Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Современные представления о липопротеиновом обмене в норме и при патологии 11
1.2. Структурные изменения липопротеинов низкой плотности при их окислении (экспериментальные и клинические данные) 17
1.3. Образование и вовлечение оксистеролов в атерогенез 23
1.4. Участие окисленных липопротеинов низкой плотности в развитии атеросклероза 26
1.5. Эффект антиоксидантной терапии на окислительную модификацию липопротеинов низкой плотности 29
1.6. Оценка различных стадий определения резистентности липопротеинов низкой плотности к окислению в клинических исследованиях 33
Глава 2. Материал и методы исследования 40
Глава 3. Результаты исследований 51
3.1. Липидный профиль крови, резистентность липопротеинов низкой плотности к окислению и содержание а-токоферола и ретинола в ЛНП у здоровых людей и при коронарном атеросклерозе 51
3.1.1. Липидный профиль крови у практически здоровых мужчин и у мужчин с коронарным атеросклерозом 51
3.1.2. Результаты исследования уровня а-токоферола и ретинола в крови и в липопротеинах низкой плотности и резистентности к окислению липопротеинов низкой плотности практически здоровых мужчин разного возраста 54
3.1.3. Результаты исследования резистентности липопротеинов низкой плотности к окислению у мужчин с коронарным атеросклерозом 56
3.1.4. Результаты исследования уровня а-токоферола и ретинола в сыворотке и в липопротеинах низкой плотности у мужчин с коронарным атеросклерозом 63
3.2. Содержание оксистеролов, холестерина и его эфиров на разных стадиях развития атеромы человека 68
3.3. Влияние 7-кето-холестерина и 27-ОН-холестерина на синтез эфиров холестерина и триглицеридов в макрофагах 71
Глава 4. Обсуждение результатов исследований.74
Выводы 84
Список литературы 85
- Современные представления о липопротеиновом обмене в норме и при патологии
- Эффект антиоксидантной терапии на окислительную модификацию липопротеинов низкой плотности
- Липидный профиль крови у практически здоровых мужчин и у мужчин с коронарным атеросклерозом
- Результаты исследования уровня а-токоферола и ретинола в сыворотке и в липопротеинах низкой плотности у мужчин с коронарным атеросклерозом
Введение к работе
Актуальность темы. Сердечно-сосудистые заболевания атеросклеротического генеза являются основной причиной смертности
* трудоспособного населения во всех высокоразвитых странах, включая
Россию (Оганов Р. Г., 2004; Murray C.J, Lopez A.D., 1997).
В последние годы в патогенезе атеросклероза все большее признание получает концепция ключевой роли окисленных липопротеинов низкой плотности (ЛНП) как инициаторов, провокаторов и индукторов атерогенеза в сосудистой стенке (Климов А.Н., Никульчева Н.Г., 1995; Зенков Н.К., Меньшикова Е.Б., 1996; Heinecke J.W., 1987; Sparrow СР.,
* 1989; Zhang Z. et al, 1990; Lamb D.J., 1992; Zieden В., 1992; Jessup W. et al.,
1993; Keidar S. et al., 1994; Westhuyzen J., 1997). Окислительная
модификация ЛНП способствует их быстрому и нерегулируемому захвату
через скэвенджер-рецепторы макрофагов (МФ), что приводит к
массивному внутриклеточному накоплению холестерина (ХС) и его
эфиров и трансформации макрофагов в пенистые клетки (Никитин Ю.П. и
др., 1998; Ланкин В.З. и др., 2000; Steinbrecher U.P., 1990; Krauss R. М.,
1991; Westhuyzen J., 1997; Steinberg D., 2002). Атерогенность окисленных
'* ЛНП связана не только с повышенным содержанием в них ХС, но и с их
способностью стимулировать продукцию целого ряда воспалительных медиаторов: хемоаттрактантов к моноцитам и лимфоцитам, цитокинов, активных кислородных метаболитов (АКМ) (Steinberg D. et al., 1989; Esterbauer H. et al, 1989-1993; Steinbrecher U.P., 1990; Leake D.S, 1991; Aviram M, 1993; Aviram M, 1995; Aviram M, 1998; Huang Y. et al, 1999; Petit L. etal, 1999).
ІФ Впервые исследовать степень "предрасположенности" ЛНП к
окислительной модификации по показателю устойчивости ЛНП к окислению in vitro было предложено Г. Эстербауэром и соавт. (Esterbauer Н. et al, 1989). Они предложили оценивать продукты перекисного
7 окисления липидов (ПОЛ) в выделенных ультрацентрифугированием ЛНП в динамике их окисления в присутствии ионов металлов переменной валентности. Авторы назвали этот показатель резистентность липопротеинов низкой плотности к окислению in vitro. В дальнейшем было показано, что устойчивость ЛНП к окислению отражает баланс прооксидантов и антиоксидантов в крови и в ЛНП, нарушение которого ассоциируется с развитием атеросклероза (Esterbauer Н. et al., 1989; Cominacini L. et al., 1991). Этот комплексный показатель отражает, с одной стороны, количество в ЛНП полиненасыщенных жирных кислот (основного субстрата окисления) и продуктов ПОЛ (диены, малоновый диальдегид и др.) и, с другой стороны, антиоксидантный потенциал ЛНП
* (Cominacini L. et al., 1991).
Основным антиоксидантом в ЛНП является а-токоферол, количество
которого в частицах ЛНП превалирует над другими липофильными
антиоксидантами. Альфа-токоферол первым расходуется при окислении
ЛНП (Esterbauer Н. et al., 1989,1992). Ретинол содержится в ЛНП в
меньшем количестве, но также препятствует их окислительной
модификации (Esterbauer Н. et al., 1992). Поскольку ЛНП крови являются
основной мишенью процесса ПОЛ, их резистентность к окислению, в
** какой-то мере, может служить показателем, характеризующим
окислительно-антиоксидантную систему в целом.
Окисление ЛНП сопровождается образованием окисленных производных ХС, называемых оксистеролами. В последнее время интерес к участию этих соединений в атерогенезе значительно повысился. Это связано с обнаружением высоких концентраций оксистеролов в атеросклеротических бляшках и в МФ/пенистых клетках (Bjorkhem L. et
* al, 1991; Mattsson L., 1996; Jessup W. et al., 1997).
Известно, что оксистеролы обладают индуцирующим атерогенным эффектом в сформированных атеросклеротических бляшках человека и кролика (Bjorkhem L. et al., 1994; Mattsson L. et al, 1996; Brown M.S. et al,
#
8 1997, 1999). Однако, изменение количественного и качественного состава этих соединений в динамике стадийного развития атеросклероза мало изучено.
Таким образом, окисление ЛНП и образование оксистеролов в атеросклеротичекой бляшке являются важными показателями развития атеросклероза. Взаимосвязь же между степенью окисления ЛНП и содержанием оксистеролов (таких, как 7-кето-ХС) остается мало изученной. Более того, практически нет данных о степени выраженности окислительной модификации ЛНП в зависимости от распространенности в сосудах атеросклеротических очагов.
Цель исследования:
Изучить взаимосвязь между окислительно-антиоксидантным потенциалом липопротеинов низкой плотности и накоплением окисленных производных холестерина (оксистеролов) в процессе развития атеросклероза.
Задачи исследования:
Исследовать резистентность липопротеинов низкой плотности к окислению in vitro у пациентов с различной выраженностью атеросклеротического поражения коронарных артерий в сравнении с контрольной группой лиц.
Исследовать содержание а-токоферола и ретинола в липопротеинах низкой плотности у пациентов с различной степенью атеросклеротического поражения коронарных артерий в сравнении с контрольной группой лиц
Исследовать соотношение 7-кето-холестерина и 27-ОН-холестерина в процессе развития атероматозных бляшек коронарных артерий пациентов с коронарным атеросклерозом.
9 4. Исследовать регуляторную роль различных оксистеролов в процессах эстерификации холестерина и накопления липидов в атеросклеротических бляшках человека и на модели культивируемых
макрофагов.
Научная новизна
Впервые было обнаружено, что резистентность ЛНП к окислению связана с выраженностью и распространенностью поражения коронарных артерий атеросклерозом: при 2-,3-,4-сосудистом поражении этот показатель более низкий, по сравнению с одно-сосудистым поражением.
Впервые показано, что характер окисления холестерина зависит от стадии развития атеросклеротической бляшки: на стадии раннего атеросклероза (липидное пятно) превалирует 27-ОН-ХС (продукт внутриклеточной гидроксилазы), стимулирующий эстерификацию ХС в МФ/пенистых клетках. На поздних стадиях атеросклероза основным оксистеролом в бляшке является 7-кето-ХС (продукт процесса аутоокисления ХС), который значительно в меньшей степени оказывает влияние на эстерификацию ХС.
Теоретическое и практическое значение работы. Теоретическое
* значение работы состоит в том, что установлены особенности накопления
оксистеролов различного происхождения (основного продукта аутоокисления холестерина 7-кето-ХС и продукта ферментативного гидроксилирования холестерина 27-ОН-ХС) в динамике развития атеросклеротической бляшки. Установлено, что на ранних стадиях развития атеросклеротической бляшки в меньшей степени присутствует 7-кето-ХС, содержание которого увеличивается по мере развития
& атеросклероза. В тоже время 27-ОН-ХС обнаруживается как на ранних, так
и на поздних стадиях развития атеросклеротической бляшки. Эксперименты, проведенные на модели макрофагов, свидетельствуют, что
10 эти оксистеролы могут являться стимуляторами накопления липидов в атеросклеротической бляшке.
Практическое значение работы заключается в том, что продемонстрирована возможность применения в клинической биохимии простого оригинального и информативного способа оценки показателя окислительной резистентности ЛНП, низкое значение которого может являться дополнительным маркером атеросклероза. Показатель уровней а-токоферола и ретинола непосредственно в ЛНП является более информативным, чем определение этих антиоксидантов в крови, поскольку реально отражает окислительно-антиоксидантный дисбаланс в ЛНП.
Положения, выносимые на защиту:
1. Характерными показателями, отражающими окислительно-
антиоксидантный дисбаланс при коронарном атеросклерозе, являются
сниженные окислительная резистентность и антиоксидантный потенциал
липопротеинов низкой плотности. Эти изменения более выражены при
значительном распространении атеросклеротического поражения
коронарных артерий.
2. На ранних стадиях развития атеросклеротического поражения
^ наблюдается более низкое содержание аутоокисленных форм холестерина
по отношению к продуктам ферментативного гидроксилирования холестерина. На поздних стадиях развития атеросклеротического поражения соотношение этих оксистеролов сдвигается в сторону увеличения концентрации 7-кето-ХС.
3. Оксистеролы 27-ОН-ХС и 7-кето-ХС, накапливающиеся в
атеросклеротической бляшке по мере ее развития, стимулируют синтез
* липидов в макрофаг/пенистых клетках.
Современные представления о липопротеиновом обмене в норме и при патологии
Липопротеины плазмы крови являются уникальной транспортной формой липидов в организме человека и животных. Они осуществляют транспорт липидов, жирорастворимых витаминов, гормонов и других биологически активных веществ в систему циркуляции и далее к местам утилизации или депонирования (Томпсон Г.Р., 1992).
Все липопротеины имеют одинаковую структуру: состоят из гидрофобного ядра, в котором находятся эфиры холестерина и триглицериды. Гидрофильная поверхность представлена фосфолипидами, свободным холестерином и специфическими белками- апопротеинами (Холодова Ю. Д.,1990). Существует несколько классификаций ЛП, основанных на различиях в их свойствах: гидратированной плотности, скорости флотации, электрофоретической подвижности, а также на различиях в апопротеиновом составе частиц. По классификации, использующей { гидратированную плотность ЛП, их делят на 4 класса: хил омикроны (ХМ); липопротеины очень низкой плотности (ЛОНП); липопротеины низкой плотности (ЛНП) и липопротеины высокой плотности (ЛВП). По электрофоретической подвижности выделяют хиломикроны, пре-Р липопротеины (что соответствует ЛОНП); Р-липопротеины (соответствует ЛНП); а-липопротеины (соответствует ЛВП). ЛП разных классов различаются по размерам, особенностям строения и функциям в организме. Хиломикроны (ХМ) являются самыми крупными ЛП-частицами и имеют диаметр от 100 до 1100 нм. Хиломикроны богаты триглицеридами, содержат апопротеин В-48 (Kane J. et al.,1980) в качестве главного структурного белка и транспортируют экзогенные (пищевые) жиры и ХС из кишечника в печень и периферические ткани. Они образуются в эндоплазматическом ретикулуме кишечника, секретируются в лимфу и затем через грудной проток попадают в кровь. Период полураспада (а v точнее, период полувыведения из крови) хиломикронов составляет 10 15мин (Eisenberg S., Levy R., 1975). Плазма крови здоровых людей, при взятии крови натощак практически не содержит хиломикронов. После секреции хиломикроны получают апопротеины Е, C-I, C-II и С-Ш от липопротеинов высокой плотности (ЛВП). В кровотоке под действием фермента липопротеинлипазы (ЛПЛ), связанной с протеогликанами эндотелиальных клеток и активируемой с помощью апопротеина С-П, происходит гидролиз триглицеридов в составе хиломикронов. Хиломикроны превращаются в ремнанты, которые имеют плотность липопротеинов очень низкой плотности (ЛОНП), и затем -липопротеинов промежуточной плотности (Brewer Н.В., 1999). Ремнанты хиломикронов, содержащие апопротеин В-4 8 и обогащенные апопротеином Е, захватываются гепатоцитами с помощью рецепторов, имеющих высокое сродство с апопротеином Е. Параллельно печень секретирует богатые триглицеридами ЛОНП, & содержащие на поверхности молекулу апопротеина В-100 (Beisiegel U., 1998). Апопротеин В-100, синтезируемый в печени является основной частью не только ЛОНП, но и липопротеинов промежуточной плотности и липопротеинов низкой плотности, поэтому их относят к содержащим апопротеин В липопротеинам крови. Липопротеины очень низкой плотности являются транспортной формой эндогенных триглицеридов, на долю которых приходится около ч4 50-70% массы частицы (Климов Н.А., Никульчева Н.Г., 1995). Помимо апопротеина В-100 ЛОНП имеют апопротеины Е, C-I, С-П и С-Ш, которые поступают к частицам уже в кровотоке от ЛВП. Примерно половина секретированных ЛОНП обратно захватываются печенью (Grundy S.M. and Vega G., 1990). Другая половина после гидролиза триглицеридов в составе этих частиц под действием фермента липопротеинлипазы превращаются в меньшие по размеру, обогащенные ХС, липопротеины промежуточной формы (ЛПП), а затем в ЛНП. Липопротеины низкой плотности являются основным переносчиком эндогенного ХС в крови (транспортирует около 70% общего ХС плазмы). Его липидное ядро почти полностью состоит из эфиров ХС. Эти эфиры ХС имеют двойное происхождение. Большая их часть появляется в результате переноса ЭХС из ЛВП2 на ЛПП при участии ЭХС-переносящего белка (Fielding Р.Е., Fielding C.J., 1980; Franceshini G. et al., 1991). Другая часть представлена ЭХС печеночного происхождения. Основным белком ЛНП является апо-В-100. Большая часть ЛПП и ЛНП утилизируется через В/Е-рецептор паренхимных и непаренхимных клеток печени. Липопрортеины высокой плотности (ЛВП) - самые мелкие по размеру липопротеиновые частицы. На их долю приходится 20-30% общего холестерина крови, но из всех липопротеинов именно эти частицы содержат наибольшее количество фосфолипидов и белка. ЛВП образуются в печени и кишечнике в виде незрелых дисковидных частиц, состоящих из фосфолипидов, апопротеинов семейства A (A-I и А-П) и ХС. Основная функция ЛВП в обмене липопротеинов - обеспечение обратного транспорта ХС. По современным представлениям, незрелые частицы ЛВПз - хорошие акцепторы свободного ХС (Brewer Н.В., 1999). Свободный ХС на поверхности ЛВП эстерифицируется с образованием эфиров ХС. Эстерификация осуществляется ферментом лецитин холестеринацилтрансфераза (ЛХАТ), кофактором которого является апопротеин А-1, структурный белок ЛВП. Образованные эфиры холестерина перемещаются с поверхности частиц ЛВП в гидрофобное ядро, освобождая, таким образом, дополнительную поверхность для свободного ХС. По мере накопления в ядре эфиров ХС, дисковидные частицы ЛВП преобразуются в сферические, богатые холестерином ЛВП2. Из ЛВП2 синтезированные ЭХС переносятся с помощью ЭХС-переносящего белка в ЛПП, из которых затем уже поступают в ЛНП. Так как ЛВІІ2 содержат апо-Е, эти ЛП могут утилизироваться клетками печени, почек, селезенки и другими клетками через апо-В,Е рецепторы. Уникальная роль липопротеинов в липидном метаболизме и его регуляции осуществляется с помощью белковых компонентов ЛП аполипопротеинов различных классов. Они участвуют в поддержании структурной целостности ЛП, а также обеспечивают их нормальное распределение между различными тканями организма, поскольку захват ЛП включает узнавание специфических аполипопротеинов рецепторами клеточной поверхности. Аполипопротеины также выступают как кофакторы ферментов липидного метаболизма. Кроме транспорта липидов (ЭХС и ТГ), липопротеины выполняют также в нормальных физиологических условиях, функции транспорта жирорастворимых витаминов и других липотропных соединений (Поляков Л.М., Часовских М.И., Панин Л.Е., 1992). Большая роль в этом транспорте отводится ЛНП. В последние годы стало известно, что ЛНП являются также основными переносчиками гидроперекисей (Nouroozzadeh J. et al., 1996). При патологии (повышенном содержании в крови, увеличении срока полужизни или модификации) ЛНП могут провоцировать повреждение сосудистой ткани и развитие атеросклеротического процесса (Климов А.Н.,НикульчеваН.Г., 1995).
Эффект антиоксидантной терапии на окислительную модификацию липопротеинов низкой плотности
У всех пациентов обследование проводилось при поступлении в клинику (не позже 3-го дня после поступления). Кровь для биохимического исследования брали утром натощак из локтевой вены не ранее чем через 12 часов после последнего приема пищи. Содержание общего ХС, ТГ и ХС-ЛВП (липидный профиль) сыворотки крови определялось ферментативными методами с использованием стандартных реактивов "Boehringer Mannheim" (Германия), Biosub CHOL, Biosub TG и ХС-ЛВП (Herbos dijagnostika) на химических анализаторах FP-901 Labsystem Oy (Финляндия) и «Корона». Уровень ХС-ЛНП рассчитывали по формуле Friedewald W. Т. Измерение общего ХС, ТГ и ХС-ЛВП сыворотки крови энзиматическими методами у обследованных групп лиц проводилось совместно с научным сотрудником НИИ терапии СО РАМН Ивановой М.В. Концентрации жирорастворимых витаминов в сыворотке крови определяли двумя методами: методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в модификации, используя оригинальный микрометод анализа содержания токоферола в биоматериале с помощью ВЭЖХ, на отечественном, микроколоночном хроматографе «Милихром» (Микичур Н.И., Сафронов И.Д., 1998) и флуориметрическим методом. Хроматографический анализ проводился в НЦ КЭМ СО РАМН, на микроколонке (2x60 мм), заполненной сорбентом «Нуклеосил»С 18 (5 мкм). Режим элюции - изократический, элюентом была смесь метанола, ацетонитрила и хлороформа в соотношении 25:60:15, скорость элюции 100 мкл/мин, способ УФ-детекции был многоволновый (260-290 нм). щ Подготовка пробы: к 100 мкл сыворотки добавляли 100 мкл метилового и 100 мкл этилового спиртов для коагуляции и осаждения белков, встряхивали 10 сек., приливали 500 мкл гексана, встряхивали 60 сек., центрифугировали в течение 3 мин при 3000 об/мин, забирали гексановый слой и выпаривали его в вакууме. Экстракт перерастворяли в 50 мкл метилового спирта и наносили на микроколонку. В качестве стандартов использовали калибровочные растворы а-токоферола, ретинола и р-каротина (производства фирмы «Serva», США). Содержание витаминов рассчитывали по величине амплитуды пиков, полученных на хроматограмме, в пересчете на стандарт и выражали в мкмоль/л. Подготовка проб сыворотки крови к исследованию уровня а-токоферола и ретинола флуориметрическим методом выполнялась следующим образом: к 0,25 мл сыворотки добавляли 0,5 мл этилового спирта, встряхивали, добавляли 0,25 мл аскорбиновой кислоты и 0,5 мл КОН для омыления образцов. На 40 минут пробы помещали на водяную баню при температуре 70С, после чего пробы остужали, и экстрагировали 2 мл гексана, тщательно встряхивая каждую пробу. Верхний гексановый слой переносили в другие пробирки и анализировали на спектрофлуориметре "Hitachi MPF-2a". Длина волны для ретинола составляла - Ех 340, Em 490 nm, для а-токоферола - Ех 290, Em 334 nm. Суммарную фракцию ЛНП и ЛОНП фракцию (преимущественно ЛНП) получали из 0,5 мл сыворотки крови методом осаждения (Карманский И.М., Шпикитер В.О., 1981, Burstein М., Scholnik H.R., 1973) в присутствии гепарина (200 ЕД/мл сыворотки) и хлорида марганца (50 мМ/мл сыворотки). Для удаления несвязанного гепарина и хлорида марганца осажденные ЛНП дважды промывали 0,9 % раствором хлорида натрия с 50мМ раствором фосфатного буфера рН 7,4 центрифугированием, после чего осажденные ЛНП растворяли в 1 мл 1М раствора хлорида натрия. В полученных ЛП определяли общий ХС ферментативным методом, используя стандартные реактивы "Boehringer Mannheim " (Германия), а также содержание белка по методу Лоури (Lowry Н., Roenbrought NJ. etal., 1951). Окислительную модификацию ЛНП проводили в среде Дульбекко без кальция и магния, содержащей 50 мкмоль C11SO4 в присутствии 0,2 мг/мл ЛНП. Пробы инкубировали при 37С на водяной бане. Через определенные промежутки времени (0 ч, 0,5ч, 1 ч, 2 ч) оценивали уровень ТБК-реактивных продуктов в 0,3 мл инкубационной среды, содержащей ЛНП. Определение ТБК-реактивных продуктов (МДА) проводили по методу Schuh и соавт. (Schuh J., Fairclough G.F., 1978). К 300 мкл образца добавляли 1 мл смеси 25% ТХУ и 1% ТБК (1:1) и инкубировали пробы в течение 45 минут при температуре 95С. Затем пробы охлаждали и центрифугировали образцы при 3000 об/мин в течение 10 минут. В надосадке регистрировали интенсивность флуоресценции ТБК реактивных продуктов на спектрофлуориметре Hitachi F-300 при длине волны 553 нм (длина волны возбуждающего света 515 нм). В качестве стандарта использовали 1,1,3,3-тетраметоксипропанол. Результаты выражали в нмоль МДА/мг белка ЛНП. К 0,5 мл сыворотки крови добавляли 20 мкл гепарина (из фармакопейного раствора, содержащего 5000 ЕД/мл), перемешивали, добавляли 37 мкл 1М раствора хлорида марганца, перемешивали, оставляли на 30 минут при 0С, центрифугировали при 0С 30 минут, осадок промывали 0,5 мл 0,9% раствора хлорида натрия, центрифугировали, осажденные ЛНП растворяли в 0,5 мл 1М раствора хлорида натрия. В полученных ЛНП измеряли белок по общепринятому методу Лоури и соавторов (1951). Далее, в ЛНП определяли концентрации витаминов Е и А флуориметрическим методом (Taylor S.L. el al., 1976). 0,25 мл сыворотки добавляли 0,5 мл этилового спирта, встряхивали, добавляли 0,25 мл аскорбиновой кислоты и 0,5 мл КОН для омыления образцов. На 40 минут пробы помещали на водяную баню при температуре 70С, после чего пробы остужали, и экстрагировали 2 мл гексана, 1 тщательно встряхивая каждую пробу. Верхний гексановый слой переносили в другие пробирки и анализировали на спектрофлуориметре Hitachi F-300. Длина волны для ретинола составляет Ех 340, Em 490 нм, для а-токоферола - Ех 290, Em 334 нм. Результаты выражали для витамина Е - в мг/мг белка ЛНП, для витамина А - в мкг/мг белка ЛНП.
Липидный профиль крови у практически здоровых мужчин и у мужчин с коронарным атеросклерозом
Окисленные ЛНП являются высоко атерогенными частицами, которые стимулируют накопление ХС в макрофагах и формирование пенистых клеток (Панкин В.З. и др., 2000; Steinberg D., 2002), проявляют цитотоксичность к клеткам артериальной стенки (Hughes Н. et al., 1994; Zhou Q. et al., 1993) и стимулируют воспалительный и тромбогенный процессы. Все клетки артериальной стенки и особенно макрофаг могут окислять ЛНП (Steinbrecher U.P. et al., 1984; Leake D.S., Rankin S.H., 1990). Некоторые авторы считают, что окисленные ЛПН возникают на ранних этапах атеросклероза и это зависит от оксидантного статуса ЛНП. т Поэтому определение резистентности ЛНП к окислению является очень информативным показателем нарушения баланса оксидантов и антиоксидантов на ранних этапах заболевания. Этот показатель комплексный. Он зависит в свою очередь от целого ряда факторов: отношения поли/мононенасышенных ЖК, содержания антиоксидантов ассоциированных с ЛПН таких как витамин Е, бета-каратина, полифенольных флованоидов и других антиоксидантов. В тоже время, этот показатель является одновременно итогом антиоксидантного статуса В условиях окислительного стресса окисление макрофагальных липидов может приводить к клеточно-зависимому окислению ЛНП даже в отсутствие ионов переменной валентности. Исследования многочисленных параметров окислительного стресса в условиях клиники является дорогостоящим и сложным процессом. Поэтому, на мой взгляд интегральный показатель резистентности ЛНП к окислению может оказаться достаточно простым и в тоже время информативным методом диагностики ранних этапов атерогенеза (Aviram М., Fuhrman В., 1998). Этот простой диагностический тест имеет не только диагностическую ценность, но может служить критерием эффективности лечения антиоксидантами (растительными и синтетическими) (Filipe P., Haigle J. et al., 2004; Katsube Т., Tabata H. et al., 2004; Tesoriere L., Butera D. et al., 2003) и гиполшшдемическими препаратами (Rosenson R.S., Wolff D., 2004). Наши исследования показали, что у больных с коронарным атеросклерозом повышенное содержание ХС и ТГ и пониженное содержание ХС-ЛВП сочетается со снижением резистентности ЛНП к окислению. Полученные данные можно объяснить тем, что: 1) содержание ХС в крови как правило сопровождается увеличением содержания ЭХС в ЛНП, содержащих ненасыщенные ЖК, что повышает их уязвимость к прооксидантному воздействию (Aviram М., Fuhrman В.,1998).Полученные результаты согласуются с данными (Balkan J, Dogru-Abbasoglu S, et al.,2004), которые показали, что рост уровня ХС ЛПН здоровых субъектов приводит к повышению диеновых конъюгатов, МДА и других прооксидантов померенных в ЛНП из фракции изолированной преципитацией гепарином из плазмы; 2) поскольку частицы ЛВП проявляют сильную антиоксидантную активность, то их снижение может привести к повышению окисляемости ЛНП. Повышение ТГ в крови также коррелировало со снижением резистентности ЛНП к окислению. Механизм этого явления не совсем ясен, хотя известно, что снижение ТГ плазмы в результате активации их липолиза приводит к росту резистентности ЛНП к окислению (Skoglund-Andersson С, Кафе F. et al., 2003). В тоже время у больных с коронарным атеросклерозом было обнаружено достоверное снижение уровня витаминов Е и А, что согласуется с литературными данными (Gey K.F. et al., 1991; Jialal I. et al., 1991; Nyyssonen K. et al., 1994). Являясь интегральным показателем, резистентность ЛПН к окислению не всегда связана с уровнем липидов в крови. Например, при одном из гемолитических заболеваний, таком как талассемия, Си индуцируемое окисление ЛНП повышалось на фоне сниженного (25%) уровня ХС и белка (61%) ЛПН (Tesoriere L., D Arpa D. et al.,1998). Наши данные показали, что этот показатель зависит от возраста. Нами были получены данные различий резистентности ЛНП к окислению в возрастных группах здоровых пациентов. Окисляемость ЛНП возрастала у мужчин возрастной группы 51-59 лет. При этом в возрастных группах больных этот показатель достоверно не различался. Более того, при этом не было выявлено отличий в содержании витамина Е и А в ЛНП и в сыворотке крови в возрастных группах больных и здоровых пациентов. Полученные данные свидетельствуют, что резистентность ЛНП к окислению является более информативным показателем, чем содержание витаминов Е и А, обладающих антиоксидантной активностью. По-видимому, этот интегральный показатель является более чувствительным к появлению признаков окислительного стресса вызванного различными причинами, приводящими к нарушению окислительно/антиокислительного баланса. В возрастных группах пациентов с коронарным атеросклерозом не было достоверных различий в показателях резистентности ЛНП к окислению, хотя по сравнению со здоровыми людьми этот показатель уменьшался и коррелировал со снижением витамина Е и А. Полученные результаты, по-видимому, свидетельствуют о серьезном нарушении антиоксидантной системы при развитии атеросклероза. Вероятно на фоне окислительного стресса, который как известно сопровождается развитием коронарных заболеваний, тонкие возрастные различия в резистентности ЛНП к окислению не выявляются. Впервые нами было проведено исследование изменения резистентноси ЛНП к окислению у больных с коронарным атеросклерозом # в зависимости от: 1) некоторых клинических симптомов (стабильная стенокардия напряжения II и III функционального класса); 2) количества атеросклеротически пораженных артерий; 3) данных анамнеза о перенесенном инфаркте миокарда. При исследовании подгрупп пациентов с коронарным атеросклерозом со стабильной стенокардией напряжения II и III функционального класса не было выявлено статистически значимых различий как в показатели резистентности ЛНП к окислению, так и в уровне витаминов Е и А. В тоже время, отмечены явные различия в показателе исходного уровня продуктов ПОЛ в ЛИП и в резистентности ЛНП к окислению между подгруппами в зависимости от количества атеросклеротичеки пораженных артерий. В этих же подгруппах были зафиксированы статистически значимые различия в концентрации а токоферола и ретинола.
Результаты исследования уровня а-токоферола и ретинола в сыворотке и в липопротеинах низкой плотности у мужчин с коронарным атеросклерозом
Как известно, окисление ЛНП сопровождается образованием в них оксисленных производных ХС (оксистеролов), которые рассматривают как один из индуцирующих факторов развития атеросклеротических бляшек (Bjorkhem L. et al., 1991; Brown M.S., 1999). Основным оксистеролом в окисленных ЛНП является 7-кето-ХС, который образуется в результате атаки радикалов кислорода между 6 и 7 атомом углерода в пергидрофенантреновом кольце. 7-кето-ХС не является продуктом клеточного метаболизма и рассматривается как продукт аутоокисления ХС. В тоже время, при развитии холестериноза в тканях в условиях аккумуляции ЛНП в разных типах клеток, и особенно в макрофагах, наблюдается внутриклеточная трансформация ХС в эндогенные оксистеролы. К таким эндогенным оксистеролом можно отнести 25- или 27-ОН-ХС, которые образуются в результате гидроксилирования ХС в алифатической цепи при участии 25- и 27-гидроксилазы. При изучении содержания этих оксистеролов в атеросклеротических бляшках показано увеличение и 7-кето-ХС и 27-ОН-ХС в атеросклеротических бляшках человека и животных (Brown M.S. et al., 1997). В то время как ауотоокисленные оксистеролы в ряде работ рассматриваются как проатерогенные соединения, увеличение концентрации оксистеролов клеточного происхождения предполагает физиологически защитную реакцию в ответ на поступление избыточного ХС в клетку. Так, генетический дефект 27-гидроксилазы сопровождается бурным развитием атеросклероза и развитием ксантоматоза на коже. Поскольку существует выраженная взаимосвязь между появлением окисленных ЛНП и отложением оксистеролов в атеросклеротических бляшках мы исследовали содержание 7-кето-ХС (основного представителя аутоокисленных оксистеролов) и 27-ОН-ХС (представителя эндогенных оксистеролов) в атеросклеротических бляшках на стадии липидного пятна и фиброзных бляшках, полученных после аортокоронарного шунтирования у пациентов с коронарным атеросклерозом. Полученные результаты показали, что существует явное различие между 7-кето-ХС и 27-ОН-ХС в зависимости от развития атеросклеротической бляшки. В липидной бляшке на стадии липидного пятна наблюдалось менее выраженное количество 7-кето-ХС и повышение уровня 27-ОН-ХС. В тоже время в липидном пятне наблюдается менее выраженное накопление ЭХС и СХС (163±24 и 24±6,3 мкг/мг белка). Это свидетельствует, что на ранней стадии развитии атеросклеротической бляшки компенсаторно-клеточные механизмы справляются с избытком накопления ХС в сосудистой стенке. Относительно низкий уровень 7-кето ХС указывает на то, что окисление ЛНП еще относительно замедленное и при поступлении избытка ХС в макрофаги, макрофагальная 27-гидроксилаза активируется и способствует выведению ХС в виде 27-ОН-ХС. При развитии фиброзной бляшки наблюдается повышенный рост 7-кето-ХС и дальнейшее повышение уровня 27-ОН-ХС. Соотношение уровня этих стероидов смешается в сторону увеличения концентрации 7 Щ кето-ХС. Значительно растет уровень ЭХС и что особенно плохо СХС. Рост 7-кето-ХС указывает на интенсивное окисление ЛНП на поздних этапах атеросклероза. В тоже время, по-видимому, компенсаторной реакции 27-ОН-ХС не достаточно для того, чтобы вывести избыток ХС из атеросклеротической бляшки. Интенсификация процесса окисления ЛНП в фиброзных бляшках, по-видимому, приводит к накоплению внеклеточных липидов, в частности СХС, 7-кето-ХС и других аутоокисленных щ оксистеролов. Таким образом, содержание оксистеролов в бляшке отражает патофизиологические механизмы участия окисленных ЛНП на различных стадиях атерогенеза. Одним из главных маркеров развития атеросклероза, позволяющих связать воедино морфологические и биохимические проявления атеросклероза, является образование пенистых клеток. Поскольку основными предшественниками пенистых клеток (2/3) являются макрофаги, накапливающие в цитоплазме ЭХС, мы исследовали влияние 7-кето-ХС и 27-ОН-ХС на скорость эстерификации ХС и ТГ в макрофагах. Было обнаружено, что 27-ОН-ХС более эффективно, чем 7-кето-ХС (в 1,9 раз) стимулирует скорость включения [14С] олеата в ЭХС в отсутствии притока ХС в клетке. Способность 27-ОН-ХС строго стимулировать скорость эстерификации свидетельствует о его физиологической роли сохранения клеточного гомеостаза свободного ХС. В тоже время 27-ОН-ХС не оказывает влияния на синтез ТГ, который часто возрастает в условиях нарушения Р-окисления в митохондриях. По-видимому, действий 27-ОН-ХС связано с активацией ацилКоА-холестерол-ацилтрансферазы при связывании с аллостерическим центром фермента. 7-кето-ХС в меньшей степени стимулирует синтез ЭХС и стимулирует одновременно синтез ТГ. Возможно это связано с нарушениями функций митохондрий и соответственно Р-окисления ЖК и как следствие активации их утилизации в ТГ и ЭХС. Поэтому действие 7-кето-ХС можно рассматривать как токсическое действие на клетку в конечном итоге приводящее к ее гибели путем апоптоза или некроза. На основании полученных данных и данных литературы мы предлагаем следующую схему некоторых механизмов участия окисленных ЛНП в атерогенезе (рис. 12). Предполагается, что инициация развития атеросклероза связанная с повреждением эндотелия и миграция ЛНП в субэндотелиальное пространство связано со снижением резистентности ЛНП или отдельных субфракций ЛНП к окислению. ЛНП со сниженным количеством антиоксидантов легко подвергаются атаке свободных радикалов выделяемых активированным эндотелием и макрофагами. Хорошо известно из литературных данных, что продукты даже минимально окисленных ЛНП (4-гидроксиноненаль) обладают способностью стимулировать адгезивные молекулы на поверхности эндотелия и стимулировать синтез хемоаттрактантов, что в свою очередь способствует миграции моноцитов в субэндлтелиальное пространство. Главным продуктом окисления ХС в ЛНП является 7-кетоХС, который имеет выраженные атерогенные свойства. На ранних этапах развития атеросклероза (на стадии липидного пятна) наблюдается еще незначительное накопление этого стероида. Вероятно, это связано с относительно низкой способность макрофагов окислять ЛНП. Окисленные ЛНП и их агрегаты, захваченные макрофагом, деградируют в лизосомах и освобожденный ХС поступает в цитоплазму, где с одной стороны эстерифицируется, а с другой превращается в 27-ОН-ХС при участии митохондриальной 27-гидроксилазы. Известно, что синтез 27-ОН-ХС является компенсаторным физиологическим процессом, который направлен на освобождение избытка ХС в клетке. Кроме того, 27-ОН-ХС является внутриклеточной регуляторной молекулой, имеющей ядерные рецепторы ответственные за регуляцию, вчастности, холестеринового гомеостаза в клетке. 27-ОН-ХС также имеет отношение как показано нами, к активации АХАТ. Поэтому повышение уровня 27 ОН-ХС в атеросклеротической бляшке на стадии липидного пятна отражает компенсаторные процессы, направленные на обратный транспорт ХС из клеток и на поддержание уровня свободного ХС в клетках.
