Фотосинтетическая мембрана, представляющая собой высоко -специализированную биологическую структуру, играет централь -ную роль в осуществлении превращения энергии поглощенных квантов света в энергию химических связей. Исследование формирования фотосинтетического аппарата является одной из актуальных проблем современной физиологии растений. Основные закономерности пигментных превращений, происходящих в процессе зеленения этиолированных растений, детально исследованы и составили основу фундаментальных знаний о процессе хлорофиллообразования (Годнев,1926-1963; Красновский,1952,1973; Шлык,1965-1982; Калер,І97І-І976; Литвин,1975,1978; Smith ,1960; Granick , 1967; Bogorad ,1976). Гораздо менее изучена роль белков этио-пластов в формировании мембранной системы фотосинтетического аппарата (Осипова, 1960,1975; Ellis ,1977,1981; Kirk ,1967, 1975). Так, пока не удалось получить однозначного ответа на вопрос, происходит ли сборка хлоропластных тилакоидов только на базе готовых белковых компонентов мембран этиопластов ( Duranton ,1964; Baquet ,1968; Collot ,1970) или для этого необходим и сопряженный с хлорофиллообразованием синтез качественно НОВЫХ белКОВ ( Eytan, Ohad ,1972; НооЪег, Stegeman , 1976; Oelze et al. ,1970; Ohad ,1975; Takemoto, Lascelles , 1973).
Проводимые в течение последних 10 лет исследования показали, что весь хлорофилл тилакоидной мембраны связан с белком, образуя так называемые пигмент-белковые комплексы, которые содержат Главные внутренние беЛКИ ТИЛаКОИДНОЙ мембраны ( Anderson et al. ,1978; Boardraan et al. ,I978;Markwell et al. ,
I979;Siefermann-Harms, Ninnemann ,1979; ФрадкиН,І982). К настоящему времени все более успешными оказываются попытки выделить из хлоропласта нативные хлорофилл-белковые комплексы, которые несут полную фотосинтетическую нагрузку (Борисов, Ильина, 1969; Гамаюнова и др.,1975; Ерохин и др.,1974а, 19746;Фрад~ КИН И др.,1978; Щутилова И др.,1976; Vernon et al.,1966; Wessela,1969; Anderson, 1975; Machold et al., 1979 ).
Хотя на сегодняшний день существуют исчерпывающие доказа -тельства, что хлорофилл-белковые комплексы, выделяемые из ти -лакоидной мембраны при экстракции детергентами, не являются результатом неспецифической ассоциации хлорофилла и тилакоид -НИХ белков (Anderson, 1975; Thornber, 1975 ), вопрос О TOM, насколько точно отражают выделенные комплексы организацию хлорофилла in vivo остается открытым. Его решение зависит в значительной мере от совершенствования методов выделения и очистки пигмент-белковых комплексов из тилакоидной мембраны.
Существующие в настоящее время способы разборки мембраны на функционально активные компоненты позволяют выделить в более или менее чистом виде три основных пигмент-белковых комплекса: пигмент-белковый комплекс I, обладающий свойствами фотосистемы I, пигмент-белковый комплекс П, обладающий актив -ностью фотосистемы П, и светособирающий комплекс, который является одним из наиболее важных у высших растений и водорослей.
Кодируемый В ЯДРЄ ( Kung et al. ,1972; Gillham et al. ,
1978) И синтезируемый В ВДТОПЛаЗМе ( Machold, Aurich ,1972)
белок этого комплекса поступает внутрь хлоропласта в форме предшественника ( Apei, Kioppstech ,1978; Bennet ,1979; Schmid et al. ,1981) и встраивается в фотосинтетическую
Мембрану, ГДЄ ПРОИСХОДИТ аССОЦИаЦИЯ еГО С ХЛОрофИЛЛОМ (Schmidt
et al. ,1980? wickner ,1980), после чего он приобретает способность поглощать энергию света и передавать ее реакционным центрам, обеспечивая тем самым эффективное протекание световой стадии фотосинтеза. Если к этим свойствам светособирающего комплекса добавить его участие в контроле стэкияга тилакоидяых мембран в граны ( Mullet,Arntzen,1980 ) и подверженность фос-форилированию ( Bennet, 1979 ), то становится очевидным интерес к нему исследователей фотосинтеза.
Известно, что сами хлорофилл-протеиновые комплексы отсутствуют в этиопласте, поскольку синтез хлорофиллида из протохло-рофиллида в отсутствие света у высших растений не происходит. Однако неясно, присутствуют ли в этиопласте полипептиды, характерные для будущих хлорофилл-белковых комплексов хлоропластов. Некоторые авторы считают, что большинство ( Ohad et ai.,1967, a,b;1969; Ohad,1975;Hoober et al.,1970) ИЛИ Некоторые (Eutan
Ohad,1972;Cobb,Wellburn, 1974,1976) ИЗ мембранных белков СИН-тезируются в процессе зеленения этиопласта. Существует также мнение, что все или большинство полипептидов, включая и полипептиды хлорофилл-белковых комплексов, уже присутствуют в этиопласте ( Argyroudi-Akoyunogloy, Akoyunogloy,1973; Remy, 1973; Lutz, 1975).
Высказывалось предположение, что хлорофилл синтезируется одновременно с белком носителем ( Bar-Nun, 1977 ),' а ассоциация полипептида с хлорофиллом может осуществлятсся до их внедрения в развивающуюся мембрану или в процессе ее окончательной сборки. Особо следует подчеркнуть данные о том, что сборка светособирающего комплекса, который сам по себе не требуется для осущес-
твления активности обеих фотосистем, включает синтез уникального ПОЛИПеПТИДа, ПРОИСХОДЯЩИЙ ТОЛЬКО На Свету ( Bar-Nun,1977).
Целью настоящей работы явилось изучение роли белков внутренних мембран этиопластов в процессе биогенеза пигмент-белковых комплексов, являющихся главными компонентами мембранной системы фотосиятетического аппарата.' Для этого предпринято сравнительное исследование мембран этиопластов и хлоропластов с привлечением методов, позволяющих судить о сходстве белкового состава обоих типов мембран и возникновении новых белковых компонентов в процессе биогенеза: различных способов разборки мембранного материала (дифференциальное центрифугирование, обработка детергентами, электрофорез, гель-фильтрация), изотопных и ишунохимических методов. Основные задачи работы заключались в следующем: I) исследовать антигенный состав мембран этиопластов и хлоропластов и проследить за его изменением в процессе зеленения; 2) используя различные способы разборки, разделить мембранный материал обоих типов пластид на пигмент-белковые комплексы, отражающие разный уровень организации мембран; провести сравнение мембран хлоропластов, а также выделенных из них главных пигмент-белковых комплексов с материалом этиолированных мембран; 4) исследовать роль главного компонента этиопластных мембран - лротохлорофиллид-голохрома в биогенезе фотосинтетической мембраны.
І. СТРУКТУРА ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ И ЕЕ
БИОГЕНЕЗ І.І; Организация хлоропластных мембран
Известно, что весь пигментный аппарат хлоропластов, осуществляющий первичные фотохимические превращения, связан с внутренними мембранами органеллы, которые представляют единую систему состыкованных в граны и одиночных тилакоидов /Силаева,1978
Главными компонентами хлоропластных мембран являются липи-ды, белки и углеводы. Основу структурной организации мембран создают липиды, содержание которых составляет до 50$ от общего количества хлоропластного мембранного материала. Нейтральные липиды хлоропластных мембран представлены главным образом га-лактолипидами (моногалактозилдиацилглицеридами и дигалактозил-диацилглицеридами), а анионные липиды - оульфолипидами и фосфо-липидами (фосфатидилглицеридами, фосфатидилхолинами, фосфати-дилэтаноламинами и фосфатидиловой кислотой). Специфическими липидными компонентами хлоропластных мембран являются хлорофилловые пигменты (до 20$) и пластохияоны. Около 20$ липидов хлоропластов ПОКа НЄ Идентифицировано (Anderson, 1975).
Основная масса липидов в любой биологической мембране участвует в образовании бислоя, в котором неполярные углеводородные группы, не контактирующие с водной средой, создают гидрофобную зону внутри мембраны, а полярные группы - поверхностные гидрофильные области. Липидный матрикс хлоропластных мембран формируется главным образом галактолипидами, его химической структурой обусловлена текучесть и подвижность мембран и обеспечены условия для динамического межмолекулярного взаимодействия, необходимого для осуществления функциональных процессов.
Особенности мембран во многом определяют и ионные липиды, особенно фосфолипиды, которые могут группироваться в мицеллы, способны формировать жидкие кристаллы, обладающие текучестью и вязкостью, благодаря чему в мембране возможно чередование областей с жестким и жидким состоянием липидов. Наличие полярных липидов обеспечивает стабилизацию мембраны не только за счет гидрофобных, но и электростатических взаимодействий (Siekevitz ,1972; Arntzen ,1978; Anderson ,1975; Чернав-ская, Чернавский,1977).
Белки составляют около 50$ содержимого хлоропластных мем -бран. Их долгое время делили на функциональные и структурные. Постепенно понятие структурный белок потеряло первоначальный смысл. В настоящее время белки делят на периферические (внешние) и интегральные (внутренние). Первые связаны с мембраной слабыми нековалентными взаимодействиями, легко отделяются от нее гипотоническими растворами, мягкими детергентами и ультризвуком. По свойствам они родственны растворимым белкам пластид, наличие гидрофобных участков способствует их ориентации в вод-но-липидной фазе. Интегральные белки чаще всего глобулярные с гидрофильным и гидрофобным концами, что позволяет им внедряться в гидрофобную зону липидного матрикса таким образом, что гидрофильная часть белковой глобулы остается на поверхности и осуществляет контакт с водной средой. Степень погруженности интегрального белка в неполярную толщу мембраны зависит от степени гидрофобности его молекулы. Для солюбшшзации этих белков требуется воздействие веществ, способных разрушить гидро -фобные взаимодействия, например, детергентов.
В структурной и функциональной организации мембран особое
значение имеет взаимосвязь белков и липидов, их ориентация, а также организация их комплексов.
К хлоропластной мембране в значительной степени могут быть отнесены основные принципы организации любой биологической мембраны. Существование общих принципов в структуре мембраны позволило Даниэлю и Даусону в 1935 г. предложить универсальную модель, которая сыграла важную роль в развитии представлений об организации мембраны. Согласно этой унитарной гипотезе, основу мембраны создает билипидный слой, окруженный по краям двумя белковыми слоями.
В настоящее время наиболее обоснованными экспериментально выглядят динамичные модели, из разнообразия которых можно выделить субъединичные, жидко-мозаичные и жидко-мозаичные с твердой основой.
Согласно субъединичной модели, мембраны строятся из повторяющихся протомерных единиц, формирующих решетку. Жидко-моза -ичная модель предполагает, что белковые молекулы в виде разнообразных глобул полностью или частично погружены в вязкий ЛИ ? пидный матрикс, так что углеводородные хвосты липидов и непо -лярные аминокислотные остатки белков образуют внутреннюю среду, не контактируюушую с водной фазой, а периферические белки при -креплены к поверхности мембраны с помощью электростатических сил. Внутренние белки могут в некоторых случаях пронизывать мембрану и образовывать агрегаты, между которыми остаются узкие пространства, заполненные либо гидрофильной, либо гидрофобной средой. Гидрофобная среда метаболически неактивна, водная среда, напротив, создает условия для протекания метаболических процессов ( S^ger, Nicolson Д972).
Согласно представлениям о твердо-каркасно-жидко-мозаичной модели интегральные белки могут соединяться между собой мостиками из молекул периферических белков, образуя твердо-упругий каркас. Белково-липидная сетка может распадаться и вновь возникать в зависимости от состояния мембраны. Часть интегральных белков может не включаться в каркас и сохраняет подвижность (Конев.Мажуль,1977).
Варианты жидко-мозаичных моделей предусматривают возможность существования локусов, различающихся как химически, так и морфологически. Лабильность и подвижность матрикса делает возможным перемещение компонентов мембраны в том или другом направлении и на разную глубину. Например, ферментные системы, могут располагаться на разной глубине в зависимости от состояния мембраны.
Основные положения жидко-мозаичных моделей могут быть распространены и на организацию хлоропластных мембран. Внешними в этом случае являются белки, осуществляющие определенные функ -ции, но не участвующие в поддержании целостности структуры (например, сопрягающий фактор, НАДФ-редуктаза), а внутренними -белки, стабилизирующие мембрану (основные пигмент-белковые комплексы хлоропластных мембран). Дул пластохинонов в хлоропласт -ных мембранах обеспечивает челночный механизм, участвующий в транспорте протонов с наружной стороны мембраны во внутреннюю
( Trebst ,1974) ИЛИ между мембранами ( Anderson ,1981).Бел-
ки-переносчики в цепи электронного транспорта представляются внедренными в мембрану на разную глубину, причем именно неравномерность их расположения обеспечивает направленный перенос
Восстановленных эквивалентов И ВОДОрода ( Murakami ,1973).
Особый интерес представляет вопрос о локализации в фотосинтетической мембране молекул хлорофилла. Хлорофилловые пигменты, каротиноиды и пластохиноны, как известно, не включаются в формирование липидного матрикса, а выполняют функциональную на -грузку.
Спектры поглощения и флуоресценции хлоропластов in vivo и in vitro свидетельствуют о существовании большого разнообразия форм хлорофилла. Спектральные свойства хлорофилла в на -тивной мембране могут определяться не только взаимодействием пигмента с пигментом, но и с гидрофобными участками белков. Становится все более очевидным, что связь с белком в значительной степени определяет относительную ориентацию молекул хлорофилла. В целом проблема пигмент-пигментных и пигмент-белковых взаимодействий в нативной мембране еще далека от окончательного решения, так же как и вопрос о локализации пигмента в нативной мембране.
Молекула хлорофилла обладает гидрофильной областью у края, прилегающего к фитольному хвосту. Гидрофильными свойствами обладает и атом магния. Хлорофилл ь несколько более полярен по сравнению с хлорофиллом а.
Специальные расчеты показали, что все хлориновые кольца молекул хлорофилла в мембране расположены под некоторым утлом к поверхности. Согласно модели Андерсон ( Anderson ,1975) Стольные остатки располагаются рядом с гидрофобной поверхностью белковой глобулы в контакте с белком и липидом, а хлориновые кольца - внутри белковой глобулы таким образом, что полярная часть, смежная с фитолом, взаимодействует с гидрофильной областью интегральных белков, а гидрофобная - с их неполярной зоной(рис.1 ). /
ІЗ
"А
»
Молекула хлорофилла
Рис. І "Положение хлорофилла а в фотосинтетической мембране ( Anderson ,1975)
Описанные выше модели фотосинтетических мембран не затра гивают ее планарной структуры. Наиболее определенно в настоя щее время можно говорить лишь о функционально различающихся со стыкованных в граны и стромальных тилакоидах. Локализация фото систем до конца не выяснена, хотя во многих работах показано, что активность фотосистемы I связана преимущественно с тилако- идами стромы, а деятельность фотосистемы П - с состыкованными гранальными тилакоидами ( ,1971; Гамаюнова и др.,
1975; ,1975, 1981). Модель фотосинтетической мембраны, предложенная Андерсон ( ,1981 ), учитывает такой характер организации хлоропластных мембран (рис.2.).
Несомненно, что функциональные особенности мембран определяются организацией более сложной, чем рассмотренная выше ориентация молекулярных компонентов, особенно если учесть, что процесс фотосинтеза у высших растений осуществляется благодаря кооперации двух основных фотосистем, изображаемой обычно в виде так называемой -схемы (рис.3).
Прогресс в представлениях о молекулярной структуре биологи ческой мембраны, в том числе и фотосиятетической, в значительной степени зависит от развития междисциплинарной технологии ( ,1974). Так, в изучении структурных и
функциональных особенностей фотосинтетических мембран чрезвычайно важную роль сыграло совершенствование способов их разборки.
9я й9нйЫнУа н9н $йъъ.
ы т т ш т т и
т ш ш ш
гул УЛ
т т т
\шм т щ
ул\\т ц^анмтынин ніг
жшжшжж
Рис.2. Предполагаемая локализация комплексов фотосистемы I (I), фотосистемы її (2) и сопрягающего фактора (3) в
1.2. Пигмент-белковые комплексы хлороплаотных мембран и проблемы их оборки
В последние годы с помощью методов препаративной биохимии достигнуты значительные успехи в воспроизведении реакций фотосинтеза вне целого хлоропласта. К важнейшим достижениям следует отнести разделение хлоропластов на пигмент-белковые комплексы, которые являются главными внутренними белками мембран и основными структурами, участвующими в фотосинтезе.
Выделение хлороплаотных компонентов со свойствами разных фотосистем впервые было осуществлено Бордманом в 1964 г. методом ДИффереНЦИалЬНОГО центрифугирования (Boardman, Anderson,
1964). Уже первые опыты с применением детергентов показали, что полученные с их помощью пигмент-белковые фрагменты хлоропластов неоднородны и различаются как по размерам частиц, так и по относительному содержанию в них составных элементов. Солюбилиза-ция хлоропластного материала высших растений детергентами разной природы приводит к отщеплению прежде всего менее прочно связанных с мембраной легких фрагментов, осуществляющих фотохимические реакции фотосистемы I. Более крупные частицы хлоропластов ОбыЧНО Обогащены фОТОСИСТеМОЙ П ( Boardman, 1968,
1970). Наиболее успешным оказалось применение неионных детергентов - дигитонина и тритона Х-100. Именно с их помощью удалось выделить пигмент-белковые частицы, сохраняющие многие свойства целых хлоропластов, в том числе способность к переносу электронов при действии света (Островская и др.,1969; Гама-юяова и др.,1975;:Шутилова, 1976; Фрадкин,1982; Weasels et ai, 1973, 1975; Vernon et al, 1966,1972,1971).
Так, Весселс ( Wesseis ,1973), используя дигитонин, выделил с помощью центрифугирования в градиенте плотности сахарозы
содержащие хлорофилл частицы фотосистемы I (Fj), частицы реакционного центра фотосистемы П (pi;J и светособирающего коми -лекса (Рщ). После очистки хроматографированием на ДЖЕ-целлюло-зе ( Wesseis,Barchert ,1975) была получена фракция Fj с высоким отношением хлорофиллов а и ь (8-Ю) и высокой активностью фотосистемы I. Фракция Рд имела сходное с Pj отношение хлорофиллов а и ь, не содержала в своем составе П ^oq и обладала высокой активностью фотосистемы П. Фракция Рщ имела низкое отношение хлорофиллов а и ь (1,3-1,5) и не проявляла никакой фотосинтетической активности, на основании чего ее отнесли к светособирающему комплексу. Электрофоретическое разделение хло-ропластного материала, солюбилизированного дигитонином и рас-фракционированного в градиенте плотности, позволило получить частицы с различным отношением хлорофиллов а и ь ( Kok , Ru-rainski ,1971),аналогичные описанным выше.
Посредством электрофореза из солюбилизированных дигитонином хлоропластных мембран выделены 4 типа внутримембранных частиц, отличающихся химическим составом, спектральными, функциональными и метаболическими характеристиками, и осуществляющими все первичные процессы фотосинтеза (Фрадкин и др.,1980), и фракция, основным компонентом которой являются светособирающие комплексы, происходящие из лабильных частиц (Фрадкин и др., 1972,1973,1978). Внутримембранные частицы содержат дискретный набор более мелких компонентов, что позволяет рассматривать их как промежуточный уровень организации между более простыми пигмент-белковыми комплексами и целостной мембраной (Фрадкин и др.,1975,1976).
Применение тритона Х-ЮО для фрагментирования хлоропластов
также позволило получить субмембранные частицы с разными свой ствами ( Briantais ,1966 Vernon et al. ,1966; Островская,1971,1972; Щутилова, Кутюрин,1975,1976 ). При солю- билизавди мембран невысокими концентрациями детергента (0,05 и 0,2$) и последующем центрифугировании были выделены легкие час тицы с отношением хлорофиллов а и ь около 4,3 и тяжелые - с от ношением около 2,0 ( Briantais ,1967). Как крупные, так и мел кие фрагменты хлоропластных мембран соответствовали по спектрам поглощения и флуоресценции фрагментам, полученным с помощью дигитонина. Вернону с соавт. ( Vernon et al. ,1966,1967,1968/ удалось посредством дифференциального центрифугирования хлоро - пластов, обработанных тритоном Х-100, выделить легкие частицы (так называемая тритоновая субхлоропластная фракция I), которые имели высокое отношение хлорофиллов а и ь и обладали свойствами фотосистемы I. Максимум поглощения хлорофилла в них находился в области 675 нм. Фракция таких фрагментов содержала цитохромы f и bg и была обогащена 3 - каротиноидами по сравнению с исход ными хлоропластами. Субхлоропластная фракция П отличалась низ - ким отношением хлорофиллов а и ь (2,0) и высоким содержанием лютеина по сравнению с неразрушенными хлоропластами, она содер жала цитохром bggg и была фотохимически неактивна.
После специальной очистки субхлоропластных тритоновых фракций ( Ке et al .,1974) удалось получить материал, содержащий реакционный центр фотосистемы П, CgejQ и цитохром Ъ559, и обладающий значительной активностью при добавлении искусствен -ных электронных доноров, с очень высоким отношением хлорофиллов а и ь - 28. Из фракции I (исходное отношение хлорофиллов а и ь -6, а отношение хлорофилла к П^о - 40) с высокой активностью
фотосистемы I удалось получить П7оо - хлорофилл-белковый комплекс, не содержащий цитохромов ( Ке et ai. ,1975). Комплекс, содержащий цитохромы bggg и f , пластоцианин и железо-серный белок, по предположению ( Ке et ai. ,1975), может действовать в циклическом фосфорилировании как аналог комплекса Ш и ІУ митохондриальной дыхательной цепи. U^qq - хлорофилл-белковый комплекс, выделенный из хлоропластных мембран, солюбилизирован-ных тритоном Х-100, и очищенный путем хроматографирования на гидроксилаппатите, содержал хлорофилл и fi- каротин,, на одну молекулу IIr;QQ-40 молекул хлорофилла, но не был свободен от цитохромов и, возможно, других компонентов фотосистемы I ( Shio-zawa et ai. ,1974), в отличие от описанного выше комплекса.
Следует особо отметить работы, в которых с помощью тритона Х-100 выделены три типа пигмент-белково-липидных комплексов (ПЕПК) (ПБЖ реакционного центра фотосистемы I, реакционного центра фотосистемы П и вспомогательного ПБЛК), сохраняющих устойчивую надмолекулярную структуру (Щутилова, Кутюрин,1975, 1976; Щутилова, 1976), обладающих высокой функциональной активностью (Захарова, Чибисов,1978; Стадничук, Щутилова,1980; іуляев и др.,1981). Для каждого из видов ПБЖ существуют свои оптимальные условия выделения (Щутилова, ж др.,1981).
Исследования пигментного и липидного состава, спектральных и физико-химических свойств препаратов реакционного центра I выявили различия в организации и свойствах реакционных центров гранальных и межгранных участков тилакоидов (Островская и др., 1973,1974,1979; Гамаюнова и др.,1973,1975; Ширяев, 1978).
Совершенно очевидно, таким образом, что использование неионных детергентов позволяет получить пигмент-белковые КОМПЛЄК-
сы, обладающие многими свойствами, характерными для интактных хлоропластов.
Однако более полная солюбилизация мембранного материала достигается с помощью ионных детергентов, которые хотя и нарушают фотохимическую активность, но позволяют разделить тилако-идную мембрану на более мелкие фрагменты. Особенно популярен додецилсульфат натрия (ДЦС-Па).
В первых работах Шибата и Торнбера с соавт., ставших классическими, показано, что хлоропластный материал шпината и фасоли, СОЛЮбиЛИЗИроваННЫЙ JfflP-Na ( Ogawa et ai. ,1966) или до-дещлбензосульфатом натрия ( Thornber et ai. ,1967), при электрофорезе разделяется на три пигментированные зоны. Две из них, наименее подвижные, оказались пигмент-белковыми комплексами, названными ПЕК I и ПШ П, а самая подвижная - безбелковой зоной, содержащей пигмент, освобождающийся при электрофорезе в количествах, зависящих от соотношения пигмент:детергент в исходном материале. Было установлено ( тьогаЪег et ai. ,1967 ), что в пигмент-белковом комплексе I содержится около 20$ мембранного белка, а в пигмент-белковом комплексе П - 49$. Часть хлорофилла, поступающего в зону свободного пигмента, возникает из комплексов ( ihomber ,1975), ибо при повторном электрофорезе
ЛЮбОГО ИЗ КОМПЛекСОВ ИЗ НИХ УХОДЯТ ПИГМеНТЫ ( Leggett-Bailey,
Kreutz ,1969). Уже ранние исследования показали, что комплекс I обогащен $ - каротином и не содержит виолоксантина и неоксан-тина, а в комплексе П находятся все 4 вида каротиноидов, но
Особенно МНОГО ЛЮТеина ( Ogawa et al. ,1966; Thornber et al.,
1967 ь). Оба комплекса содержат следы фосфолипидов, а также кар-богидратов и отличаются аминокислотным составом.
Полученные комплексы были достаточно полно охарактеризованы и по составу белков и липидов. Однако в качестве одной из главных характеристик чаще других использовалась величина от -ношения хлорофиллов а и ь. Она варьирует в широких пределах в зависимости от условий электрофореза и степени очистки исходного материала, оставаясь тем не менее более высокой (обычно 4-8, в особых случаях - 12) в пигмент-белковом комплексе I. Для пигмент-белкового комплекса П отношение хлорофиллов а и ь
ОбЫЧНО НЄ ВЫХОДИЛО за Пределы 1-1,8 ( Thornber , 1975).
Основываясь на величине отношения хлорофиллов а и ь, долгое время наиболее подвижный пигмент-белковый комплекс относили к фотосистеме П.
Убедительным доказательством принадлежности электрофорети-ческих комплексов к той или иной фотосистеме безусловно должно быть установление природы их фотохимических реакций. Однако в результате воздействия на мембрану ионных детергентов ее функция как правило нарушается. Тем не менее, некоторым авторам (Lege tt-Bailey, Kreutz ,1969) удавалось наблюдать свето-вызываемое изменение Пг/qq в комплексе I, что указывало на наличие в нем реакционного центра фотосистемы I. Затем было найдено, что комплекс П отсутствует у мутантов ячменя, не содержащих
хлорофилл Ь ( Thornber, Highkin,1974; Genge et al,1974; Ander son, Levine,1>974b; Henriques, Park, 1975 ) ,4TO
не препятствует, тем. не менее, проявлению в них активности обеих фотосистем. На основании этого наблюдения было сделано важное заключение о том, что содержащий хлорофилл ь комплекс П, полу -
чеШШЙ электрофорезом С ДЦС-Яа( Anderson, Levine, 1974 ), НЄ
является существенной частью фотосистемы П, а скорее всего фун-
кционирует как светос обирающий хлорофилл а/ъ-белковый комплекс (ССК) ( Thornber , Highkin ,1974).
В результате электрофоретической разборки мембраны сложилось представление о том, что с каждой из фотосистем фотосинтетической мембраны связано несколько полипептидных компонентов или несколько пигмент-белковых комплексов. Так, данные Вернона с сотрудниками ( Vernon et ai. ,1971) свидетельствуют о существовании в каждой фотосистеме по крайней мере двух пигмент-белковых комплексов: реакционного центра и светособирающей системы. Дальнейшие работы этого автора показали ( Klein , Vernon, 1974), что субхлоропластные частицы, полученные с помощью тритона Х-ТОО и содержащие фотосистему I и П, при ДЦС -На- электрофорезе обнаруживают 14 и 12 белковых зон, соответственно. В частицах фотосистемы I преобладающие в количественном отношении белки характеризуются молекулярной массой 60 000 дальтон, а в частицах фотосистемы П содержатся белки меньшей массы - 24 000 дальтон.
Как уже отмечалось выше, в результате однократного электрофореза с ДЦС- ж получают ПБК I с отношением хлорофиллов а и ь В пределах 5-12 ( Ogawa et al., 1966J Thornber et al., 1967J Chua et al., 1975Ї Uakamura et al., 1976 ). Хлорофилл b можно удалить из комплекса либо повторным электрофорезом ( Thornber,I975), либо другими методами ( Genge et al. ,1974; Brown et al. ,1975). На этом основании предполагают, что комплекс реакционного центра содержит только хлорофилл а ( Thomber,I975). Точная величина отношения хлорофилла а к II7qq в ПЕК I неизвестна, поскольку трудно установить, сколько молекул хлорофилла удаляется из комплекса при обработке его
детергентом. Обычно получают препараты реакционного центра фотосистемы I с отношением,равным 40 ( Shiosav/a et al., 1974; Ке et ai.,1975; Maikin, 1975 ). Некоторым исследователям удается получить и более высокую величину этого отношения (80), не нарушая способности к восстановлению НАДФ (Bengis, Kelson,1975).
В литературе приводились данные, свидетельствующие о близких размерах молекулярной массы ПЕК І у разных растений; у табака - 100 000 дальтон ( Kung, Thornber ,1971), у шпината -ПО 000 ( Thomber et al,I967), у гороха - 112 000 - 140 000 (Еа-giesham, Ellis ,1974). Если из комплекса удаляется липид, то в его составе обнаруживают только один полипептид с молекулярной массой 62 000 - 70 000 дальтон ( Chua et al ,1975).
У шпината и сине-зеленой водоросли Nostoc muscorum на белковый агрегат ПБК І в ПО 000 дальтон приходится 14 молекул хлорофилла a (Thomber et al. ,1967). У Chlamydomonas reihardtii 8-9 молекул хлорофилла связано с полипептидом 64 000 дальтон, выделенным из ПЕК I ( Chua et al ,1975). По другим сведениям ( Bar-Nun et al ,I977)j с полипептидом 64 000 дальтон у этой водоросли связывается 30 молекул хлоро -филла а.
На основании исследований по разборке фотосинтетической мембраны предложено несколько моделей ПЕК І.Модель,разработанная на основании данных,полученных для сине-зеленой водоросли Pho-rmidium euridium ,предполагает,что в комплексе содержится только одна молекула II^qq на большое количество белка. Основной субъединицей ПЕК сине-зеленых водорослей является компонент с молекулярной массой 48 000 дальтон, кроме этого для
комплекса характерна и минорная субъединица - 46 000, что подтверждено данными аминокислотного анализа. Торнбер ( Thornber et ai. ,1977) предположил, что їїг^-хлорофилл а - протеиновый комплекс высших растений состоит из двух тримеров: один содержит две субъединицы с молекулярной массой 48 000 и одну -46 000, а другой состоит из трех субъединиц с молекулярной массой 48 000 дальтон. Каждая субъединица содержит 7 молекул хлорофилла а, молекула Пгэд находится только на полипептиде 46 000. Аналогичное строени: предполагается для пигмент-белкового комплекса бактериохлорофилла ( Fenna, Mathews ,1975). Согласно еще одной модели ( Bengis, Nelson ,1975) на два полипептида с молекулярной массой 70 000 дальтон приходится одна молекула ІІ7оо>и *ВДР*й из полипептидов содержит 20 молекул хлорофилла а. Для образования H^qq при этом необходима кооперация двух субъединиц. Возможно, однако, что II^qq теряется в процессе очистки, и тогда справедливо думать, что каждый полипептид имеет одну молекулу n«QQ.
Аминокислотный состав апопротеина пигмент-белкового комплекса I типичного прокариота - синезеленых водорослей и комплекса, выделенного из мембран эукариотов, свидетельствует о незначительных различиях между ними, главным образом, по со -держанию гистидина и цистеина ( ТпогпЪег et ai. ,1977).
Светособиращий комплекс после хроматографии на гидрокси-лаппатите имел равное количество хлорофиллов а и ь ( Thornber t 1975). Однако, использование некоторых модификаций электрофореза дало возможность получать комплекс с отношением хлорофиллов а И Ь, большим единицы ( Ogawa et al., 1966? Thornber et al.,
1967; Uakamura et al., 1976 ). Быстрый электро-
форез на холоду при низком отношении хлорофилл-детергент в про-
цессе солюбилизации позволил получить комплекс с отношением пигментов в пределах 1,3-1,8. Отношение хлорофилл:каротиноиды в нем равно 6 как для шпината, так и для Ohiamydomonas . В ' комплексе присутствуют все каротиноиды с преобладанием лютеина. В нем обнаружены следы фосфолипидов и галактолипидов, но неясно, являются ли они интегральной частью нативного комплекса ( Thornber ,1975). Светособирагощий комплекс, выделенный по -средством ДЦС- Na-электрофореза или ДЦС- Na-хроматографией на гидроксилаппатите, имел молекулярную массу в области 27 000 -35 000 Дальтон ( Kung, Thornber, 1971J Eaglesham, Ellis, 1974J Machold, 1975Ї Kan and Thornber, 1976). Следует ОТМЄ -тить, что оценка молекулярного веса комплексов, полученных посредством ДЦС- На-электрофореза, ненадежна вследствие высо -кого содержания в них липидов, которое влияет на связывание ДЦС- На и изменяет гидродинамическое поведение комплексов в электрофорезе.. Подвижность светособирающего комплекса выше подвижности его полностью денатурированных полипептидных компонентов ( Bar-Nun et al. ,1977). Полипептидный состав комплекса точно неизвестен, хотя посредством ДЦС-la - электрофореза И выделен ДИМер ( Hiller et al., 1974J Remy et al.,1977). Хлорофилл, по-видимому, легче удаляется из светособирающего комплекса, чем из ПЕК I ( Leggett-Bailey and Kreutz ,1969).Сначала в его составе обнаружили ( Thoraber,Highkin,1974 ) 2 молекулы хлорофилла на белковый фрагмент с молекулярной массой 35 000 дальтон. Однако, позднее было показано (кап and Thornber 1976), ЧТО СВетособираюЩИЙ Комплекс Chlamydomonas , который по-видимому является более стабильным, чем комплекс высших растений, имеет 6 молекул хлорофилла на полипептид 29 000 даль-
тон. Отношение хлорофилл:белок в нем составляло 0,09. Такой комплекс состоял из двух субъединиц с молекулярной массой 24 000 и 22-000 дальтон.
Аминокислотный состав светособиравдего комплекса Chiamy-domcmas почти не отличается от аминокислотного состава исход -ной фракции хлороплаотных мембран, солюбилизированных ДДС- Na ( тіюгсїЬег ,1975), вероятно, потому, что светособирающий комплекс является главным внутренним компонентом хлороплаотных мембран.
Сведения о строении реакционного центра фотосистемы П основывались долгое время только на работах, в которых для солюби-лизации использовали неионные детергенты.
Применение для экстракции и очистки реакционного центра фотосистемы П дигитонина позволило получить препараты с отношением хлорофиллов а и ь около 7-9 ( Wesseis et ai. ,1973; Wessels, Barchert ,1975). С помощью тритона Х-ЮО получены препараты реакционного центра фотосистемы П с отношением хлорофиллов а и ь, равным 28 ( Ке et ai. ,1974). При обычной процедуре электрофоретического разделения солюбилизированных ДДС - Na фотосинтетических мембран не удавалось получить комплекс, содержащий реакционный центр фотосистемы П.[. В связи с этим постоянно предпринимались попытки модификации метода с целью увеличения стабильности нативных пигмент-белковых комплексов. Это было достигнуто, главным образом, уменьшением отношения детергент:белок при солюбилизации тилакоидов, проведением электрофореза при низкой температуре и заменой части ионного детергента ДДС- иа неионным детергннтом. Изменив таким образом условия солюбилизации мембран и проведения электрофореза,
удалось получить шесть и более пигмент-белковых комплексов,
которые различались СВОИМИ свойствами (Hoyden, Hopkins, 1977; Anderson et al., 1978J Henriques, Park, 1978J Dankley, Anderson, 1979; Herrmann, Meister, 1972J Hiller et al., 1979, Satoh.-,i972;Deiepeiaire).ABa из них названы хлорофилл а -белковыми комплексами фотосистемы I -ПБК 1а и ПБК I (в оригиналах работ иностранных авторов они сокращенно называются СР 1а и СР І, в нашей работе мы используем сокращенное обозначение их в русском переводе). В этих двух комплексах сосредоточено до 30% общего хлорофилла мембран, оба они имеют одну молекулу П^0о на 120 молекул хлорофилла а. Показано, что весь хлорофилл а и II^qq связаны с полипептидом 70 кД. При этих условиях удалось получить хлорофилл а - белковый комплекс фотосистемы П, с которым связано до 10% общего хлорофилла мембран (СРа в английской терминологии, в нашей работе - ПБК П). Главными компонентами этого комплекса являются полипептиды 50 и 47 кД, наряду с ко -торыми обнаруживаются и минорные полипептиды.
Получаемые в результате самых современных методов три хлорофилл а/ь-белковых комплекса относятся к еветособирающей системе. Они содержат до 50% общего хлорофилла мембран и состоят из двух главных полипептидов с молекулярной массой 25 и 23 кД И нескольких минорных ( Anderson et al., 1978; Machold, 1979J Remy, 1978J Dankley, Anderson, 1979,Hiller et al.,1979 ).
Разборка мембран с помощью детергентов и последующего электрофореза послужила экспериментальной основой для перехода от абстрактных рассуждений о строении фотосинтетического аппарата к более реальным моделям мембран. Одна из них,представленная на рис. 4 , предусматривает такое взаимное располо-
CF,
STROMA
LHC(PFs)
I*
П
^A -AOK
;a к о I
D.
PS II (tfttramnric EFs particle)
PSl(PFu)
CF0(PFu)
INTRATHYLAKOIDAL SPACE
Рио.4. Строение фотооинтетической мембраны
ПО ( Wettstein et ^l^jjiei).
жение пигмент-белковых комплексов и белков-переносчиков, при котором процесс фотосинтеза протекает наиболее эффективно.
Имеющиеся в настоящее время данные свидетельствуют в пользу представлений о многоступенчатом характере сборки фотосинтетической мембраны. ( Ohad et aL.1975). Временная же последова -тельность формирования основных пигмент-белковых комплексов и особенно входящих в их состав полипептидных компонентов совсем не ясна.
Известно, что этиопласты содержат значительное количество компонентов электронтранспортной цепи. В настоящее время считается установленным, что активность фотосистемы I и фотосистемы П в зеленеющих проростках ряда растений регистрируется до того, как обнаруживаются сами пигмент-белковые комплексы. П^до'-хло-рофилл-белковый комплекс появляется только после 30 мин. освещения этиолированных листьев, в то время как активность фотосистемы I удается зарегистрировать значительно раньше (Hennin-gsen, Boardman, 1973J Plesnicar, Bendall, 1973).
Это указывает на то, что уже небольшое'количество хлорофилла, которое присутствует на ранних стадиях зеленения, может функционировать фотосинтетически на месте реакционного центра Пг,00. Поскольку в растениях, выращенных в темноте, уже имеются друние компоненты фотосистемы I, предполагают, что в них находится и реакционный центр фотосистемы 1,но только в форме предшественника, возможно протохлорофиллид-голохрома ( Henningsen, Board-man, 1973; Piesnicar,Bendali,l973; Калер,1976). Активность фотосистемы П обнаруживается спустя 30 мин с момента начала освещения (Horton ,1976). Установлено, что для проявления отдельных реакций фотосистемы П не требуется ни образования гран, ни при-
сутствия светособирающего комплекса, ни высокопотенциальной формы цитохрома Ь^д» Возможно, сборка фотосистемы. П происходит более медленно (30 мин и более), потому что одна из ее стадий включает фотоактивацию мп- содержащего участка, ответственного за выделение кислорода. Сравнительно быстрое появление активности обеих фотосистем в процессе превращения этио-пласта в хлоропласт может служить указанием на то, что зача -точные формы их образуются в отсутствие света, другие иссле -дователи отмечают наличие ПЕК І у зеленеющих проростков ячменя через 2-3 часа освещения, однако всегда активность фотосистемы I регистрируется раньше появления ПШ I ( Hiiier , 1978; Argyroudi-Akoyunog. ,1971).
Появление светособирающего комплекса коррелирует с грано-образованием ( Armond et ai. ,1976). Так, в условиях им -пульсного освещения (2 мин свет, 98 мин темноты) листьев фасоли, когда в хлоропластах образуются главным образом единичные первичные тилакоиды, комплекс светособирающей системы не обнаруживается. Гранообразование, происходящее только в условиях непрерывного освещения, развивается параллельно с синтезом хлорофилла ь и синтезом полипептидов с молекулярной массой 25-30 килодальтон. Очевидно, полипептидов, присутствующих в этио-пластах; достаточно для появления фотохимической активности обеих фотосистем при наличии уже небольшого количества хлорофилла, синтезирующегосяпри импульсном освещении. Но этого количества полипептидов и хлорофилла недостаточно для образования
В настоящее время развивается представление о световой ин-
дукции синтеза светособиравдего комплекса ( Bennet ,1979). Предполагается, что в запуске этого синтеза участвуют два вида фоторецепторов: фитохромная система, контролирующая образование и- РНК, кодирующей синтез белка светособирающего комплекса, и
прОТОХЛОрофиЛЛИД ( Apel, Kloppstech,1978,1980JHoober et а1.,7б Apei ,1979,1980). Светособирающий комплекс имеет, по-видимому, сложный состав - три и более полипептидов (Henriques, Park , 1977; Anderson ,1980). Показано, что содержание полипептида с молекулярной массой 25 000 дальтон коррелирует с общим количеством хлорофилла в листьях ( Henriques,Park ,1978).
Известно, что развитие хлоропластов кодируется как ядерным, так и пластидным геномом. Исследования с использованием ингибиторов белкового синтеза на 80 s рибосомах свидетельствуют о том, что белковые компоненты обеих фотосистем синтезируются ВНЄ хлоропласта (Eytan, Ohad,1972J Ellis,1975,1978;Feirabend,80). Это заключение подтверждается и в экспериментах с изолированными хлоропластами, которые способны активно синтезировать белок in vitro , но не включают при этом меченые аминокислоты в белки фотосистем. Однако более реальным представляется участие в синтезе фотосинтетической мембраны обоих геномов (Chua , Giliman ,1977). Так, было показано, что хлорофилл-белковый комплекс, содержащий полипептид 47 килодальтон, который связывают с реакционным центром фотосистемы П, синтезируется в хлоропласте, но на синтез этого полипептида могут влиять ядерные мутации. Продолжают накапливаться доказательства вовлечения хлоропластных рибосом в синтез ПЕК I. Исследования с мутантом Chiamydomonas г. показали, что полипептид ПЕК I с молекулярной массой 68 килодальтон кодируется хлоропластной ДНК и син -
тезируется в пластидах, а ядерный геном выполняет регулирующую роль в его синтезе и процессе сборки в мембране (Bennon et al, 1977). На синтез антенного хлорофилла оказывает ингибирующее влияние линкомицин, действующий на хлоропластные рибосомы ( Hiller et al ,1978).
Остается открытым вопрос о качественном составе белка,синтез которого происходит в процессе зеленения этиопласта и контролируется светом. Попытки ряда исследователей внести ясность в картину биогенеза фотосинтетической мембраны путем сравнения полипептидного состава этиопластных и хлоропластных мембран, несмотря на постоянно совершенствующиеся методы, пока не принесли успеха ( Hoyer-Hansen, Simpson, 1977 ). Существенны и разногласия по поводу степени сходства полипептидного состава этиолированных и зеленых мембран. Некоторые авторы (Arguro-idi-Akoyunoglou et al.,1971;Remy,1973;bagoutte,Duranton,1976; Куроанов и др., 1970; Вершинин и др., 1982; Молчанов и др.,1982) считают, что практически все основные белки хлоропластных мембран существуют в этиопластной мембране, и освещение вызывает только лишь увеличение их количества. Убедительно показано также, что в этиопластах ржи имеются основные полипептиды тилако-идной мембраны и только некоторые новообразуются в процессе трансформации пластид при зеленении ( Feierabend et al ,1980). Более значительные изменения в полипептидном составе обнаружены при зеленении ПЛасТИД Chlamydomonas reinhardtii(Ohad et al,1967abi
Резюмируя данные разных авторов, изучавших полипептидный состав мембран в процессе зеленения, можно говорить о существовании трех различных групп белков. Первая группа объединяет белки, которые присутствуют исключительно в этиопластах. Наибо-
лее значительные из них - с молекулярной массой 120 000 и 37 000 дальтон. Во время еветозависимого развития хлоропластов появляются белки с молекулярной массой 42 000, 32 000, 27 500, 27 000, 26 000, 25 000, 24 000, 16 000 и 13 000 дальтон. Среди синтезирующихся ае nwo в процессе превращения этиопласта в хлоропласт белков идентифицированы субъединицы светособирающе-го комплекса с молекулярной массой 27 500, 27 000, 26 000,
25 000 дальТОН ( Grebanier et al ,1979). В третью Группу
входят белки, присутствующие как в этиопласте, так и в хлоро -пласте, они составляют около 67$ общего количества белка мем -бран ( Grebanier et al ,1979).
Следует отметить, что природа большинства мембранных полипептидов, выявляемых электрофорезом в полиакриламидном геле, до сих пор неизвестна. Необходимо учитывать также и тот факт, что одинаковая электрофоретическая подвижность не является абсолютно достоверным доказательством идентичности белков этио -пластов и хлоропластов. Для проведения сравнительных исследований белкового состава этиопластннх и хлоропластных мембран целесообразно использование специфических антител, которые могут служить маркерами индивидуальных компонентов мембраны и их предше ственников.
1.3. Применение антител в исследованиях молекулярной организации фотосинтетической мембраны
Активное использование антител в исследовании строения фотосинтетической мембраны началось с изучения локализации отдель -ных компонентов в цепи электронного транспорта. Такие данные сыграли большую роль в формировании представлений о структурной
организации хлоропластов и их внутренних мембран.
/
Техника иммунохимических исследований в применении, к изучению молекулярной организации мембраны была предложена Менке
( Menke, 1972 ) И БерцборНОМ С соавторами ( Berzl>orn,Iiocau ,
1977). В основе приемов,используемых этими авторами, лежит взаимодействие антител с гомологичным антигеном в нативной мембране: если антитела против специфического компонента, связываясь с ним в нативной мембране, подавляют активный центр фотохимической реакции, это свидетельствует о его доступности. В случае, если такой центр расположен внутри мембраны или на недоступной для антител стороне (внутри тилакоида), активность реакции оказывается неизменной.
Для того чтобы установить локализацию отдельных компонентов на внутренней или внешней стороне мембраны, широко использзпотся также реакции прямой и -непрямой агглютинации хлоропластов. Если компонент расположен на поверхности мембраны, то при добавлении соответствующих антител происходит прямая агглютинация хлоро -пластов. Если компонент расположен на внутренней недоступной стороне мембраны (внутри везикулы), агглютинация не происходит. В некоторых случаях исследуемый компонент может располагаться в углублении мембраны, тогда агглютинации не происходит, но ее можно достичь при использовании особого методического приема ( СоотЪа ,1976), который обеспечивает проникновение антител в углубления мембраны. Антитела, таким образом, используются как специфические связывающие реагенты (преципитирующие или агглютинирующие) или как специфические ингибиторы, блокирующие последовательность реакции в изучаемом участке.
Рентгеноструктурные исследования привели к заключению, что тилакоидная мембрана асимметрична и состоит из мономолекулярного
слоя белков, прилегающего к наружной стороне мембраны, и внутреннего слоя липидов. Серологические исследования с белком сопрягающего фактора фосфоршшрования, РШК (Kannangara ,1970), ферредоксином ( Bohme ,1978 а) и четырьмя тилакоидными поли -пептидами ( Koenig et ai ,1976) подтвердили эту точку зрения. Однако позднее было показано, что антигенные детерминанты ферре-доксин-НАДФН-редуктазы и пластоцианина локализованы не на наружной поверхности тилакоида ( Bohme ,1978, в). После обработки дезоксихолатом и последующей гель-фильтрации была выделена хлорофилл-белковая фракция с молекулярной массой 600 000 дальтон, обладающая способностью восстанавливать' метилвиологен с дихлорфенолиндофенол/аскорбатом в качестве электронного донора ( Koenig et ai,I977). Антитела к этой фракции, специфически адсорбирующиеся бесстромальными хлоропластами, не были в состоянии ингибировать ее функциональную способность до тех пор, пока хлоропласты не разрушались ультразвуком. Противоречили концепции модели фотосинтетической мембраны, вытекающей из рентгеноструктурного анализами серологические исследования с липидами: молекулы липидного слоя оказались доступными гомологичным антителам. Так, Радунц ( Radunz, Berzborn ,1970 ;
Radunz ,1977) установил, ЧТО В Хлоропластах Anthirinum m.
антигенные детерминанты моногалактозилдиглицерида., сульфохино-возилдиглицерида , фосфатидилглицерияа и тригалактолипида располагаются на наружной поверхности тилакоидной мембраны. Однако мембранные фрагменты, разрушенные ультразвуком, значительно лучше реагировали с сывороткой против тригалактолипида, чем необработанные хлоропласты. Из этих экспериментов следует, что три- и дигалактолипиды. расположены не только на наружной повер-
хности тилакоида, но также и внутри него. Сульфолипидная антисыворотка не реатаровала с эмульсией моно- или дигалактозилдиа-цилглицерола, лецитином или анион-фосфатидфосфатидил глицеро-лом. В экспериментах по агглютинации хлоропластов Anthirinum
maius с антителами против сульфолипидов было показано,что определенные группы сульфолипидов доступны для антител в ла -меллярной системе хлоропластов, и в то же время некоторые МО -лекулы сульфолипидов локализованы внутри тилакоида ( Radunz , 1975,1976). Следует отметить, что антитела против сульфолииидов Anthirinun majua, полученные посредством иммунизации кроликов очищенными сульфолипидами, адсорбированными на метилированном бычьем сывороточном альбумине, реагировали с препаратами сульфолипидов из растений различных видов. В серологических экспериментах показано, что на наружной поверхности тилакоидной мембраны сине-зеленых водорослей Nostoc muscorum И Oscillator ia chaiybea локализованы лгатеин и неоксантин ( Schmid et аі Д977). Как следует из более ранних работ для высших растений, оба типа каротиноидов включаются в функционирование фотосистемы I. Антисыворотка к лютеину и неоксантину ингибиру-ет в обоих видах водорослей фотосинтетический электронный транспорт на участке разложения воды фотосистемы. П. Тилакоид -ная мембрана Anthirinum majus адсорбирует антитела против хлорофилла И ксантофилла ( Radunz et al ,1971; Radunz , 1978).
Использование возможностей иммунохимии позволило конкретизировать представления о локализации в тилакоидах компонентов фотосистем и белков, участвующих в переносе электрона. Пред -ставлены иммунохимические доказательства локализации фотосисте-
мы I на наружной стороне тилакоидной мембраны, а фотосистемы П-
на ИХ внутренней поверхности ( Briantais, Picaud ,1972).
В развитии представлений о структуре фотосинтетической мембраны, важную роль сыграли эксперименты Кёнига с соавт. ( Koenig et ai ,1972). Из хлоропластов были выделены три фракции с разной молекулярной массой. Каждая частица фракции 600 000 дальтон содержала в среднем 25 молекул хлорофилла и обладала активностью фотосистемы І. В ней не были обнаружены ни галактолипиды, ни сульфолипиды, ни фосфатиды. Вторая фракция с молекулярной массой НО 000 дальтон проявляла активность обеих фотосистем, но сопряженный электронный транспорт между фотосистемами не наблюдался. В среднем каждая ее частица содержала I молекулу хлорофилла. Эта фракция также не содержала бесцветных липидов. Третья фракция с молекулярной массой между 80 000 - 100 000 дальтон содержала одну молекулу хлорофилла на полипептид и обладала активностью, характерной для фотосистемы П. Все три фракции содержали общую антигенную детерминанту, возможно белковую. Применение антител позволило заключить, что один участок фракции ПО 000 лежит на наружной стороне тилакои-да, а другой - на его внутренней стороне. Белок фракции 600 000, по-видимому, проникает в тилакоидную мембрану на некоторую глубину, поскольку одна из его антигенных детерминант локализована в углублении тилакоидной мембраны. Проведенные эксперименты показали, что исследованные белки локализованы как на внутренней, так и на наружной стороне тилакоидной мембраны ( Koenig et ai, 1972; Menke ,1973). В совокупности с данными о том, что гидрофильные группы моногалактозилдиглицерида локализуются на наружной поверхности тилакоида ( Radunz ,1978), эти результаты за-
ставляют критически относиться к бислойной модели тилакоидной мембраны.
Исследование влияния антител на фотосинтетический транспорт электронов, вместе с экспериментами по превдпитации, агглютинации, адсорбции и нейтрализации четко показало, что восстанавливающий участок фотосистемы I находится на поверхности тилакоида, обращенной к строме, а окисляющий участок, вероятно, недоступен для антител ( Menke et ai ,1975,1978). Однако иммунохимические данные, подтверждающие это, спорны. Из экспериментов с антителами следует, что большая часть фотосистемы П спрятана либо в мембране, либо в ее углублениях ( Schmid et ai, 1976 а, в; 1977).
Использование антисывороток против трех электронных переносчиков фотосистемы I - ферредоксина, ферредоксин НА.ДФ+ - окси-дор#едуктазы и пластоцианина в реакциях агглютинации осмотически шокированных хлоропластов шпината показало, что эти компо -ненты цепи транспорта электрона являются периферическими, локализованными на наружной поверхности тилакоидной мембраны ( Bohme ,1978). Определение содержания этих переносчиков, проведенное с помощью количественного иммуноэлектрофореза, позволило установить, что отношение ферредоксина к ферредоксин НАДФ+-редуктазе и пластоцианину равно 5:3:4, соответственно, в расчете на питохром f или ILyoo ( Bohme »1978 а ).
Непростая задача стоит перед исследователями, пытающимися выяснить функциональную принадлежность различных полипептидных компонентов, которые получаются при разборке фотосинтетической мембраны с помощью электрофореза или другими методами. В этой области также очевидны успехи, достигнутые благодаря применению
МеТОДОВ ИММуНОХИМИИССЬиа ,Blomberg,1979).
Кениг ( Koenig et ai ,1977) препаративно разделил полученную гельхроматографией фракцию полипептидов фотосинтетиче -ской мембраны Anthirinum m. , солюбилизированной ДДС- та, с молекулярной массой 66 000 на три компонента и сделал попытку определить их локализацию в мембране и охарактеризовать их функцию в фотосинтезе, используя соответствующие антисыворотки. Автор установил, что один из этих компонентов участвует в электронном транспорте на акцепторной стороне фотосистемы I и локализован на наружной стороне тилакоидной мембраны; второй компонент имеет отношение к реакционному центру фотосистемы I и находится на внутренней поверхности тилакоидной мембраны; третий компонент участвует в электронном транспорте в области фотосистемы. П и его антигенные детерминанты локализованы на наружной
поверхности ТИЛакОИДа. Из ТИЛаКОИДНОЙ мембраны Anthirinum
тазus были выделены полипептиды с молекулярной массой II 000, 17 000, 40 000, 48 000 дальтон и предпринята попытка определить их локализацию и функцию с помощью гомологичных антител ( Koenig et ai ,1976). Было показано, что все 4 полипептида локализованы в доступных для антител местах на наружной поверхности тилакоида. Антисыворотка к полипептиду II 000 дальтон ингибировала электронный транспорт на участке разложения воды фотосистемы П. Серологические исследования в тестах Охтер-лони показали, что полипептид II 000 содержит несколько компонентов, хотя при ДЦС-та - электрофорезе по Лаеммли была обнаружена только одна узкая полоса. Антисыворотка к полипептиду 40 000 дальтон ингибировала электронный транспорт на участке фотосистемы I и все реакции фотофосфорилирования. Авторы предпо-
ложили, что этот полипептид соответствует К - компоненту сопрягающего фактора. Участок действия антисыворотки против полипептида 48 000 дальтон находился в электронной цепи между двумя фотосистемами перед пластоцианином. Функцию полипептида 17 000 дальтон установить не удалось. Интересно, что фракции белков хлоропластной мембраны, различающиеся по молекулярной массе и по функции в электронном транспорте, содержали один идентичный ПОЛИПЄПТИД ( Koenig et ai ,1976).
другая группа исследователей выделила из мембран тилакоидов Anyhirinum majus полипептиды с молекулярной массой 66 000, 62 000, 33 000, 24 000 дальтон ( Menke et al ,1975) и пытались иммунохимическими методами определить их локализацию и функцию. Авторы показали, что антигенная структура полипептидов не разрушалась под действием ДЦС- Na и что все антигенные детерминанты локализованы на наружной поверхности тилакоидной мембраны. Привлекает внимание обнаруженное серологическое родство между полипептидами 62 000 и 24 000 дальтон и полное отсутствие идентичности у полипептидов 24 000 и 33 000 дальтон. Установлено также, что мембранный компонент 66 000 дальтон имеет прямое отношение к активности только фотосистемы I. Антисыворотка к компоненту 33 000 дальтон ингибировала фотовосстановление метилвиологена. Более того, эта антисыворотка ингибировала на 30$ циклическое фотофосфорилирование. Нециклическое фотофосфорилирование с метилвиологеном в качестве электронного акцептора не ингибировалось. Из этого авторы заключили, что исследуемый компонент локализован на донорной стороне IWvv Полипептид 24 000 участвовал в реакциях обеих фотосистем. Возможно, он является смесью сходных по молекулярной массе поли -
пептидов. Антисыворотка к полипептиду 62 000 ингибировала фотовосстановление НАДФ+ с водой в качестве электронного донора, циклическое фотофосфорилирование и нециклическое фотофосфорили-рование с феррицианидом или метилвиологеном в реакции Хилла.
С помощью иммунохимии было показано ( Schmid et ai, 1976), что еще один белковый компонент^полипептид II 000 дальтон,участвующий в фотосинтетическом электронном транспорте на участке разложения воды фотосистемы П, локализован на наружной стороне мембраны. Эта точка зрения противоречит представлениям других авторов о топологии фотосистем в тилакоидной мембране.
Специфичность, макромолекулярная природа антител, возмож -ность получить их против почти всех веществ, представляющих интерес для исследователя фотосинтетических мембран; подкрепляет надежду, что несмотря на ряд трудностей, их использование позволит получить существенную информацию о связи структуры и функции в таком удивительном преобразователе энергии, каким является хлоропласт, и позволит конкретизировать представление о биогенезе фотосинтетической мембраны.
Применение иммунохимических методов при сравнении мембран этиоплаотов и хлоропластов, а также их функциональных и структурных фрагментов позволяет прежде всего ответить на вопрос: содержит ли сравниваемые системы идентичные белковые компоненты, что немаловажно для конкретизации представлений о природе мембран и их сборке. Для большей убедительности полученных нами с помощью иммунохимии результатов мы старались по мере возможности подкрепить их другими биохимическими методами и литературными аналогиями.
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ 2.1. Объекты исследования
Работа проводилась с этиопластным и хлоропластным мембранным материалом разной степени дезинтеграции - от растворенного в тритоне Х-ЮО суммарного мембранного материала до отдельных комплексов, выделенных из него с помощью электрофореза или гель-фильтрации.
2.I.I. Мембраны пластид
В работе использованы десятидневные проростки ячменя ( Hordeum vulgare, сорт Винер), выращенные при освещении люминесцентными лампами с 12-часовым периодом или в полной темноте. Из таких листьев сначала выделяли хлоропласты (или этиопласты), а после обработки органелл ультразвуком - соответствующий мембранный материал.
Срезанные проростки ячменя измельчали миксером в двукрат -ном (по отношению к весу листьев) объеме 0,05 М трис-HCI буфера, рН 7,6, с добавками 0,4 М сахарозы, 0,002 М ЭДТА, 0,002 М /- меркаптоэтанола до образования гомогенной массы. Гомогенат отжимали через несколько слоев капроновой ткани для удаления грубых частиц и центрифугировали в течение 3 мин при 400g .Осадок клеточных стенок, ядер и других крупных фрагментов клеток отбрасывали, а пластиды осаждали из супернатанта центрифугированием при 1000 g в течение 10-15 мин. Осадок пластид промывали исходным буфером и после повторного осаждения при тех же условиях ресуспендировали в гипотонической среде (0,005 М трис-глициновый буфер с меркаптоэтанолом, рН 8,3) и озвучивали в течение 30 с при температуре 4С (22 кГц, 70 Вт/см). Мембранный
материал,осаждающийся при 144 000g (І ч) после обработки ультразвуком "., по-видимому, не содержал непрочно связанных с поверхностью мембраны белков.
2.1.2. Субмембранные фракции этиопластов и хлоропластов
Для выделения субмембранных фракций мембранный материал пластид растворяли 2%-ным тритоном Х-ЮО в трис-глициновом буфере, рН 8,3, после чего центрифугировали 30 мин при 22 000 g . Надосадочная жидкость, представляющая собой растворенную в детергенте фракцию пластидных мембран, разделялась электрофорезом на субмембранные фракции.
Диск-электрофорез проводили по Дейвису ( Devis,1964) в модификации Сафонова и Сафоновой ( Д969) в 7%-ном полиакри -ламидном геле. В каждую трубочку (1,2 х 6,5 см) вносили по 0,01 мл экстракта мембран (концентрация хлорофилла - 200 мкг/мл). Электрофорез продолжался около 2 ч при силе тока 4 мА. на одну трубочку. После окончания электрофореза гелевые блоки прокра -шивали 0,1%-ным раствором амидочерного, ,
Для определения содержания хлорофилла в субмембранных фракциях хлоропластных мембран окрашенные зоны вырезали из предварительно замороженных гелевых столбиков и растирали в пятикратном объеме буфера, из которого пигменты переводили сначала в
80% ацетон, а затем серный эфир. Протохлорофиллид элюировали аналогичным образом из субмембранной фракции этиопластов (элек-трофоретическая зона желтого цвета). Ацетоновую вытяжку подщелачивали аммиаком до рН 8-9. Каротиноиды и протохлорофилл отмывали гексаном или петролейним эфиром (40-70). Протохлорофиллид, оставшийся во фракции водного ацетона, переводили в растворимую форму подкислением среды до рН 4,5-5,0 с помощью насыщенного
раствора NaH^PO^ и извлекали пигмент серным эфиром. Спек -тральные характеристики субмембранных фракций получали путем спектрофотометрирования и спектрофлуорометрически.
2.1.3. Пигмент-белковые комплексы хлоропластных мембран Для выделения пигмент-белковых комплексов использовали три различные электрофоретические системы.
Пигмент-белковые комплексы хлоропластных мембран и проблемы их сборки
В последние годы с помощью методов препаративной биохимии достигнуты значительные успехи в воспроизведении реакций фотосинтеза вне целого хлоропласта. К важнейшим достижениям следует отнести разделение хлоропластов на пигмент-белковые комплексы, которые являются главными внутренними белками мембран и основными структурами, участвующими в фотосинтезе.
Выделение хлороплаотных компонентов со свойствами разных фотосистем впервые было осуществлено Бордманом в 1964 г. методом ДИффереНЦИалЬНОГО центрифугирования (Boardman, Anderson, 1964). Уже первые опыты с применением детергентов показали, что полученные с их помощью пигмент-белковые фрагменты хлоропластов неоднородны и различаются как по размерам частиц, так и по относительному содержанию в них составных элементов. Солюбилиза-ция хлоропластного материала высших растений детергентами разной природы приводит к отщеплению прежде всего менее прочно связанных с мембраной легких фрагментов, осуществляющих фотохимические реакции фотосистемы I. Более крупные частицы хлоропластов ОбыЧНО Обогащены фОТОСИСТеМОЙ П ( Boardman, 1968, 1970). Наиболее успешным оказалось применение неионных детергентов - дигитонина и тритона Х-100. Именно с их помощью удалось выделить пигмент-белковые частицы, сохраняющие многие свойства целых хлоропластов, в том числе способность к переносу электронов при действии света (Островская и др.,1969; Гама-юяова и др.,1975;:Шутилова, 1976; Фрадкин,1982; Weasels et ai, 1973, 1975; Vernon et al, 1966,1972,1971).
Так, Весселс ( Wesseis ,1973), используя дигитонин, выделил с помощью центрифугирования в градиенте плотности сахарозы содержащие хлорофилл частицы фотосистемы I (Fj), частицы реакционного центра фотосистемы П (PI;J и светособирающего коми -лекса (Рщ). После очистки хроматографированием на ДЖЕ-целлюло-зе ( Wesseis,Barchert ,1975) была получена фракция Fj с высоким отношением хлорофиллов а и ь (8-Ю) и высокой активностью фотосистемы I. Фракция Рд имела сходное с Pj отношение хлорофиллов а и ь, не содержала в своем составе П OQ И обладала высокой активностью фотосистемы П. Фракция Рщ имела низкое отношение хлорофиллов а и ь (1,3-1,5) и не проявляла никакой фотосинтетической активности, на основании чего ее отнесли к светособирающему комплексу. Электрофоретическое разделение хло-ропластного материала, солюбилизированного дигитонином и рас-фракционированного в градиенте плотности, позволило получить частицы с различным отношением хлорофиллов а и ь ( Kok , Ru-rainski ,1971),аналогичные описанным выше.
Посредством электрофореза из солюбилизированных дигитонином хлоропластных мембран выделены 4 типа внутримембранных частиц, отличающихся химическим составом, спектральными, функциональными и метаболическими характеристиками, и осуществляющими все первичные процессы фотосинтеза (Фрадкин и др.,1980), и фракция, основным компонентом которой являются светособирающие комплексы, происходящие из лабильных частиц (Фрадкин и др., 1972,1973,1978). Внутримембранные частицы содержат дискретный набор более мелких компонентов, что позволяет рассматривать их как промежуточный уровень организации между более простыми пигмент-белковыми комплексами и целостной мембраной (Фрадкин и др.,1975,1976).
Применение тритона Х-ЮО для фрагментирования хлоропластов также позволило получить субмембранные частицы с разными свой ствами ( Briantais ,1966 Vernon et al. ,1966; Островская,1971,1972; Щутилова, Кутюрин,1975,1976 ). При солю билизавди мембран невысокими концентрациями детергента (0,05 и 0,2$) и последующем центрифугировании были выделены легкие час тицы с отношением хлорофиллов а и ь около 4,3 и тяжелые - с от ношением около 2,0 ( Briantais ,1967). Как крупные, так и мел кие фрагменты хлоропластных мембран соответствовали по спектрам поглощения и флуоресценции фрагментам, полученным с помощью дигитонина. Вернону с соавт. ( Vernon et al. ,1966,1967,1968/ удалось посредством дифференциального центрифугирования хлоро пластов, обработанных тритоном Х-100, выделить легкие частицы (так называемая тритоновая субхлоропластная фракция I), которые имели высокое отношение хлорофиллов а и ь и обладали свойствами фотосистемы I. Максимум поглощения хлорофилла в них находился в области 675 нм. Фракция таких фрагментов содержала цитохромы f и bg и была обогащена 3 - каротиноидами по сравнению с исход ными хлоропластами. Субхлоропластная фракция П отличалась низ ким отношением хлорофиллов а и ь (2,0) и высоким содержанием лютеина по сравнению с неразрушенными хлоропластами, она содер жала цитохром bggg и была фотохимически неактивна.
Применение антител в исследованиях молекулярной организации фотосинтетической мембраны
Активное использование антител в исследовании строения фотосинтетической мембраны началось с изучения локализации отдель -ных компонентов в цепи электронного транспорта. Такие данные сыграли большую роль в формировании представлений о структурной организации хлоропластов и их внутренних мембран. Техника иммунохимических исследований в применении, к изучению молекулярной организации мембраны была предложена Менке ( Menke, 1972 ) И БерцборНОМ С соавторами ( Berzl orn,Iiocau , 1977). В основе приемов,используемых этими авторами, лежит взаимодействие антител с гомологичным антигеном в нативной мембране: если антитела против специфического компонента, связываясь с ним в нативной мембране, подавляют активный центр фотохимической реакции, это свидетельствует о его доступности. В случае, если такой центр расположен внутри мембраны или на недоступной для антител стороне (внутри тилакоида), активность реакции оказывается неизменной.
Для того чтобы установить локализацию отдельных компонентов на внутренней или внешней стороне мембраны, широко использзпотся также реакции прямой и -непрямой агглютинации хлоропластов. Если компонент расположен на поверхности мембраны, то при добавлении соответствующих антител происходит прямая агглютинация хлоро -пластов. Если компонент расположен на внутренней недоступной стороне мембраны (внутри везикулы), агглютинация не происходит. В некоторых случаях исследуемый компонент может располагаться в углублении мембраны, тогда агглютинации не происходит, но ее можно достичь при использовании особого методического приема ( СоотЪа ,1976), который обеспечивает проникновение антител в углубления мембраны. Антитела, таким образом, используются как специфические связывающие реагенты (преципитирующие или агглютинирующие) или как специфические ингибиторы, блокирующие последовательность реакции в изучаемом участке.
Рентгеноструктурные исследования привели к заключению, что тилакоидная мембрана асимметрична и состоит из мономолекулярного слоя белков, прилегающего к наружной стороне мембраны, и внутреннего слоя липидов. Серологические исследования с белком сопрягающего фактора фосфоршшрования, РШК (Kannangara ,1970), ферредоксином ( Bohme ,1978 а) и четырьмя тилакоидными поли -пептидами ( Koenig et ai ,1976) подтвердили эту точку зрения. Однако позднее было показано, что антигенные детерминанты ферре-доксин-НАДФН-редуктазы и пластоцианина локализованы не на наружной поверхности тилакоида ( Bohme ,1978, в). После обработки дезоксихолатом и последующей гель-фильтрации была выделена хлорофилл-белковая фракция с молекулярной массой 600 000 дальтон, обладающая способностью восстанавливать метилвиологен с дихлорфенолиндофенол/аскорбатом в качестве электронного донора ( Koenig et ai,I977). Антитела к этой фракции, специфически адсорбирующиеся бесстромальными хлоропластами, не были в состоянии ингибировать ее функциональную способность до тех пор, пока хлоропласты не разрушались ультразвуком. Противоречили концепции модели фотосинтетической мембраны, вытекающей из рентгеноструктурного анализами серологические исследования с липидами: молекулы липидного слоя оказались доступными гомологичным антителам. Так, Радунц ( Radunz, Berzborn ,1970 ; Radunz ,1977) установил, ЧТО В Хлоропластах Anthirinum m. антигенные детерминанты моногалактозилдиглицерида., сульфохино-возилдиглицерида , фосфатидилглицерияа и тригалактолипида располагаются на наружной поверхности тилакоидной мембраны. Однако мембранные фрагменты, разрушенные ультразвуком, значительно лучше реагировали с сывороткой против тригалактолипида, чем необработанные хлоропласты. Из этих экспериментов следует, что три- и дигалактолипиды. расположены не только на наружной поверхности тилакоида, но также и внутри него. Сульфолипидная антисыворотка не реатаровала с эмульсией моно- или дигалактозилдиа-цилглицерола, лецитином или анион-фосфатидфосфатидил глицеро-лом. В экспериментах по агглютинации хлоропластов Anthirinum maius с антителами против сульфолипидов было показано,что определенные группы сульфолипидов доступны для антител в ла -меллярной системе хлоропластов, и в то же время некоторые МО -лекулы сульфолипидов локализованы внутри тилакоида ( Radunz , 1975,1976). Следует отметить, что антитела против сульфолииидов Anthirinun majua, полученные посредством иммунизации кроликов очищенными сульфолипидами, адсорбированными на метилированном бычьем сывороточном альбумине, реагировали с препаратами сульфолипидов из растений различных видов. В серологических экспериментах показано, что на наружной поверхности тилакоидной мембраны сине-зеленых водорослей Nostoc muscorum И Oscillator ia chaiybea локализованы лгатеин и неоксантин ( Schmid et аі Д977). Как следует из более ранних работ для высших растений, оба типа каротиноидов включаются в функционирование фотосистемы I. Антисыворотка к лютеину и неоксантину ингибиру-ет в обоих видах водорослей фотосинтетический электронный транспорт на участке разложения воды фотосистемы. П. Тилакоид -ная мембрана Anthirinum majus адсорбирует антитела против хлорофилла И ксантофилла ( Radunz et al ,1971; Radunz , 1978).
Иммунохимические методы, использованные при изучении биогенеза пластидных мембран
Иммунохимические методы, исследования предусматривают применение иммунных сывороток (антисывороток), получаемых из крови животных после введения им гетерогенного антигенного материала. Активность таких сывороток, обусловленная количественным содержанием в них антител и существенно влияющая на результаты, исследований, зависит от иммунологической реактивности животного, от способа введения, характера и дозы вводимого животному антигенного материала, количества инъекций и продолжительности периода иммунизации. Как правило, наиболее активно сыворотки получают в результате многократного введения антигена животному. Доза вводимого антигена зависит от степени его чистоты. Однако независимо от характера вводимого материала доза антигена не должна быть чрезмерно высокой, чтобы не вызвать антигенного перераздражения и угнетения выработки антител (Зильбер,1958,1962).
Выбор той или иной схемы иммунизации для получения антисывороток определяется прежде всего чувствительностью иммунологического метода, принятого в проводимом исследовании. Кроме того, для усиления иммунизаторного эффекта широко используют так называемые депонированные антигены, т.е. антигены, которые вводят животному в смеси с неспецифическими стимулирующими веществами: водномаслянои эмульсией, квасцами, хлористым кальцием и т.д. Действие таких депонированных антигенов основано на их медленном всасывании и, следовательно, на более продолжительном воздействии на организм.
Выбор схемы иммунизации определялся количеством вводимого животным материала. Иммунизацию кроликов субмембранными фракциями пластид проводили в лимфоузлы (іусев, Язова,1968; Володарский,1971): первая инъекция - в подколенные лимфатические узлы соответствующим материалом с адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1 (по 300 мкг белка в каждый лимфоузел); через месяц инъекцию повторяли тем же материалом, но без адъюванта, вводя антиген (из расчета 800 мкг белка на каждое животное) внутривенно, внутримышечно (передние лапы) и в область подколенных лимфоузлов задних лап. Второй способ иммунизации, который использовался при получении антисыворотки на мембранный материал пластид, протохло-рофиллид- голохром и полипептиды мембран, можно представить следующей схемой:
Приведенный в таблице способ иммунизации оказался в нашем случае эффективнее первого. Он позволил получить активные антисыворотки с более высоким содержанием антител против индивидуальных антигенов и использовать подопытных животных в качестве доноров в течение 4-6 месяцев без заметного снижения титра антител в их крови.
Кровь, взятую из краевой вены уха через семь дней после последнего введения антигена, выдерживали в термостате в течение часа при 37С, чтобы отделить плазму от фибриллярных бел -ков, образующих при этом сгусток. После инкубации при 4С в течение ночи, образовавшийся сгусток отделяли от стенок, декантировали сыворотку и очищали ее от осадка эритроцитов центрифугированием при IOOOg в течение 10-20 мин. Сыворотку исполь -зовали в иммунных тестах либо без изменений, либо выделяли из нее фракцию jf - глобулинов. Работа с выделенными иммуноглобулинами во многих случаях имеет преимущества по сравнению с использованием исходной антисыворотки. Так, в иммунологических исследованиях с окрашиванием иммунопреципитатов после завершения реакции антиген-антитело необходимо как можно более полно удалять посторонние липопротеины, которые усиливают окрашивание фона. При применении чистых иммуноглобулинов процесс отмывки упрощается.
Для выделения f -глобулина (Харбоу, йнгильд ,1973) к 100 мл сыворотки добавляли 25 г сульфата аммония и оставляли эту смесь при комнатной температуре в течение 20 ч, затем центрифугировали при 4000g в течение 30 мин. При этом осаждалось около 98% антител. Осадок промывали 25 мл 1,75 М раствора сульфата аммония и вновь центрифугировали, повторяя эту процедуру один-два раза. Отцентрифугированная надосадочная жидкость содержала, как правило, альбумин, трансферрин, ъ- протеины, в том числе гаптоглобулин, а также свободный гемоглобин. К осадку, содержащему антитела, добавляли небольшое количество воды и диализовали его при 4С в течение 24 ч против дистиллированной воды, затем 24 ч против буфера рН 5,0, содержащего 0,05 М ацетата натрия и 0,021 М уксусной кислоты, затем вновь 24 ч против дистиллированной воды и 24 ч против ацетатного буфера. Поскольку диализ проводился при комнатной температуре в воду и в буфер добавляли I мМ азида натрия. Выпадающие в осадок в ходе диализа липопротеины удаляли центрифугированием. Суперна-тант, содержащий иммуноглобулины, использовали в дальнейшей работе.
Роль пигментных компонентов пластидных мембран в перекрестных серологических реакциях
Для изучения биогенеза фотосинтетической мембраны мы использовали антитела, выработанные на мембранный материал этио-пластов и хлоропластов, а также выделенные из них комплексы. Вполне естественным казалось начать работу с изучения антигенной структуры мембран обоих типов пластид, а затем провести их иммунохимическое сравнение, что позволило бы сразу ответить на вопрос, имеются ли в составе полностью сформированной фотосинтетической мембраны компоненты, характерные для мембран этиолированных пластид. Только пололштельныи ответ на этот вопрос мог создать основу для ее продолжения на уровне отдельных мембранных компонентов.
Как уже отмечалось в литературном обзоре, физико-химические подходы, используемые при изучении свойств отдельных компонентов фотосинтетических мембран, в основном предусматривают предварительное растворение их при помощи детергента. Детергент должен удовлетворять ряду требований: разрушать мембрану, удерживая белки в растворе, но оставлять неизменной их антигенную структуру и не оказывать влияния на фотохимическую активность получаемых после солюбилизации фрагментов мембран. Перечисленным требованиям в значительной мере удовлетворяют неионные детергенты. В водных растворах они хорошо со-любилизируют мембраны, практически не влияя на реакцию антиген-антитело и даже на конформационше свойства белков (Kirkpatrick, :)973 ).
При одинаковых "условиях обработки неионным детергентом тритоном Х-100 обнаружены некоторые различия в степени солюби-лизации этиолированного и хлоропластного мембранного материала: хлоропластные мембраны хорошо растворялись в 2%-ROM тритоне Х-100, а мембраны этиопластов при таких же условиях полностью растворить не удавалось. Возможно,это связано с наличием в препарате мембран этиопластов значительного количества нерастворимых в неионном детергенте компонентов проламелляряых тел небелкового происхождения. Для получения объективных дан. : ных об антигенной структуре мембран важно использовать такую концентрацию детергента, при которой исключена избирательная солюбилизация мембранного материала. Наши данные показали, что увеличение концентрации тритона свыше 2% не вызывало возрастания количества белка в экстракте из мембран этиопластов, т.е. не увеличивало степени их солюбилизации.
Известно, что количество белка, экстрагированного из мембран детергентами, зависит от взаимодействия молекул детергента с компонентами мембраны и друг с другом. Способность детергента связывать белок определяется содержанием его свободных молекул, не организованных в мицеллы. Тритон имеет низкую критическую концентрацию шщеллообразования, после достижения которой дальнейшее увеличение содержания детергента в растворе не приводит к возрастанию количества его свободных молекул и потому не способствует дальнейшей экстракции белка из мембран. Результаты наших экспериментов позволяют предполагать, что насыщение мест связывания детергента с белком наступает при использовании 2%-вото тритона.
Солюбилизированный тритоном мембранный материал этиопластов содержал протохлорофилловый пигмент, преимущественно его бесфитольнута форму, что было установлено с помощью спектров поглощения и флуоресценции после разделения пигментов экстракцией растворителями разной плотности по (Калер и др.,1965), Следует отметить, что основная часть протохлорофиллового пигмента этиолированного листа (не менее 80$) неизбежно теряется при процедуре выделения этиопластов и мембран. Экстракция связанного с мембраной протохлорофиллид-белкового комплекса 2%-ным тритоном (в сочетании с обработкой ультразвуком) приводила к почти полной потере способности к фотовосстановлешго эндогенного протохлорофиллида. Хяоропластные мембраны содержали обычный набор хлорофилловых пигментов и каротшюидов, характерный для полностью зеленых листьев. Изучение антигенного спектра растворенного в 2$-ном тритоне мембранного материала этиопластов и хлоропластов проводили иммунодиффузионным методом в слое агара. В месте встречи фронтов диффузии каждого антигена с гомологичным антителом (зона эквивалентности) образуется полоса преципитации. Расстояние полос преципитации от центров диффузии антигенов и антител определяется скоростями диффузии веществ, которые,в свою очередь, зависят от константы диффузии и концентрации реагентов в исследуемых препаратах. При этом количество дискретных полос преципитации соответствует минимальному числу пар антиген-антитело, участвующих в реакции. Метод позволяет в одном опыте сравнить разные антигенные системы и по расположению линий преципитации судить о степени их родства: слияние линий, принадлежащих разным системам, свидетельствует о тождестве антигенов, пересечение - об их различии. Иногда линии преципитащи сливаются частично, образуя так называемую "шпору". В таком случае говорят о частичном серологичнском родстве сравниваемых антигенов, но не об их идентичности.
Похожие диссертации на Биогенез пигмент-белковых комплексов хлоропластов ячменя
