Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы
I. Организация мембран хлоропластов высших растений 9
1. Химический состав мембран хлоропластов 9
2. Гранальные и межгранные тилакоиды 12
3. Формы, состояние и функции пигментов в мембранах 20
4. Две фотосистемы и цепи переноса электронов 25
II. Фракционирование мембран хлоропластов 32
1. Субхлоропластные фрагменты, обогащенные фотосистемой I и фотосистемой II 32
2. Пигмент-белковый комплекс, содержащий реакционный центр фотосистемы I 37
3. Светособирающий пигмент-белковый комплекс 44
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 53
ГЛАВА 3. Исследование организации мембран хлоропластов пшеницы 63
1. Спектральные характеристики, фотохимическая активность и полипептидный состав гранальных и межгранных тилакоидов 63
2. Пигмент-белковые комплексы (состав и спектральные характеристики), выделенные из мембран хлоропластов методом электрофореза на ПААГ 75
ГЛАВА 4. Исследование организации пигмент-белкового комплекса фотосистемы, выделенного на гидроксилапатите из хлоропластов пшеницы 93
1. Спектральные свойства изолированного пигмент-белкового комплекса фотосистемы I
2. Особенности состояния пигментов в пигмент-белковом комплексе фотосистемы I 99
ГЛАВА 5. Изучение организации светособиращего пигмент- белкового комплекса, выделенного на мембран хлоропластов пшеницы 115
1. Спектральные характеристики и полипептидный состав изолированного светособирающего комплекса 116
2. Особенности состояния пигментов в светособи-рающем комплексе 123
Выводы 136
Литература 138
- Формы, состояние и функции пигментов в мембранах
- Пигмент-белковый комплекс, содержащий реакционный центр фотосистемы I
- Пигмент-белковые комплексы (состав и спектральные характеристики), выделенные из мембран хлоропластов методом электрофореза на ПААГ
- Особенности состояния пигментов в пигмент-белковом комплексе фотосистемы I
Введение к работе
Фотосинтетические мембраны хлоропластов являются особым видом биологических мембран, в которых осуществляется превращение световой энергии в химическую, необходимую для образования и запасания органических веществ. Высокая эффективность и строгая последовательность окислительно-восстановительных процессов фотосинтеза достигаются благодаря упорядоченному расположению как целых ансамблей фотосистем в мембране хлоропластов, так и их основных структурно-функциональных компонентов - пигмент-белковых комплексов (ПБК) /Островская, 1975, 1979/. По современным представлениям существуют три вида основных ПБК: комплекс, содержащий РЦ С I (ПБК I); комплекс, содержащий РЦ ФС П (ПБК П); и общий светособи-рающий комплекс (00К) /Ehornber, 1975; Путилова, 1976; Hiller, Goodchild, 1981/. Установлено, что каждый из этих ПБК представляет собой специфическую структуру, которая выполняет определенную функцию в процессе фотосинтеза. Их организация, по-существу, определяет принцип работы фотосинтетического аппарата. Поэтому важной актуальной задачей является расшифровка структурной и молекулярной организации фотосинтетических мембран и пигмент-белковых комплексов. От ее решения зависит выяснение механизмов эффективного функционирования фотосинтетического аппарата, определяющего продуктивность растения в целом.
В настоящее время физиолого-биохимические исследования мембран и пигмент-белковых комплексов ведутся на таких объектах как шпинат, горох, ячмень и др. Такая важная культура как пшеница практически не используется в качестве объекта для указанных исследований. Кроме того, вопросы организации мембран и ПБК недостаточно изучены у высших растений и имеющиеся литературные дан- ные в ряде случаев не полны и порой противоречивы.
Для анализа пигмент-белкового состава мембран хлоропластов широкий размах и успех приобрели методы электрофореза на ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия, особенно, разработанные позднее более мягкие модификации Anderson et al., 1978$ Магішеїі et al ., 1978; Machold et al., 1979/. Однако основной недостаток электрофоретических методик состоит в том, что в ходе электрофореза в присутствии жесткого анионного детергента додецилсульфата натрия и диссоциирующего действия электрофоретического поля нарушаются нативные состояния пигментов и уменьшается фотохимическая активность изолированных Хл-белков. Для изучения особенностей организации ЇЇБК наиболее перспективными являются методы колоночной хроматографии в присутствии сравнительно мягкого детергента тритона Х-100, которые позволяют выделять комплексы в относительно нативном состоянии.
Данная работа посвящена исследованию структурной и молекулярной организации мембран и пигмент-белковых комплексов хлоропластов пшеницы. При этом решались следующие задачи: I) провести сравнительные спектральные исследования и анализ полипептидного состава разных типов мембран (гранальных и межгранных тилакоидов) у хлоропластов пшеницы (разные сорта); 2) определить состав их Хл-белковых комплексов и изучить спектральные свойства изолированных комплексов; 3) выделить ПБК I и ОСК в состоянии, по возможности близком к нативному и изучить их спектральные свойства и фотохимическую активность (для ПБК I); 4) выяснить природу сил, стабилизирующих структуру выделенных комплексов.
В результате проведенной работы впервые в сравнительном плане проанализированы физиолого-биохимические и спектральные характеристики мембран гранальных и межгранных тилакоидов у разных сортов пшеницы, отличающихся по продуктивности. Показано, что фотосинтетический аппарат изученных сортов весьма близок по полипептидному составу мембран, составу ПБК и спектральным свойствам Хл. Установлено, что только в гранах присутствует полипептид с молекулярной массой 48000 дальтон (который входит в состав РЦ ФС П) и соответствующий комплекс $0 П. Мекгранные тилакоиды содержат преимущественно комплекс ФС I. Впервые показано для тилакоидов гран наличие шести пигмент-белковых комплексов, а для тилакоидов стромы - четыре.
Установлено, что при нарушении состояния антенных форм Хл у ПБК I, реакционные центры П700 в значительной мере сохраняют свою активность (75-80$). Выдвинуто предположение, что П700 локализован внутри комплекса, а антенные формы Хл - на его периферии. Подтверждено предположение, что длинноволновая флуоресценция (< 715-720) у ПБК I обусловлена присутствием антенных форм Хл в на-тивном состоянии, а не свечением П700.
Установлено, что в состав ССК входят три полипептида с молекулярной массой 24800, 24300 и 23500 дальтон. Для нативного ССК наряду с известными четырьмя формами Хл, характерны форма Хл а при 684-685 нм и две полосы флуоресценции: 680-685 и 695 нм. Показано, что форма Хл а 684-685 и соответствующая ей полоса флуоресценции при 695 нм образуется при контакте светособирающих комплексов друг с другом и могут обратимо разрушаться при обработке комплекса детергентами. Выдвинуто предположение, что молекулы Хл а расположены на поверхности, а Хл б - внутри белковых субъединиц и, что в стабилизации структуры комплекса основную роль игра-юг гидрофобные взаимодействия.
Теоретическая значимость данной работы состоит в том, что полученные результаты значительно расширяют и углубляют наши знания как в отношении организации мембран хлоропласгов в целом, так и в отношении организации пигмент-белковых комплексов. Выявление физиолого-биохимических и структурных особенностей фотосинтетических мембран хлоропластов у сортов пшеницы, различающихся по своей продуктивности, может служить ценной информацией в решении проблемы повышения продуктивности растений.
Работа выполнена в лабораториях физиологии растений Института земледелия МСХ Азерб.ООР и молекулярной организации и биогенеза фотосинтетического аппарата Института почвоведения и фотосинтеза АН ОСОР.
Формы, состояние и функции пигментов в мембранах
На вопрос о состоянии хлорофилла или его аналогов у фотосин-тезирующих организмов пытались ответить еще в начале этого века. Среди них можно отметить работы Любименко /1921/, который полагал, что пигменты адсорбционно или химически связаны с белком в живых клетках. Это подтверждается Осиповой /1957/ на хлоропластах растений, подвергавшихся действию трипсина при 37С. После частичного переваривания белка этим ферментом процент свободного хлорофилла, извлекаемого неполярными растворителями значительно повышался.
Работы Годнева с сотр. /I960/ по изучению спектров поглощения живых листьев при их нагревании показали, что при температуре 50-55С, которая не нарушает структуру белка, изменений в спектре поглощения листа не наблюдается. Однако при повышении температуры в области денатурации белка, происходит смещение максимума поглощения в коротковолновую область спектра. Авторы объяснили это явление нарушением связи Хл с белком при денатурации последнего.
Для того, чтобы понять природу и свойства хлорофилла - основного пигмента живых клеток, большое значение имеет исследование биосинтеза пигментов, составляющих фотосинтетический аппарат. Известно, что Хл б образуется в растениях несколько позднее из Хл a /Argyroudi-Akoyunoglou et al., 1976/. Шлык, Фрадкин и их сотр. /Шлык, 1965, 1972; Фрадкин и др., 1966/ установили, что Хл б образуется из вновь образованных, лабильных молекул Хл а, которые в темноте при действии специального фермента превращаются в молекулы Хл б. Этими же авторами предложена гипотеза центров биосинтеза пигментов /Shlyk et aL , 1973; Фрадкин, 1982/, которая весь комплекс процессов биосинтеза Хл осуществляется в этих центрах и регулируется единой полиферментной системой, названной хло-рофилл-синтетаза, и структурно организованной в центрах биосинтеза пигментов.
Уже в первых работах по изучению спектральных характеристик гомогенатов зеленеющих листьев Красновский и сотр. /1953/ обнаружили, что при накоплении пигментов происходит постепенный сдвиг максимума поглощения в длинноволновую сторону. Несколько позднее Литвин и др. /1958/ обнаружили увеличение длинноволнового максимума при 730 нм, вызванное накоплением агрегированных форм Хл. Сходные результаты были получены в работах Фрадкина с сотр. /1970, I974;Fradkin et al ., 1972/.
По результатам ряда авторов /Гиллер и др., 1972; Насыров и др., 1974/ в построении пигментной системы основную роль играют белки и липопротеиды мембран, которые служат матрицей нативным формам Хл. Авторы предполагают, что в комплексе с определенными белками-компонентами ЭТЦ фотосинтеза агрегированные пигменты образуют ФС I и ФС П.
Следует отметить, что в живой клетке пигменты находятся в ином состоянии, чем в растворе. Об этом свидетельствуют смещения максимумов поглощения пигментов при экстракции их из листьев органическими растворителями. Если в интактном листе максимум поглощения Хл а располагается около 678-680 нм, то в ацетоновом -при 663 нм, а в этиловом эфире - 660 нм /Красновский, 1974/.
Как видно из приведенных выше данных, в настоящее время не подлежит сомнению, что пигменты связаны с белково-липидными структурами мембран. Тогда возникает вопрос о природе связи агрегированных форм пигментов с этими структурами. В связи с этим Ерохин с сотр. /1970а; 19706/, чтобы выяснить как влияет нарушение структуры белков и липидов на спектральные свойства пигментов, воздействовали на хроматофори фотосинтезирующих бактерий протео-литическими ферментами. Оказалось, что ферменты такого типа (про-наза и др.) приводят к нарушению наиболее длинноволновых форм пигментов (870-890 нм). Эти эффекты были объяснены авторами как изменения пигментного взаимодействия при конформационных перестройках белково-липидных структур.
Дальнейшие изучения советскими и зарубежными учеными натив-ного состояния пигментов в хлоропластах с применением высокочувствительных низкотемпературных спектральных методов, привели к установлению существования нескольких нативных форм Хл.
Благодаря исследованиям Красновского с соавт. /1959, 1972/ впервые было обнаружено присутствие в хлоропластах различных форм Хл а.
Браун /Brown, 1972/, используя метод дифференциальной спек-трофотометрии, обнаружила у эвглены in vivo сложную структуру красной полосы поглощения Хл. Автор выделила три формы Хл а, различающиеся по положению максимума поглощения - 670, 683 и 695 нм. Эти работы имели важное значение, так как оказалось, что различные формы Хл а 670 и 683 нм функционально отличаются, участвуя в поглощении энергии в составе первой или второй пигментных систем.
Френч и его коллеги /French et al ., 1972/ регистрируя низкотемпературные спектры поглощения (-196С) с последующим анализом кривых, наблюдали значительно большее число форм Хл а. При исследовании водорослей и высших растений выделены две формы Хл б (640 и 650) и четыре формы Хл а (662, 670, 677, 687 нм), которые обнаруживались у всех исследуемых объектов. Форма Хл а 662 по мнению авторов, представляет собой свободные от белка пигменты. Фракция хлоропластов, обогащенная ФС I, содержала относительно больше Хл а 684 и длинноволновых пигментов, в то время как фракция обогащенная ФС П - относительно больше Хл а 670 и Хл б 650.
Пигмент-белковый комплекс, содержащий реакционный центр фотосистемы I
Первым Кок и его коллеги /Кок, 1957; Кок, Gott, I960/ указали на существование в хлоропластах РЦ ФО I. Изучая дифференциальные спектры, авторы обнаружили, что в фотосинтезирующих организмах есть пигмент с полосой поглощения около 700 нм (П700), который выцветает при освещении суспензии хлоропластов дальним красным светом. Такие же изменения регистрировали в присутствии экзогенных доноров и акцепторов электрона. Это подтвердило окислительно-восстановительный характер превращений П700 в in vivo . По данным авторов общее количество Хл в 400-500 раз превышало количество П700 в исходных хлоропластах.
Как известно, одной из первых и самых распространенных методик выделения Хл-белков явилась обработка мембран ДОН с последующим электрофорезом солюбилизированного материала в ПААГ в присутствии детергентов.
В 1966 г. Огава и соавт. /Ogava et al., 1966/, впервые солюби-лизировав хлоропласты шпината с помощью анионного детергента ДОН, проводили электрофорез на ПААГ и при этом обнаружили на электрофо-реграмме три зеленые зоны, названные OP I, GP П и FP. На основании анализа состава, первые две зоны (от старта) были названы пигмент-белковым комплексом, а последняя - свободные от белка солюбилизи-рованные пигменты. 25% Хл было накоплено в комплексе I, а 50$ -в комплексе П.
Более подробное исследование комплексов I и П, а также разработка методов их выделения принадлежат Торнберу с сотр. /liiornber et al . , 1967 j Thornber, 1969; Tliornber, Highkin, 1974; Thornber, 1975/. В работе /Thomber et al., 1967/ использован додецилбен-зенсульфанат натрия (ДБСН) и после электрофореза солюбилизирован-ного материала тоже обнаружили две пигмент-белковые зоны. Однако они были фотохимически неактивны в реакции Хилла и по восстановлению НАД+ от ДХФИФ . Обнаружено и значительное различие по аминокислотному составу комплексов. Около 70$ всех аминокислотных остатков, входящих в срстав белка комплексов ФС I, составляли неполярные аминокислоты.
В дальнейшем авторы /Thomber, 1969/, уделяя основное внимание на ПБК $0 I, подробно исследовали некоторые свойства этих комплексов из сине-зеленых водорослей и высших растений. Было установлено, что все исследованные фотосинтезирующие организмы имеют похожий класс белков, которые связаны с пигментной системой и составлены из четырех идентичных пигмент-белковых субъединиц с ММ 33000-35000 д. По данным автора, в составе каждой субъединицы наряду с гидрофобным белком присутствует 5 молекул хлорофилла, каротиноиды, ли-пиды и хиноны.
Выше описанные комплексы ОР I и ОР П удавалось разделить только методом электрофореза в ПААГ в присутствии ДОН или ДБСН. Однако недостатком изолирования ПЕК с помощью указанных анионных детергентов, явилось отсутствие фотохимической активности препаратов. В связи с этим Канг и Торнберу /Kung, Thornber, 1971/, которые применили хроматографию на гидроксилапатите, удалось изолировать фотохимически активный комплекс ФО I.
Одновременно Торн бер и Хайкин /ШюгпЪег, Highkin, 197 V, сравнивая состав и свойства GP I, выделенного из сине-зеленых водорослей и высших растений, пришли к заключению, что использованные ранее анионные детергенты ДОН и ДБОН неприменимы для изолирования хлорофилл-белкового комплекса из высших растений. По мнению авторов, это объясняется низким содержанием цистеина у белков ламелл хлоропластов высших растений, которые играют важную роль в стабилизации третичной структуры белков с помощью дисульфидных связей. В результате действия ионных детергентов вызывается нарушение структуры комплекса. Это сопровождается смещением красного максимума поглощения Хл в сторону коротких длин волн, исчезновением сигнала П700 и феофитинизацией комплекса.
Таким образом, низкая фотохимическая активность и отсутствие длинноволновых полос поглощения Хл а у изолированных Хл-белков заставляла исследователей разрабатывать новые методы для их выделения.
В 1974 г. вышла работа Шиозава и его коллег /Shiozava et al, 197V, в которой описывается выделение фотоактивного комплекса $0 I (названного ими П700-Хл а-белок), обогащенного П700, из хлоропластов табака, кукурузы и ряда бобовых растений. Ламеллы инкубировали тритоном Х-100 (отношение тритонДл = 75/1, мг/мг) в течение 15 мин при 40, а затем центрифугировали 10 мин при 27000 g для удаления крахмала и нерастворимых пигментов. Зеленый суперна-тант наносили на колонку с гидроксилапатитом и ступенчатой элюци-ей с помощью 0,2 М натрий-фосфатного буфера (рН 7,0) изолировали препараты $0 I, обогащенные ІГ700. По данным авторов, комплекс имел красный максимум поглощения Хл при 677 нм и содержал основные спектральные формы Хл а: 662, 669, 677 и 686 нм. Отношение Хл/ Р700 у изолированного комплекса составляло 40-45/1. Он содержал только Хл а и/3-каротин (полоса около 490 нм). По результатам сравнительного анализа, проведенного авторами, спектральные свойства и пигментный состав комплексов ФО I из высших растений совпадали с таковыми для комплексов, выделенных из сине-зеленых водорослей. Однако комплексы из высших растений содержали цитохро-мы f и Вб» Подвергая электрофорезу на ПААГ в присутствии ДОН изолированного ими П700-Хл а-белка, авторы установили, что при обработке ДОН, спектральные свойства комплекса изменяются таким образом, что полностью совпадают со свойствами ОР I. По мнению авторов, обнаруженный ими факт убедительно доказывает, что СР I представляет собой измененную форму нативного ПБК ФО I.
Успехи по выделению чистых комплексов РЦ из бактерий, не содержащих светособирающего пигмента привлекли внимание многих исследователей и было предпринято ряд попыток выделить аналогичные комплексы из высших растений и водорослей.
Пигмент-белковые комплексы (состав и спектральные характеристики), выделенные из мембран хлоропластов методом электрофореза на ПААГ
В 1966 г. Огава и другие /Ogava et al ., 1966/ впервые сообщили о выделении двух пигмент-белковых комплексов из хлоропласгов шпината, обработанных ДСН, методом электрофореза в ПААГ. Изучая характеристики изолированных ПБК, авторы отнесли комплексы большой электрофоретической подвижности и соотношением Хл а/б = 1,9 к ПБК $0 П (или СР П).
В изолировании и изучении данного типа Хл-белков много сделали Торнбер и его группа. По данным этих исследователей /тьогпЪег et al ., 1967а, 19676; Kung, Thornber, 1971/ в состав GP П входят Хл а, Хл б и каротиноиды связанные с белками. Молекулярные субъединицы такого комплекса равнялись 30000-35000 д, а отношение Хл а/Хл б = I. Он составлял около 40-60$ всего Хл мембран. Спектр поглощения СР П характеризовался 2 основными полосами при 672 нм (Хл а) и 653 нм (Хл б) и полосой Соре около 437 (Хл а) и 470 нм (Хл б).
Таким образом, до 1974 г. выявленную на электрофореграмме 2-ю зону отнесли к Хл-белку ФС П, и некоторые исследователи пытались даже обнаружить в нем фотохимические реакции, характерные для ФС П.
Однако в 1974 г., сопоставляя результаты своих исследований с данными других авторов по хлорофилл-белковым комплексам фото-синтезирующих мембран, Торнбер и Хайкин /ШюгдЪег, Higftkin , 1974/ пересмотрели свою прежнюю точку зрения на функциональную роль этих комплексов в in vivo. Солюбилизировав ламеллы хлоро-пластов дикого ячменя и мутанта без Хл б, и проведя электрофорез на ПААГ с ДСН, авторы обнаружили, что у мутанта, лишенного Хл б, на электрофореграмме отсутствует Хл-белок ФС П. Специальными экспериментами показано, что мутанты без Хл б способны к автотрофному росту и реакции Хилла. Следовательно, указанный Хл-белок не может рассматриваться как комплекс ФС П. В соответствии с функцией данного комплекса Торнбер и Хайкин предложили переименовать СР П в "светособирающий Хл а/б-белковый комплекс". Авторы пришли к выводу, что главная роль этого комплекса в мембране заключается в улавливании световой энергии и передаче ее к реакционным центрам ФС I и ФС П. Вместе с тем, авторы не исключают возможность того, что светособирающий Хл/б-белок может участвовать в организации фотосинтетических ламелл хлоропластов высших растений и зеленых водорослей, поддерживая их контакт друг с другом.
Впоследствии кроме двух основных ПБК (П700 Хл а-белок, СР I; светособирающий Хл а/б-белок, СР П) были выявлены и другие комплексы. Исследователи пытались выяснить природу новых обнаруженных комплексов и их точное количество в фотосинтетической мембране.
Так, Реми и соавт. /Еешу et al ., 1977/ при мягких условиях (уменьшение концентрации детергента) в процессе электрофореза, обнаружили еще один тип комплекса, названного ими СР Па. Он имел меньшую электрофоретическую подвижность по сравнению с уже известным комплексом СР П и располагался выше него. СР Па обладал ММ около 70 кД. С целью выяснения природы 2-го комплекса СР Па авторы проводили спектральные анализы этих двух комплексов. Установлено, что содержание и формы Хл а в указанных комплексах различны. В СР П красный максимум поглощения располагался при 672 нм, а отношение Хл аДл б = 1,15, а в СР Па - при 674 нм и отношение Хл а/Хл б = 1,25. При повторном электрофорезе СР Па диссоциировал на комплексы с ММ 30-35 кД. Таким образом, авторы, опираясь на полученные данные, предположили, что GP Па является димером ранее известного светособирающего Хл а/б-белка СР П.
Аналогичные результаты были получены Махольдом с соавт. /Ма -chold, Meister;I979/ при электрофорезе тилакоидов из Vicia faba. Сделано заключение, что ранее выявленная на электрофореграмме одна зона ОР П является гетерогенной. Она представляет собой смесь различных пигмент-содеркащих белков, отличающихся спектральными свойствами и полипептидным составом.
Вслед за этими работами, появились и другие публикации, где сообщалось о новых комплексах: тримерах и олигомерах светособирающего Хл а/б-белка GP П. Некоторым исследователям удалось выделить из различных видов высших растений четыре /Markwell et al., 1978/, пять /Henriques , Park, 1978a, 19786/ и даже шесть /Anderson et al ., 1978; Anderson, 1980/ Хл-белков, три из которых во всех случаях являлись светособирающими Хл а/б-белками. Все эти комплексы, полученные разными авторами, обладали близкими спектральными характеристиками.
В работах /Anderson et al ., 197 8 j Anderson, 1980/ авторы подвергали подробному биохимическому и спектральному анализам вы- деленные ими Хл а/б-белки. Установлено, что LHOP , LHCP и LHCP имеют аналогичные спектральные характеристики. В спектре поглощения основной максимум Хл а располагался при 672 нм и заметное плечо около 652 нм, характерное для Хл б. Отношение Хл а/ Хл б в комплексах варьировал от 1,09 (LHCP ) до 1,28 (LHCP ) и вместе содержали около 52-58$ общего Хл мембран. Низкотемпературные спектры флуоресценции характеризовались одной интенсивной коротковолновой полосой около 680-682 нм. По мнению авторов, ЬНСР и LHGP являются олигомерами ранее известного светособира ющего Хл а/б-белка ОР П (ьНСР3).
По данным Хенрикс и Парка /Eenriques , Park, 19786/ обнаруженные ими дополнительные зоны светособирающих Хл а/б-белков (Па и Пб) у некоторых видов высших растений (леттук, табак, ячмень, шпинат, фасоль и т.д.) составляют, вероятно, большие агрегаты СР П. Авторы пытались выяснить природу этих комплексов и их отношение к организации нативной фотосинтетической мембраны. По интерпретации этих авторов, описанные комплексы образуются в результате гидрофобного взаимодействия отдельных компонентов агрегатов нативного GCK, который находится в мембране in vivo и не успевает диссоциировать до мономеров при мягкой обработке мембраны детергентами. Авторы пришли к заключению, что зоны Па и Пб являются олигомерами (точнее димерами и тримерами) светособирающего Хл а/б-белка СР П и тем самым, подтвердили мнение Реми и его коллег, а также Андерсона с соавт.
Особенности состояния пигментов в пигмент-белковом комплексе фотосистемы I
Семена орали из экспериментальной базы Азербайджанского научно-исследовательского Института земледелия (АзНИИЗ).
Объектами исследований служили сорта пшеницы различного происхождения, резко отличающиеся по высоте стебля и продуктивности растений: твердые (Тг.durum Desf .) озимые Овиачик-65 интенсивного типа? Шарк полуинтенсивного и Севиндж экстенсивного типов; мягкая (Тг. aestivum L .) озимая Кавказ интенсивного типа, а также пшеница дикого типа (Tr. araraticum ).
Сорт Овиачик-65 выведен в Мексике. Относится к короткосте-бельной группе (полукарликовый). Разновидность мелянопус (melano-pus ). Соломина - прочная, устойчивая к полеганию /Пруцкова, 1976/.
Сорт Шарк выведен в АзНИИЗ. Относится к среднестебельной группе. Разновидность леукурум (leucurum ). Соломина средней высоты, относительно устойчивая к полеганию /Бляхерова и др., 1973/ - является гибридом от скрещивания сортов Апиликум 82/1 х Хоран-ка (пшеница палестинского происхождения). Самый распространенный сорт в СССР среди сортов озимой твердой пшеницы /Самсонов, 1967/.
Сорт Севиндж выведен в АзНИИЗ. Относится к высокостебельной группе пшеницы. Разновидность гордеиформе (hordeiforme nost ). Соломина - длинная, непрочная, неустойчивая к полеганию; гибрид от скрещивания Абиссинского тургидум из коллекции ВИР х Гордеиформе местная /Самсонов, 1967/.
Сорт Кавказ выведен в Краснодарском научно-исследовательском институте сельского хозяйства. Относится к среднестебельной группе. Разновидность лютесценс (v . lutescens Al ). Соломина - не высокая, прочная, устойчивая к полеганию /Пруцкова, 1976/. Получен от скрещивания линии Лютесценс 314 h 147 (Нейцюхт из ГДР х Безостая-4) с пшеницей Безостая-1 /Пруцкова, 1976/.
Все твердые пшеницы тетраплоидные с 28 хромосомами в соматических клетках. Мягкие пшеницы - гексаплоидные с 42 хромосомами в соматических клетках. Дикий тип пшеницы является тетраплоидным с 28 хромосомами в соматических клетках /Пруцкова, 1976/,
В опытах использовали 10-12-дневные проростки пшеницы. Растения выращивали в оранжерее на вермикулите при освещенности 12000 лк. Листья измельчали на гомогенизаторе MPw -324 (Польша) в среде для выделения хлоропластов, при температуре 4С. Хлоропласты выделяли по методике как описано в работе /Шутилова, 1976/, в среде, содержащей 0,4 М сахарозу, 20 мМ трис-НСі буфер (рН 7,8), 5мМ аскорбат натрия, I мМ ЭДТА и 0,1$ полиэтиленгликоль (с ММ 40000). Измельченный материал отфильтровывали через специальную ткань. Суспензию хлоропластов центрифугировали при 1000 g 10 мин и осадок хлоропластов гомогенизировали в небольшом объеме среды выделения.
Тилакоидн гран и стромы разделяли обработкой хлоропластов ди-гитонином (отношение дигитонин/Хл=3/1, мг/мг) по методике Островской /1972, 1975/. Хлоропласты инкубировали в 0,3 -ном растворе дигитонина в течение 20 мин на холоде (0-4С), затем обработанный материал подвергали дифференциальному центрифугированию по схеме: 7 мин при 1000 gj 20 мин при 20000 gj 30 мин при 70000 g и 60 мин при 144000 g. Фракция 20000 g, называемая авторами "тяжелой", на основании спектральных, фотохимических и биохимических анализов установлено, что представляет собой фрагменты тилакоидов гран, которые содержат обе фотосистемы (ФО I и ФС II), а фракция 144000 s называемая "легкой", содержит преимущественно фрагменты тилакои-дов стромы, обогащенными ФС I.
Разделенные мембраны тилакоидов гран и стромы были исходными материалами для дальнейшего исследования и выделения из них пигмент-белковых комплексов.
Для изолирования ПБК с реакционным центром ІГ700 С I, мы использовали методику, предложенную Шиозава и сотр. /Shiozawa et al., 1974/, с незначительными модификациями. Тилакоиды гран со-любилизировали в среде, содержащей 3,3$ тритона Х-ЮО, 0,5 М сахарозу и 5 мМ трис-НСі , рН 8,0. Отношение детергентДл=50/1 (мг/мг). Время обработки 30 мин, температура 0-40. После удаления крахмала (осадок при центрифугировании 14000 g), зеленый су-пернатант-смесь комплексов, разбавляли с 5 мМ трис-НСЦ буфером (рН 8,0), чтобы получить конечную концетрацию Хл 0,5 мг/мл. Оолю-билизированный материал наслаивали на колонку (ЗхЮ см), заполненную гранулированным гидроксилапатитом и предварительно уравновешенный с 10 мМ натрий-фосфатным буфером (НФБ), рН 7,0. Колонку сначала промывали с уравновешивающим буфером для удаления со-любилизированного и не адсорбировавшего хлорофилла? процедуру продолжали до обесцвечивания элюата. Затем промывали с 1$ тритоном Х-ЮО в 50 мМ трис-НСі буфере рН 8,0, объемом в 3 раза превышающий объем адсорбированного на колонке исходного материала. Затем следовала промывка 10 мМ Ш?Б, содержащую П700-фракцию элю-ировали с помощью 0,2 М НФБ (рН 7,0). К последнему элюирующему раствору добавляли тритон Х-ЮО до концентрации 0,01$ для улучшения элюирования и увеличения выхода комплекса. Процесс элюции продолжался до обесцвечивания элюата. Для удаления детергента раствор комплекса подвергали диализу в течении ночи на холоде (4С) против 100-кратного объема 5 мМ трис-НСІ буфера, рН 8,0. Синтез гранулированного гидроксилапатита осуществляли по /Ма-зин, Сулимова, 1975/.
