Введение к работе
Актуальность работы.
Мультигемовые цитохромы с широко распространены в прокариотических организмах и выполняют в них разнообразные функции, связанные с переносом электронов в окислительно-восстановительных реакциях. Эти белки обеспечивают превращение различных субстратов в энергетическом и пластическом обмене клетки, участвуют в создании трансмембранного протонного градиента, сопряженного с синтезом АТФ, выполняют защитную функцию, превращая токсичные продукты деятельности организма в безопасные и легко удаляемые из клетки вещества.
Пятигемовые цитохром с нитритредуктазы (NrfA), осуществляющие респираторную аммонификацию нитрита, были выделены из многих групп бактерий, где они являются конечным звеном в процессе создания трансмембранного протонного градиента в ходе диссимиляторного восстановления нитрата до аммония. Также эти белки участвуют в детоксикации клетки от нитрита, гидроксиламина, оксида азота и пероксида водорода. Все выделенные и охарактеризованные аммонифицирующие нитритредуктазы являются высокогомологичными и обладают набором специфических признаков, позволяющих объединить их в отдельное семейство. К этим признакам относятся наличие пяти гемов с на мономер белка, присутствие в аминокислотной последовательности мотива СххСК, связывающего каталитический гем, высокая консервативность остатков, образующих активный центр и каналы транспорта субстрата и продукта реакции, образование димерной формы с возможностью прямого переноса электронов между гемами субъединиц.
Объектом настоящего исследования являются два гомологичных восьмигемовых цитохрома с с уникальной структурой, выделенные из близкородственных хемотрофных галоалкалофильных гаммапротеобактерий рода Thioalkalivibrio и обладающие высокой нитритредуктазной активностью. Многие черты этих белков, такие как строение каталитического домена, наличие гем-связывающего мотива СххСК, устройство активного центра, способность аммонифицировать нитрит с высокой эффективностью без высвобождения промежуточных продуктов, указывают на их родство с ранее описанными респираторными пятигемовыми цитохром с нитритредуктазами. Однако другие детали: содержание восьми гемов с на субъединицу белка, образование стабильного гексамера и связанная с ним уникальная схема транспорта продукта реакции, образование дополнительной связи Туг - Cys в активном центре, наличие уникального по структуре N-концевого домена позволяют выделить эти белки в отдельное семейство восьмигемовых нитритредуктаз.
Помимо значительного сходства с NrfA, оба белка имеют некоторые общие черты с другими восьмигемовыми оксидоредуктазами, осуществляющими, например, окисление гидроксиламина или восстановление тетратионата. Согласно современным представлениям, эти группы эволюционно связаны друг с другом и происходят от пятигемовых нитритредуктаз. Восьмигемовые нитритредуктазы, по-видимому, представляют переходное звено между данными семействами ферментов, соединяя в себе признаки, присущие разным группам.
В настоящее время, функции восьмигемовых нитритредуктаз в клетках Thioalkalivibrio не установлены. Предположение об их участии в респираторном восстановлении нитрита опровергается тем фактом, что обе бактерии не способны использовать нитрит в качестве акцептора электронов в бескислородном дыхании. Так же представляется маловероятным участие белков в образовании аммония для клеточного синтеза, поскольку одна из двух бактерий не способна к росту на нитрите в качестве источника азота. Использование представителями рода Thioalkalivibrio разнообразных соединений серы в качестве доноров электронов с промежуточным накоплением значительных количеств элементарной серы в периплазме, позволяет предположить участие данных белков в катаболизме серы. Также возможно их участие в детоксикации клетки от экзогенного нитрита, образующегося в бактериальных сообществах соленых щелочных озер.
Изучение восьмигемовых нитритредуктаз позволит установить связь пространственной организации ферментов, их природной функции, эволюцию семейств гем с содержащих оксидоредуктаз, выявить связи циклов серы и азота в пределах одного организма. Отдельный интерес представляет исследование механизмов адаптации белков к экстремальным природным условиям обитания организмов в соленых щелочных озерах, поскольку для галоалкалофилов этот вопрос практически не изучен.
Ранее в лаборатории инженерной энзимологии Института биохимии РАН была охарактеризована восьмигемовая цитохром с нитритредуктаза TvNiR из бактерии Thioalkalivibrio nitratireducens. В настоящей работе мы впервые представляем данные о гомологичном белке (TvPaR) из бактерии Thioalkalivibrio paradoxus. Целью работы является сравнительное структурно-функциональное исследование двух восьмигемовых нитритредуктаз из близкородственных галоалкалофильных бактерий рода Thioalkalivibrio, sl также анализ структурных механизмов адаптации белков к функционированию в условиях двойного давления высоких концентраций солей и высоких рН. Особое внимание уделялось возможной функции восьмигемовых нитритредуктаз в клетке. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
Выделить восьмигемовую нитритредуктазу TvPaR из бактерии Tv. paradoxus, и охарактеризовать её физико-химические и каталитические свойства;
Установить аминокислотную последовательность TvPaR;
Получить кристаллы свободной формы и бинарных комплексов TvPaR с субстратами и ингибиторами, пригодные для рентгеноструктурного анализа;
Определить пространственную структуру TvPaR методом рентгеноструктурного анализа и провести сравнительный анализ структур восьмигемовых нитритредуктаз из бактерий Tv. paradoxus и Tv. nitratireducens;
Охарактеризовать роль олигомерной структуры восьмигемовых нитритредуктаз в катализе и стабилизации молекулы;
Охарактеризовать экспрессию TvPaR и TvNiR в клетках на разных стадиях роста в различных условиях;
7. Проанализировать первичные структуры гомологичных восьмигемовых нитритредуктаз из галоалкалофильных и нейтрофильных бактерий с целью установления механизмов адаптации белков к экстремальным условиям функционирования. Научная новизна
Впервые выделена и охарактеризована восьмигемовая нитритредуктаза TvPaR из
галоалкалофильной облигатно хемоавтотрофной гаммапротеобактерии
Thioalkalivibrio paradoxus. Показано, что фермент обладает нитрит-, гидроксиламин-и сульфитредуктазной активностью. Охарактеризовано влияние факторов, связанных с условиями обитания бактерий, на активность TvPaR.
Установлена первичная структура TvPaR. Получены кристаллы свободной формы и комплекса TvPaR с субстратом-сульфитом, пригодные для рентгеноструктурного анализа; установлена пространственная структура свободной формы TvPaR и комплекса с сульфитом, проведен сравнительный анализ структур TvPaR и TvNiR. Показано, что все основные структурные особенности TvNiR, отличающие ее от пятигемовых нитритредуктаз, оказались присущими и TvPaR.
Показано, что олигомеризация TvNiR (TvPaR) с образованием гексамера не влияет на активность, но повышает стабильность фермента. Максимальная стабилизация достигается в условиях высокой концентрации солей, что может иметь функциональное значение для ферментов, локализованных в периплазме галоалкалофильных бактерий Tv. nitratireducens и Tv. paradoxus.
Показано, что TvPaR и TvNiR синтезируются в клетках Tv. nitratireducens и Tv. paradoxus в условиях анаэробного и аэробного культивирования. В обоих случаях TvNiR и TvPaR являются одним из основных растворимых белков клетки.
Анализ аминокислотных последовательностей гомологичных белков из галоалкалофильных и нейтрофильных негалофильных бактерий показал, что эти белки, обладающие высокой гомологией функциональных участков, представляют отдельное семейство восьмигемовых нитритредуктаз. Основным фактором адаптации структуры восьмигемовых нитритредуктаз к функционированию в условиях высоких рН и солености является снижение содержания лизина и повышение содержания кислых аминокислот. Личный вклад автора
Выделение, очистка и кристаллизация TvPaR, характеристика каталитических свойств TvNiR и TvPaR, исследование роли олигомерной структуры TvNiR и TvPaR, эксперименты с клетками, анализ механизмов адаптации выполнены автором. Рентгеноструктурные эксперименты и расчет структур TvPaR выполнены к.ф.-м.н. К.М. Поляковым и к.х.н. А.А. Трофимовым. Нуклеотидная последовательность гена TvPaR определена в НИЦ "Курчатовский институт" к.б.н. Ракитиной Т.В. Научно-практическая значимость работы
В настоящей работе в качестве объекта исследования выбраны ферменты из серуокисляющих, облигатно хемоавтотрофных бактерий рода Thioalkalivibrio, которые доминируют в бактериальных сообществах донных отложений гиперсоленых
содовых озер с концентрацией ионов Na до 4 - 4,5 М и рН до 10,6. Одним из возможных механизмов адаптации бактерий к экстремальным условиям обитания является изменение свойств белков - ключевых компонентов метаболических путей бактерий, обеспечивающих более эффективное превращение субстратов - источников биомассы и энергии. Этот тип адаптации делает бактерии - экстремофилы источником белков с уникальными свойствами. Структурно-функциональное исследование белков из экстремофильных организмов, анализ механизмов адаптации на уровне первичной и пространственной структуры позволит создать теоретическую базу для конструирования генноинженерных ферментов, обладающих высокой активностью и стабильностью в экстремальных условиях (рН, соленость, температура). Кроме того, бактерии рода Thioalkalivibrio являются доминирующим компонентом в промышленных биореакторах Thiopaq, являющихся успешной альтернативой «грязных» химических технологий очистки промышленных и природных газов от соединений серы. Поэтому глубокое понимание их метаболизма на уровне ферментов помогает лучше понять функционирование этих природных биокатализаторов в биотехнологии. Связь работы с государственными программами
Работа выполнена при финансовой поддержке Государственного контракта № 14.740.11.0632 «Ферменты цикла азота и серы галоалкалофильных серуокисляющих бактерий рода Thioalkalivibrio: структура, функция, механизмы адаптации к экстремальным условиям функционирования», выполняемого в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы».
Апробация работы Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих международных конференциях: "The 8th European Symposium of The Protein Society" (Zurich, Switzerland, 2009), "13th International conference on the Crystallization of Biological Macromolucules" (Dublin, Ireland, 2010), "3rd Latin American Protein Society Meeting" (Salta, Argentina, 2010). Публикации По материалам диссертационной работы были опубликованы 3 статьи в рецензируемых журналах и 3 тезисов конференций.
Объем и структура работы Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 213 ссылок. Работа изложена на 167 страницах, содержит 64 рисунка и 16 таблиц.
