Содержание к диссертации
стр.
Введение 5
Глава I, Обзор литературы 12
Влияние холестерина на структз/ру и функцию мембран; их роль в патогенезе атеросклероза, . 12
Ионогенные группы в мембранах и заряд клеточной поверхности 28
Экспериментальнаяя часть
Глава 2. Материалы и методы 51
2.1. Получение мембран эритроцитов и липосом с
различным содержанием холестерина, выделение
липидов плазмы крови, исследование липидного
. состава и функциональных свойств . 51
Мембраны эритроцитов 51
Липосомы, определение геометрических параметров 53
Липопротеины плазмы крови 55
Выделение, разделение и определение липидов 56
Определение кислотной резистентности и осмотической стойкости эритроцитов 57
2.2. Исследование электрокинетических свойств и
структурных особенностей мембран эритроцитов '
. , и липосом . . 58
2.2.1. Потенциометрическое титрование мембран
эритроцитов и липосом. Применение ЭВМ для
расчета кривых титрования . . . 58
2.2*2. фимвненив флуоресцентных зондов для иссле-
, дования мембранных систем и липоцротеинов , 68
2.2.3. Применение микроэлектрофореза для оцределения электрокинетиких свойств и плотности поверхностного заряда мембран эритроцитов 69
Глава 3, Липидшй состав и функциональные свойства мемб
ран эритроцитов с различным содержанием холесте
рина, в норме и при разной выраженности атероскле-
ротического процесса 72
Глава 4. Электрокинетические свойства мембран эритроци
тов, обогащенных холестерином в опытах in vitro
и in vivo 86
Глава 5, Потенциометрические исследования природы и ко
личества ионогенных групп мембран эритроцитов
при изменении содержания холестерина в норме
и цри патологии . . 92
5.1. Анализ потенциометрических кривых, получаемых
цри титровании мембран эритроцитов 92
5.2. Ионогенные участки.в мембранах эритроцитов,
. рК и емкость связывания 97
5.3. Модельные исследования на липосомах различ
ного состава 117
Глава 6. Флуоресцентные исследования структурных особен
ностей мембран эритроцитов с различным содержа
нием холестерина 121
6.1. Связывание флуоресцентного зондаастрафлокси-
. на с мембранами 121
6.2. О возможности использования данных флуорес
центных исследований для оценки поверхностного
заряда мембран; сравнение с электрофоретически-
ми и потенцйометрическими исследованиями. . . 125
Глава 7. Обсуждение полученных результатов.в........ 133
В ы в о ды ... 148
Список литературы 151
_ 4 -
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ЯМР -. ядерный магнитный резонанс
иГа+, к+^АТФ-аза - натрий-калиевая аденозинтрифосфатаза
ЭПР - электронный парамагнитный резонанс
ЛГОНП - липоцротеины очень низкой ШІОТНОСТи
ЛПНП - липопротеины низкой плотности
ЛПВЇЇ - липоцротеины высокой плотности
ЭФП - электрофоретическая подвижность
ИБС - ишемическая болезнь сердца
ГЛП - гиперлипоцротеидемия.
в Jj w>»
Введение к работе
Актуальность проблемы. Холестерин, являясь основным стерино-вым компонентом мембран животных клеток, оказывает существенное влияние на их структуру и функцию. Многочисленными экспериментами с использованием современных физико-химических методов /рент-геноструктурный анализ, метод спиновых и флуоресцентных зондов, ЯМР, колориметрическое сканирование и др./ показано, что повышение содержания холестерина в липидной матрице мембран приводит к их стабилизации, т.е. к увеличению микровязкости и ограничению подвижности отдельных участков молекул /186,209,210/. Это, в свою очередь, ведет к уменьшению проницаемости для неэлектролитов и ионов /102,107,226/. Повышенное содержание холестерина в мембранах различных клеток влияет на пассивный транспорт ионов, затрудняя, в частности, пассивную утечку одновалентных катионов /232/. Холестерин ингибирует транспорт, индуцируемый переносчикали /88,136/, а также активный транспорт, вызывая изменение активности мембраносвязанных ферментов /90,91/. Известно, что холестерин, взаимодействуя с углеводородными цепями фосфоли-пидов, способствует переходу липидов из одного фазового состояния в другое. Цри этом, если фосфолипиды мембран находятся в кристаллическом состоянии, холестерин действует как "разжижающий" фактор, способствуя переходг их в гелеобразное состояние. Если же фосфолипиды находятся в жидкокристаллическом состоянии, то холестерин "конденсирует" жирнокислотные цепи фосфолипидов, вызывая их переход в кристаллическое состояние. Полагают, что холестерин имеет большее сродство к липидам, находящимся в жидкокристаллическом состоянии /186/.
Влияние холестерина на перечисленные характеристики мемб-
_ 6 -
ран предполагает его воздействие и на их поверхностный заряд, который отражает изменения как ионного состава среды, так и распределения и взаимодействия зарядов в мембране. В то же время данные о влиянии холестерина на физическую структуру мембран -црироду и количество реакционно способных ионогенных групп, плотность поверхностного заряда, электрокинетические параметры в литературе црактически отсутствуют.
Избрав в качестве объекта исследований мембраны эритроцитов, мы исходили из следующих соображений. Во-первых, эритроциты являются удобной моделью для выяснения роли индивидуальных липи-дов и, в частности, холестерина в изменении структуры мембран благодаря возможности нацравленного изменения их состава и содержания в мембранах. Во-вторых, увеличение содержания холестерина в мембранах эритроцитов играет существенную роль в патогенезе многих заболеваний. Так, в последние годы широкое расцространение получила "мембранная" гипотеза возникновения атеросклероза /23,156/, согласно которой патобиохимическую основу поражения гладкомышечных клеток аорты составляют процессы, связанные с увеличением микровязкости мембран и йодавлением активности мембра-носвязанных ферментов как следствия увеличения содержания холестерина в мембранах этих клеток.
Заметная роль в патогенезе атеросклероза отводится также эритроцитам, мембраны которых могут претерпевать подобные изменения. Огромное количество эритроцитов в организме, большая адсорбционная поверхность, интенсивный обмен холестерином между ними и плазмой крови создают мощный и быстрообменивающийся эрит-роцнтарно-плазменный пул холестерина /36,52/. Нарушения регуляции обмена холестерина крови вследствие изменения состава и физической организации мембран эритроцитов могут приводить к воз-
никновению гиперхолестеринемии, являющейся важным фактором риска атеросклероза и ишемической болезни сердца.
В связи с этим, мембраны эритроцитов в условиях гиперхо-лестеринемии, атеросклероза и ишемической болезни сердца с различными типами нарушения липидного обмена могут служить удобным объектом для исследования структурно-функциональных изменений цри этих патологиях, связанных с воздействием холестерина.
Данные об особенностях физической структуры мембран эритроцитов при изменении в них содержания холестерина в опытах in vitro , а также при различной выраженности атеросклеротического цроцесса могут быть полезными для объяснения изменения ряда функциональных свойств мембран, механизмов взаимодействия холестерина с мембранами и регуляции его обмена в организме, реологических свойств крови, ее агрегативной устойчивости. Они важны также при выяснении механизмов возникновения и развития атеросклероза.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение физической структуры мембран эритроцитов цри обогащении их холестерином в опытах in vitro, а также цри различной выраженности атеросклеротического процесса: его доклинической стадии - гиперхолестеринемии, алиментарном атеросклерозе, и его осложнении - ишемической болезни сердца с различными типами нарушения липидного обмена.
В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следувдие задачи:
I/ получить мембраны эритроцитов с различным содержанием холестерина в опытах i^ vitro и in vivo цри различной выраженности атеросклеротического процесса у крыс, кроликов, человека и изучить изменения их липидного состава;
2/ охарактеризовать функциональные свойства мембран;
З/ исследовать электрокинетические характеристики - элект-рофоретическую подвижность, j -потенциал и плотность поверхностного заряда мембран методом микроэлектрофореза;
4/ установить природу и количество мембранных зарядов, вносящих вклад в суммарный заряд мембран цри изменении в них содержания холестерина, методом потенциометрического титрования; повысить эффективность метода путем использования ЭВМ;
5/ изучить структурные изменения в мембранах методом флуоресцентных зондов;
6/ исследовать изменения липидного состава и плотности зарядов атерогенных липоцротеинов плазлы крови цри гиперхолесте-ринемии для анализа участия эритроцитов в регуляции обмена холестерина крови при развитии атеросклероза.
Научная новизна. В работе с помощью методов потенциометрического титрования, микроэлектрофореза и флуоресцентных зондов впервые экспериментально доказано нарушение баланса электростатических взаимодействий в мембранах при увеличении в них содержания холестерина в сторону уменьшения плотности как поверхностного, так и суммарного мембранного заряда. На основании анализа данных потенциометрического титрования сделан вывод, что это уменьшение цроисходит за счет снижения количества титруемых СООН-концевых и боковых групп, вторичных фосфорнокислых и ими-дазола гистидина и увеличения количества доступных для титрования ОН-групп тирозина и -ПН2-групп лизина. Проявление этого эффекта зависит от содержания холестерина в мембранах,способа и степени их обогащения холестерином ; последняя определяется также исходным содержанием холестерина и фосфолипидов в мембране.
Значительное обогащение мембран холестерином приводит к существенным сдвигам рК имида зольных групп гистидина и вторичных фосфорнокислых групп, а также к сдвигу максимума флуоресценции в коротковолновую область, что свидетельствует о снижении полярности микроокружения зонда и возможных перегруппировках мембранных компонентов, выражающихся в маскировке и недоступности для титрования определенных полярных групп,
Показаны различия в липидном составе мембран эритроцитов человека цри гиперхолестеринемии и ишемической болезни сердца с различными типами нарушения липидного обмена: значительное увеличение содержания холестерина в мембранах эритроцитов при гипер-холестеринемии, менее значительное цри ишемической болезни сердца с нормальным уровнем холестерина и повышенным триглицеридов и отсутствие изменений при ишегической болезни сердца с гиперхо-лестеринемией. На основании анализа возможных способов выражения и интерцретации данных потенциометрического титрования предложен наиболее адекватный способ и разработана црограмма его реализации с использованием ЭВМ,
Практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований позволяют предположить, что структурная организация мембран, в частности,заряд их поверхности может оказывать влияние на обмен холестерина в организме и таким образом обеспечивать его различную устойчивость к заболеванию.
Электрокинетические свойства мембран эритроцитов могут быть рекомендованы в качестве дополнительного теста возникновения ишемической болезни сердца на стадии развития гиперхолестеринемии.
Разработанные в работе методы изучения структурных характеристик мембран эритроцитов используются в Институте кардиологии
им.Н.Д.Стражеско Ш УССР при выполнении теш "Эпидемиологическое изучение липидов крови и типов липопротеидемии в мужской популяции одного из районов г.Киева, как возможного фактора ише-мической болезни сердца" /J6 0.69.01.03 Н2/. На защиту выносятся следующие положения:
Обогащение мембран эритроцитов холестерином в опытах in vitro и при развитии атеросклероза приводит к уменьшению плотности поверхностного и суммарного мембранных зарядов.
Уменьшение плотности зарядов происходит за счет снижения количества доступных для титрования карбоксильных концевых и боковых групп, вторичных фосфорнокислых и имидазола гистидина. Существенные сдвиги величин рК имидазольных групп гистидина и вторичных фосфорнокислых групп, а также коротковолновый сдвиг максилума флуоресценции зонда астрафлоксина свидетельствуют о конформационных изменениях в мембранных компонентах под действием холестерина.
В отличие от увеличения содержания холестерина и уменьшения плотности зарядов в мембранах эритроцитов крыс, кроликов и человека при гиперхолестеринемии и на ранних сроках развития атеросклероза, ишемическая болезнь сердца с нормолипидемией и ишер-холестеринемиеи не сопровождается существенным изменением содержания холестерина, электрофоретической подвижности и плотности поверхностных зарядов мембран эритроцитов; однако при этом на- . блюдается перерасцределение емкости титруемых ионогенных групп мембран.
Холестерин незначительно изменяет заряд липосом их фосфа-тидилхолина, выраженный на единицу площади их поверхности, и, следовательно, воздействует не только на липидную фазу мембран.
Плотность отрицательных зарядов атерогенных липоцротеи-
- II -
нов плазмы крови уменьшается с увеличением в них содеркания холестерина при гиперхолеотеринемии, что с учетом уменьшения плотности зарядов мембран позволяет высказать предположение о роли мембранных зарядов в регуляции обмена холестерина между липопротеинами и мембранами эритроцитов.
