Введение к работе
Актуальность работы. Фотосинтез - важнейший процесс, обеспечивающий существование биосферы Земли. Преобразование энергии солнечного света в энергию химических связей стабильных продуктов световой стадии фотосинтеза - АТФ и НАДФН, происходит в тилакоидах хлорошіастов растений и водорослей. Поглощение хлорофиллом квантов света обеспечивает энергией перенос электронов от воды к НАДФ вдоль цепи переносчиков двух фотосистем. Энергия тратится на образование НАДФН и формирование трансмембранного электрохимического потенциала Н+ (в основном — в виде градиента рН), который используется для синтеза АТФ.
В центре внимания биоэнергетиков находятся проблемы переноса электронов в реакционных центрах и комплексах фотосистем I и II, между фотосистемами и в цитохромном комплексе ЬД а также механизм работы АТФ-синтазного комплекса. В этих областях достигнуты высокие результаты.
При переходе от модельных систем к хлоропластам in vivo особое значение приобретают исследования процессов регуляции сопряжения переноса электронов и синтеза АТФ, которым, на наш взгляд, сейчас уделяется недостаточно внимания. Так, к настоящему времени найдено большое количество искусственных разобщителей сопряжения, но вопрос о том, возможно ли эндогенное разобщение фотосинтетических реакций в живой клетке до сих пор остается открытым. Анализ литературы показывает, что в качестве эндогенных разобщителей могут рассматриваться только аммоний и насыщенные свободные жирные кислоты (СЖК).
Аммоний обычно не считают эндогенным регулятором энергетического сопряжения в тилакоидах - он легко теряется в процессе выделения, т.к. нейтратьная форма этого амина, аммиак, свободно диффундирует сквозь клеточные мембраны. Содержание аммония в цитоплазме нативной клетки долгое время считалось малым - несколько мкМ. Однако для поддержания активного синтеза аминокислот концентрация аммония в строме хлоропласта должна быть не менее 100 мкМ, поскольку аммоний является субстратом гшотамин сшпетаз, ключевых ферментов метаболизма азота. Известно, что хлоропласта содержат до 60% глютамин синтетаз листа и значения Км (NHt4) для этих синтетаз находятся в области 0,1 - 0,6 мМ [Пушкин и др., 1983; Husted et ah, 2000; Hill et al., 2002]. Действительно, современные определения концентрация аммония в водной фазе апопласта и в ткани листа дают значения 0,5 - 1,0 мМ [Husted et'al., 2000; Husted et al., 2000; Hill et al., 2002].
В опытах на изолированных тилакоидах выявлены два эффекта аммония: в низких концентрациях (0,2 - 0,4 мМ) он стимулирует синтез АТФ, катализируемый переносом электронов от воды к акцепторам ФСІ [Giersch; 1981; Pick and Weiss, 1988].a в высоких концентра-
циях (1-5 мМ) действует как классический разобщитель, т.е. устраняет трансмембранный градиент рН. Механизмы этих эффектов неясны, но оба они, вероятно, связаны с изменением проводимости мембраны для аммония или Н+. Эти вопросы, насколько нам известно, до сих пор специально не исследовались. Неизвестны так же механизмы влияния СЖК на энергетическое сопряжение в хлоропластах. Показано, что насыщенные СЖК в низких концентрациях могут вызывать «десопряжение», т. е. ингибирование синтеза АТФ без снижения электрохимического градиента Н+ [Pick et al., 1987; Rottenberg, 1990]. Ненасыщенные СЖК такой способностью не обладают, но в высоких концентрациях они могут ннгибировать перенос электронов [Warden and Csatorday, 1987].
В митохондриях аммоний не вызывает разобщения, т.к. в этих органеллах электрохимический градиент Н+ существует, преимущественно, в виде электрического потенциала на внутренней мембране. Насыщенные длишюцепочечные СЖК в низких концентрациях (20 -40мкМ) вызывают «мягкое» разобщение энергетики митохондрий [Rottenberg, 1990]. При этом установлено, что анионы СЖК не способные проникать через мембрану, транспортируются белками: АДФ/АТФ транслокатором и целым семейством специальных разобщающих белков (UCP) [Andreyev etal., 1988; Skulachev, 1991; Skulachev, 1998; Sluse etal., 2006]. Утечка H+ прекращается, когда избыток СЖК катаболизируется в матриксе или окисляется переносчиками электронтраспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий. Предполагается, что это разобщение играет центральную роль в защите органелл от активных форм кислорода, образующихся при торможении транспорта электронов по ЭТЦ в результате исчерпания АДФ [Skulachev, 1991; Skulachev, 1998].
Если эндогенное разобщение играет столь важную роль в энергетике митохондрий, то оно в каком-то виде может существовать и в хлоропластах живых фотосинтезирующих клеток. Наиболее вероятные участники такого разобщения - аммоний и СЖК, поскольку они являются субстратами и продуктами клеточного метаболизма. Эти метаболиты в клетке присутствуют одновременно, но содержание их в цитоплазме непостоянно и зависит от многих факторов, в том числе от света, температуры и возраста растений.
Цель исследования - изучение действия аммония на процессы трансформации энергии в условиях, близких к условиям в растительной клетке, т.е. при том же осмотическом давлении, солевом составе среды и в присутствие СЖК.
Были поставлены следующие задачи:
-
Выяснение особенностей действия аммония в области его низких концентраций (до 0,5 мМ), стимулирующих синтез АТФ и характерных для стромы хлоропласта.
-
Выяснение механизма разобщения высокими концентрациями аммония (1-5 мМ).
-
Исследование совместного действия аммония и СЖК.
4. Поиск ингибиторов и стимуляторов аммонийного разобщения.
Научная новизна работы. Впервые выявлена двухфазность аммонийного эффекта для всех процессов, связанных с градиентом рН - синтеза АТФ, светошідуцированного поглощения Н+ и базального переноса электронов. Первая фаза наблюдается в области низких концентраций аммония (до 0,5 мМ), вторая фаза соответствует классическому разобщению (1-5 мМ). Обе фазы прослеживаются на концентрационных кривых других гидрофильных аминов. Показано, что для индукции каждой фазы необходимо взаимодействие катионов аминов с цеітграми, расположенными на люменальной стороне мембраны. Сродство аммония и катионов имидазола к центрам связывания оказалось высоким и практически одинаковым, в то время как сродство метиламмония было ниже в 8 -10 раз.
С помощью конфокальной микроскопии показано, что осмотические градиенты ионов, возникающие на тилакоидных мембранах при высоких концентрациях аминов, могут вызывать третью фазу разобщения - открытие неспецифических пор, проницаемых для больших молекул флуоресцентного красителя сульфородамина Б. Впервые продемонстрировано, что индукция всех фаз разобщения происходит без заметного набухания тилакоидов.
Найден синергизм действия аминов и пальмитиновой кислоты (ПК) при рН среды 7,8. При понижении рН среды до 6,5 синергичное действие аминов и ПК снижается, но при этом активируется разобщение пальмитиновой кислотой, отсутствующее при рН 7,8.
Научно-практическая значимость. Полученные результаты расширяют и углубляют представления о механизмах регуляции процессов трансформации энергии в фотосинтези-рующей клетке, дают возможность поиска новых эндогенных ингибиторов и активаторов биоэнергетики хлоропластов. Они важны для разработки путей направленной регуляции фотосинтеза. Материалы диссертации могут быть использованы в лекциях и семинарских занятиях по биоэнергетике, биохимии и физиологии растений.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены: на Международной конференции «Фотосинтез в пост-геномную эру: структура и функция фотосистем» (Пушино, 2006); Международной конференции «Преобразование световой энергии в фотосинтезе» (Путино, 2008); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2008,2009 и 2011); на Всероссийской конференции, посвященной 100-летию со дня рождения В.Б. Евстигнеева «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах» (Пущино, 2009); на 11-ой, 12-ой и 13-ой Международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2007,2008 и 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 2 статьи в реферируемых российских журналах.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 120 страницах, иллюстрирована 26 рисунками и 2 таблицами. Список литературы включает 256 цитируемых литературных источников.
