Глубинный способ культивирования применяют для выращивания бактерий, дрожжей и актиномицетов. Он успешно используется и для мицелиальных грибов.

При глубинном культивировании для успешного роста и развития микробная клетка должна быть обеспечена всеми питательными веществами, необходимыми как для синтеза клеточных веществ, так и для получения энергии, затрачиваемой на осуществление этого синтеза и других процессов жизнедеятельности клетки.

Для развития микроорганизмов и синтеза ими биологически активных веществ важнейшая роль принадлежит углероду и азоту.

Влияние источников углерода. На рост культуры и синтез ферментов оказывают влияние как источники углерода, так и их концентрация в питательной среде [18, 37]. Источниками углерода могут быть самые различные органические соединения, их выбор зависит от физиологии продуцента и вида образуемого фермента, поэтому оптимальная дозировка источника определяется индивидуально для каждого микроорганизма. При биосинтезе карбогидраз источнику углерода придается особое значение, поскольку он часто является и индуктором синтеза.

В табл. 3.1 представлены наши данные по влиянию различных углеводов на биосинтез инулиназы микромицетом Aspergillus awamori 2250. Углеводы вносили в количестве 1 % по углероду в питательную среду следующего состава (%мас): КН2РО4 - 0,1; КС1 - 0,05, NaN03 - 0,2; MgS04 -УНзО - 0,05, FeS04 7H20 - 0,01; рН 5,0. Синтез инулиназы наблюдался на всех испытанных углеводах, кроме ксилозы. Полученные данные согласуются с данными других авторов, отмечающих, что источником углерода для биосинтеза инулиназы могут быть лактоза, раффиноза, фруктоза [275, 318]. Наиболее активный биосинтез наблюдался на среде с раффинозой, мальтозой и крахмалом. Введение в состав среды инулина и сахарозы не приводило к индуцированию синтеза инулиназы. Из этого следует, что раффиноза, вероятно, является нативным индуктором биосинтеза инулиназы. Мы предполагаем, что А. awamori 2250 обладает базальным биосинтезом инулиназы, который не зависит от источника углерода. Этот базальный синтез обеспечивается конститутивными ферментами, которые образуют раффинозу в количествах, необходимых для индукции биосинтеза инулиназы. Влияние источников углерода на рост и синтез (3-галактозидазы активным продуцентом Penicillium canescens F-436 представлено в табл. 3.2. Их вносили в количестве 0,6 % по углероду в среду следующего состава

(% мае): NaN03 - 0,2; КН2РО4- ОД; КС1 - 0,05: MgS04 - 0,05, в качестве ростового фактора использовали 0,02 % кукурузного экстракта; рН среды 5,0.

Нуклеотидная последовательность мРНК и аминокислотная последовательность инулиназы

Успехи, связанные с изучением структуры белков, и в частности лизо-цима, повлекли за собой ряд работ, позволяющих определить структуру и других карбогидраз. Однако, как уже отмечалось, ни для одного фермента фруктаногидролаз не определена трехмерная структура и конформация активного центра. Данные о механизме катализа карбогидраз малочисленны, во многом остаются не ясными, нет какой-либо обобщающей концепции их действия. В связи с этим нами проведены исследования структуры активного центра некоторых карбогидраз и механизма их действия.

Для выяснения пространственной структуры ферментов и построения модели их функционирования необходимо расшифровать их первичную структуру. Полученные в условиях Петербургского института ядерной физики кристаллы инулиназы А. awamori 2250 были использованы нами для исследования структуры фермента.

В основе всех современных методов определения аминокислотной последовательности пептидов лежит реакция Эдмана [118, 119]. На первой стадии этой реакции происходит присоединение фенилизотиоцианата (ФИТЦ) к ос-аминогруппе пептида, затем от фенилтиокарбамильного (ФТК) производного под действием безводной кислоты отщепляется N-концевой остаток в виде 5 -тиазолинона и образуется укороченный пептид содержащий в каче Ґ ТТ е "г —ТТОТТТТРТЮМ ТТОРТТР ТТЛ/ТОTTTVTD ЯЛ/ГиТТОТ ИРТТГУТЛ/ T T r WTOTT Т)РЯТ РТ4ТОТ1 Vi ТТОООЧ-ттт.т у TmоTTVT T O R Т-ТЯ ТтГ\ЛДР1 ЇГ\/Т О ТТ4Т Т"Х РТЯТТХТЇГУ "VТТа ТТ5Тf Tf Т Tf РТТЪЯТ ТТиР ЛА ППТ ЯТ-ТТЛЧе сTCWMTT тіяг тпг) пмтбкттїтллтт ТТОИТСУПРТТТТР ТГҐУГО ГїґЮТТЄСРЯ с одТ ПТІПРЛ/ТЄТТНГУИ идЄН тификаїїией образующегося из тиазолинона (Ьенилтиогидантоина (ФТГ) от -168 щепляемои аминокислоты или N-концевого остатка укороченного пептида позволяет установить аминокислотную последовательность исходного белка.

В результате методом белкового секвенирования нами была определе на N-концевая аминокислотная последовательность, а также последователь ность нескольких внутренних пептидов, полученных с помощью расщепле ния полипептидной цепи по метионину. N-концевой сиквенс: FNYDQPYRGQY HFSPQKNWMN DPNGL. Пептид 1: N DPNGLLYHNG TYHL FFQYN Пептид 2: YTS YYPVAQTLP Пептид 3: IGXKAXLVQQPQEA

Полученные фрагменты аминокислотной последовательности позволили нам осуществить генерацию праймеров и получить полномасштабный фрагмент кДНК, включая экзогенные структуры. В результате нами была определена нуклеотидная последовательность полномасштабного гена экзо-инулиназы А. awamori 2250 и проведен сравнительный анализ гомологичных участков, используя сведения из банка данных «SWISS PROT» о структуре ферментов. На рис 5.1 представлена последовательность мРНК и последовательность аминокислотных остатков полипептидной цепи инулиназы. Молекула инулиназы состоит из 537 аминокислотных остатков,

Анализ аминокислотных последовательностей инулиназ из разных источников показывает крайне высокую степень гомологии инулиназы А. awamori 2250 с фруктозилтрансферазой из А. foetidus (рис. 5.2). Из рис. 5.5 ввдно, что у инулиназы А. awamori 2250 и фруктозилтрансферазы А. foetidus присутствуют протяженные участки гомологии, их молекулы отличаются только по 50 аминокислотным остаткам. Это согласуется с мнениями авторов, утверждающих, что гликозидазы, кроме гидролазной активности, как правило, обладают также гликозилтрансферазным действием и ускоряют процесс переноса гликозильных остатков на те или иные субстраты [6, 54, 131, 302].

Сейчас все более укрепляется мнение о том, что трансгликозилирование является одним из существенных элементов распада полисахаридов и олигоса-харидов, сопутствующих их гидролизу.

Значительно хуже выражена гомология экзо-инулиназы А. awamori 2250 с аналогичной экзо-инулиназой из Pseudomonas mucidolens [243]. В то же время нами выделено значительное число фрагментов, имеющих высокую степень гомологии с соответствующими фрагментами ферментов, гидроли-зующих Р-фруктозидные связи: эндо-инулиназой А. ficuum и леваназами В. subtilis и В. polymyxa (рис. 5.3). Так, последовательность YHFSP в позициях 30-34, YHLFFQ в позициях 52-57, WGHATS в позициях 70-73 и RDPFVEWH в позициях 188-195 была сохранена для всех анализируемых Р-фруктозидаз. Следует отметить, что все указанные последовательности включают гистидин, который, очевидно, играет важную роль в акте катализа. Это еще раз подтверждает наше предположение о том, что в активный центр инулиназы А. awamori входит имидазольное кольцо гистидина.

Reddy А., Maley F. (1996) [290] предположили, что активный центр инвер-тазы Saccharomyces serevisiae включает карбоксильные группы аспарагиновои Asp 43 и глутаминовой Glu 233 кислот в последовательностях WMNDPNGL и ESP соответственно. Заметим, что указанные последовательности сохранены для всех анализируемых Р-фруктозидаз, в том числе и для экзо-инулиназы А. awamori в позициях 38 - 44 и 241-243 (рис. 5.3), исходя из чего мы предполагаем, что Asp 41 и Glu 241 входят в активный центр данного фермента.

Анализ известной аминокислотной последовательности Р-фруктозидаз позволил выявить значительное сходство между разными ферментами с близкой функцией, что согласуется с данными ряда авторов [174, 247, 316]. Последовательность аминокислот в области активного центра таких ферментов почти идентична. Это подтверждает наше предположение о том, что кар-богидразы имеют сходный активный центр. Высокая гомология свидетельствует об общности их эволюционного начала и, очевидно, об общем ката-- литическом механизме их действия.