Введение к работе
Актуальность работы
К настоящему времени достигнут значительный прогресс в понимании механизмов функционирования системы окислительного фосфорилирования митохондрий. Согласно П. Митчеллу эта система способна функционировать в режиме так называемого делокализованного сопряжения, при котором дыхательные протонные помпы и система синтеза АТФ функционируют как независимые структурно-функциональные единицы. В таких условиях протонные помпы трансформируют энергию окислительных реакций в электрохимический потенциал ионов водорода на митохондриальной мембране, а АТФ-синтетаза преобразует энергию потенциала в энергию пирофосфатной связи АТФ. Эта модель в настоящее время является общепринятой. В том же 1961 году Р. Вильяме предложил модель локального сопряжения, согласно которой система окислительного фосфорилирования представляет собой единый мембранный комплекс, где перенос энергии (перенос ионов водорода) и система синтеза АТФ жестко объединены в структуру суперкомплекса. Основная особенность этой модели состоит в том, что переносчик энергии (ион водорода) включен в работу протонных помп и АТФ-синтетазы как структурная единица. Вторая модель, таким образом, предполагает не только функциональное, но и структурное сопряжение работы протонных помп, системы транспорта энергии и АТФ-синтетазы.
В течение последних 30 лет в нашей лаборатории ведутся исследования, направленные на поиск условий, при которых реализуется механизм локального сопряжения. К настоящему времени нами было показано существование двух структурно-функциональных состояний системы окислительного фосфорилирования, одно из которых соответствует критериям механизма локального сопряжения (модели суперкомплекса), другое - модели Митчелла. При этом было установлено, что переход между указанными состояниями регулируется системой объемной регуляции, обнаруженной в митохондриях Халестрапом (Halestrap А.Р. et al. 1986). Этот результат показал, что модели Митчелла и Вильямса не являются абсолютно взаимоисключающими, но могут реализовываться в митохондриях при различных внешних условиях, в частности под влиянием факторов, вызывающих значительное изменение объема митохондриального матрикса. Модель Вильямса предполагает существование суперкомплекса, в составе которого транспорт энергии окислительных реакций на АТФ-синтетазный комплекс осуществляется мембраносвязанными ионами водорода, обладающими избытком свободной энергии. В наших исследованиях использовался качественно новый путь идентификации фракции
мембраносвязанных ионов водорода, выполняющих роль переносчика энергии на АТФ-синтетазу. Ранее формирование фракции неравновесно связанных кислот Бренстеда на поверхности мембраны митохондрий в условиях работы протонных помп было обнаружено в нашей лаборатории с помощью катализаторов, которые ускоряют диссоциацию этих кислот, усиливая отрыв неравновесно связанных протонов с поверхности мембран функционирующих митохондрий. Катализаторы снижают активность ионов водорода на поверхности мембраны, увеличивая тем самым отрицательный заряд поверхности. Оба параметра регистрировали либо с помощью ковалентно пришитого к мембранам рН-зонда {Юрков В.И. и др., 2005), либо по изменению (^-потенциала мембран митопластов (Моисеева B.C. и др., 2011) и митохондрий (Ерошенко Л.В. и др., 2012). В последнем случае эффект образования фракции неравновесно связанных ионов водорода при включении протонных помп удается наблюдать без использования катализатора.
В настоящей работе исследован новый класс поверхностно активных протонофоров, специфически взаимодействующих с фракцией неравновесно связанных с мембраной ионов водорода.
Для исследования было синтезировано производное фенола - 2,4,6-трихлор-З-пентадецилфенол (ТХФ-Cis) (Рис. 1), обладающее на 7,5 порядков большим сродством к мембране, чем его структурный аналог 2,4,6-трихлорфенол (ТХФ) и на 6 порядков больше, чем известный классический разобщитель - пентахлорфенол (Мотовилов К.А. и др., 2009).
(С1б)
Рис. 1. Структура ТХФ-С15 (2,4,6-трихлор-З-пентадецилфенол).
Изучение этого соединения
проводилось параллельно с
изучением классических
разобщителей ТХФ и ПХФ. Свойства этого соединения были сопоставлены со свойствами потенциально физиологически активного мембранотропного гидрохинона SkQ3, который обладает высоким сродством к мембране.
Из приведенной структуры ТХФ-Сі5 видно, что эта молекула может двумя принципиально разными способами воздействовать на ионную проницаемость мембран. Во-первых - присутствие фенольной группировки, определяющей протонофорные свойства этого соединения. Во-вторых - высокая поверхностная активность вещества, которая определяется сочетанием в структуре молекулы полярной гидроксильной группы и длинного углеводородного гидрофобного фрагмента. Первый этап изучения этого соединения как
вещества, стимулирующего дыхание митохондрий, был проведен в лаборатории на высоких концентрациях (10-320 мкМ), при которых может проявляться свойство ТХФ-Cis как детергента. В настоящей работе систематически исследована концентрационная зависимость действия ТХФ-С15. Основное внимание уделено изучению действия низких и очень низких концентраций ТХФ-Cis (1 мкМ - 1 нМ), при которых вероятность проявления детергентных свойств данного соединения сведена к минимуму. Протонофорные свойства ТХФ-Cis были продемонстрированы в экспериментах на модели БЛМ.
Цель работы
Получить строгое экспериментальное обоснование действия ТХФ-Cis - как протонофора, специфически взаимодействующего с фракцией неравновесно связанных с мембраной протонов, которая образуется на поверхности внутренней митохондриальной мембраны в условиях работы дыхательных протонных помп. Установить особенности его активности по сравнению с классическими разобщителями.
Задачи работы:
-
Различить протонофорный и детергентный эффекты ТХФ-Сі5 в условиях воздействия этого соединения на дыхание митохондрии. Для этого показать способность ТХФ-Cis стимулировать дыхание митохондрий в диапазоне низких и сверхнизких концентраций (1 мкМ - 1 нМ).
-
Продемонстрировать протонофорные свойства ТХФ-Cis на БЛМ.
-
На митохондриях подтвердить специфическое сродство ТХФ-Сі5 к поверхностно связанным протонам, обладающим избытком свободной энергии.
-
Продемонстрировать различие механизма стимуляции дыхания митохондрий ТХФ-Сі5 и классическим разобщителем пентахлорфенолом.
-
Сопоставить действие ТХФ-Cis и SkQ3 на митохондрии.
Научная новизна работы
На примере поверхностно активного фенола ТХФ-Cis описан новый класс протонофоров, сродство которых к мембранам митохондрий на несколько порядков выше, чем сродство классических разобщителей. Было доказано, что эти соединения обладают способностью в микромолярном и наномолярном диапазоне концентраций избирательно взаимодействовать с фракцией неравновесно связанных ионов водорода, возникающей на поверхности при включении работы протонных помп. В независимых опытах на модельной
системе (БЛМ) доказаны протонофорные свойства этого соединения. Полученные данные рассмотрены в работе как независимое доказательство эффекта неравновесного связывания ионов водорода на мембранах митохондрий в условиях работы протонных помп (опыты проводились при тесной стыковке внешней и внутренней мембран митохондрий в условиях низкоамплитудного набухания митохондрий в гипотонических условиях).
Практическое значение работы
Обнаружение нового типа протонофоров открывает принципиально новые подходы для разработки лекарственных препаратов и создания средств, направленно регулирующих механизмы трансформации и запасания энергии в митохондриях.
Апробация работы
Результаты работы были доложены на международном форуме по нанотехнологиям "Rusnanotech-08" (Москва, Россия, 2008); на XX Симпозиуме "Современная химическая физика" (Туапсе, Россия, 2008); на Всероссийском школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, Россия, 2008); на 34-м Конгрессе FEBS (Прага, Чешская Республика, 2009); на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009); на 15-ой европейской конференции биоэнергетиков "ЕВЕС" (Варшава, Польша, 2010); на 53-ей научной конференции МФТИ (Долгопрудный, 2010); на 36-м Конгрессе FEBS (Турин, Италия, 2011); на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011), на международной конференции «Ломоносов-2011» (Москва, 2011), на международной конференции «Ломоносов-2012» (Москва, 2012), на 4 съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012), на 16-ой европейской конференции биоэнергетиков "ЕВЕС" (Фрайбург, Германия, 2012).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 16 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации
