Введение к работе
Актуальность темы. Устойчивость насекомых к патогенным микроорганизмам и продуктам их жизнедеятельности обусловлена хитинизированными покровами, скоординированным взаимодействием биохимических механизмов с деятельностью клеточных структур гемолимфы, жирового тела и кишечника, выстланного перитрофической мембраной, а также особенностями структуры и функционированием генома.
К настоящему времени изучены и описаны основные биохимические защитные механизмы насекомых. Часть из них базируется на индукции протеолитических каскадов, приводящих к меланизации и коагуляции гемолимфы при ранении, а также продукции активных кислородных метаболитов и сигнальных молекул, в том числе участвующих в распознавании антигенов (Marmaras et al., 1996; Teopold et al., 2004; , , 2005; et al, 2006; , 2007). Существуют системы, продуцирующие биологические восстановители и активированные глюкозиды, агглютинины с различной углеводной специфичностью, участвующие в процессах распознавания ( , 2002; Галактионов, 2004; Ottaviani, 2005), и набор антимикробных пептидов, обуславливающих бактерицидные и фунгицидные свойства гемолимфы (Черныш, 1998; Львов, Николенко, 1999; Bulet et al., 2004). Защитная система, опосредованная клетками гемолимфы, участвует совместно с гуморальными факторами в фагоцитозе, синтезе антимикробных пептидов, а также в гистолизе и гистогенезе в процессе метаморфоза (Глупов, 2001; Гайфуллина и др., 2004). Таким образом, данные биохимические системы насекомых принимают участие не только в защитных процессах, но и регуляции онтогенеза, что, как считает ряд исследователей, обусловлено сугубо врожденными факторами (Leclerc, Reicchart, 2004).
Исследования последних лет опровергают сложившиеся представления о непреодолимой грани между врожденной и адаптивной защитной системой насекомых (De Gregorio et al., 2001; Eason et al., 2004). Основная проблема заключается в том, что до сих пор биохимические механизмы устойчивости насекомых к патогенным микроорганизмам изучались без учета их метаболической взаимозависимости и онтогенетических особенностей функционирования. В то же время наличие адаптивного ответа у насекомых допускает возможность существования специфичных и долговременных биохимических защитных реакций. Эти процессы должны быть связаны с онтогенетическими особенностями насекомых, поскольку личинка кардинально отличается от взрослой особи. Они, как правило, занимают разные экологические ниши, имеют различную пищевую специализацию, а также продолжительность существования, что может играть важную роль в функционировании биохимических механизмов и факторов, опосредованных гемоцитарной защитой.
Следует отметить, что для изучения перечисленных аспектов необходима новая модель эксперимента. Она должна базироваться на изучении динамики общих биохимических и клеточных защитных реакций насекомых на начальном этапе инфекционного процесса, использовании патогенного препарата общего типа действия (для чего был использован битоксибациллин), естественном способе заражения насекомых, применении патогена в дозировках и степени вирулентности, не вызывающих глубоких патологических изменений в организме насекомого, а также с учетом стадий онтогенеза. Эти особенности модели не всегда учитывались в исследованиях последних лет (Ekengren, Hultmark, 2001; Tzou et al., 2001; et al, 2005; Sorensen et al, 2005).
Энтомопатогенные кристаллофорные бактерии Bacillus thuringiensis антагонистичны для многих видов насекомых. На основе различных штаммов Bac. thuringiensis создан широкий спектр микробиологических препаратов, в том числе битоксибациллин, который содержит жизнеспособные споры бактерий и продуцируемый ими экзотоксин (Смирнов и др., 1982; Кандыбин, 1989). Практика применения данного препарата в системе защиты от насекомых-вредителей способствует появлению устойчивых особей с эффективными механизмами распознавания и элиминации патогенных бактерий.
Не менее важны онтогенетические и другие условия функционирования биохимических защитных механизмов и для прикладных исследований. В процессе поиска и практического применения, биологически активных в отношении насекомых веществ, часто не учитываются условия формирования защитных реакций, предшествующие контролируемой стадии эксперимента. Это замечание можно отнести к изучению южных подвидов медоносной пчелы, интродуцированных в климатические условия средней полосы России. По аналогичной причине пока не увенчались успехом попытки разработки препаратов на основе хитозана для пчеловодства (Албулов, 2008).
Ранее в исследованиях биохимических защитных механизмов насекомых, как правило, использовались иные методологические подходы, связанные с инъекционными способами введения и/или заведомо высокими концентрациями препаратов. На фоне торможения защитных реакций сформировалось представление о неспособности насекомыми формировать адаптивный ответ (Флоренсов, Пестова, 1990; Vidal et al., 2001; Hultmark, 2003). Сохраняются суждения об исключительной роли отбора особей с наиболее успешной реализацией защитных систем в возникновении устойчивых популяций насекомых. Роль иммунизации при этом считается несущественной, в том числе в силу малой продолжительности жизни насекомых.
Результаты отдельных исследований можно рассматривать как принцип формирования адаптивного ответа к конкретному патогену (Kurtz, 2005; Gaifullina et al., 2005). Более того, в последние годы появились сообщения, свидетельствующие о трансгенерационной передаче индуцированного адаптивного ответа у общественных насекомых, высказываются предположения о возможных механизмах данного явления (Moret, Schmid-Hempel, 2000; 2001; Sadd et al., 2005). Тем не менее, до сих пор не раскрыты онтогенетические условия формирования подобного феномена, возможно, раскрывающего исключительные возможности насекомых к формированию широкого спектра устойчивости в короткий эволюционный период (Марков, 2006; Колчанов, 2007).
Таким образом, изучение вопросов онтогенетических и внутривидовых особенностей реализации биохимических защитных реакций, метаболической взаимозависимости компонентов данных систем, возможности преадаптации насекомых, условий формирования долговременных биохимических защитных реакций и возможности их трансгенерации может изменить общее представление о механизмах биохимической устойчивости насекомых к неблагоприятным факторам среды, обеспечивающих адаптивную пластичность видов класса Insecta.
Цель данной работы заключалась в выявлении онтогенетических закономерностей реализации биохимических защитных механизмов при действии битоксибациллина у насекомых с полным типом превращения. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Разработать новую модель эксперимента для изучения экзогенных воздействий на насекомых, охарактеризовать на этой основе реализацию основных биохимических защитных реакций насекомых, в том числе определить временные рамки фаз их развития.
-
Определить онтогенетические особенности формирования биохимических защитных реакций насекомых при действии битоксибациллина.
-
Выявить внутривидовые особенности формирования биохимических защитных реакций и оценить возможность использования биохимических параметров для характеристики состояния пчелиных семей.
-
Оценить возможность иммунизации насекомых и их способность к развитию долговременной иммунной памяти на основе биохимических защитных механизмов, особенностей их онтогенетического формирования.
-
Охарактеризовать онтогенетические особенности влияния биологически активных для насекомых веществ на функционирование биохимических механизмов защиты и перспективы их применения в качестве адаптогенов.
-
Оценить влияние критических периодов в онтогенезе насекомых на активацию биохимических защитных систем и долговременность их реакции.
-
Определить роль критических периодов в проявлении эффекта трансгенерации биохимических защитных реакций в ряду поколений насекомых.
Научная новизна. Выявлена тесная взаимосвязь антиоксидантной и фенолоксидазной систем в формировании начального этапа реализации защитных реакций у насекомых. Выявлены онтогенетические различия в проявлении биохимических защитных реакций и их связь с клеточными структурами гемолимфы насекомых. Это проявляется в преобладании на личиночной стадии неспецифических, а на имагинальной - специфических биохимических механизмов. Доказана возможность преадаптации насекомых воздействием нелетальными дозами битоксибациллина, выражающейся в стимулирующем влиянии на развитие защитных реакций и повышении выживаемости в целом. Показана возможность применения хитозана в качестве адаптогена для медоносной пчелы. Выявлена возможность формирования долговременной иммунной памяти насекомых. Показана значимость критических периодов онтогенеза насекомых в формировании долговременных защитных реакций, связанных с фазами стадий развития. Фенолоксидазная и антиоксидантная системы, участвующие в реализации устойчивости насекомых, многократно повышают свою активность при воздействии бактериальным препаратом в критические периоды развития. Показано, что индуцированная активность защитных реакций у личинок насекомых воспроизводится на последующих этапах онтогенеза, а также в последующих двух поколениях на той же стадии развития насекомого без дополнительного влияния индуцирующего фактора.
Практическая значимость. Получены данные по высокой биологической активности хитозана в отношении хозяйственно значимых насекомых, которая выражается в преадаптивном действии и во влиянии на скорость морфогенетических процессов, что было показано на медоносной пчеле и колорадском жуке. Применение хитозана в пчеловодстве или в области защиты растений рекомендовано с учетом нового регламента, основанного на четком определении физиологического статуса и стадий развития насекомых. Обоснована возможность использования начального этапа реализации биохимических защитных реакций в качестве тест-системы для диагностики состояния пчелиных семей. На основе выявленных внутривидовых различий у медоносной пчелы в характере развития биохимических защитных реакций предложены биохимические критерии в качестве показателей адаптированности пчелиной семьи к климатическим условиям Урала.
Положения, выносимые на защиту:
-
Стадия онтогенеза и начальный этап воздействия битоксибациллином являются значимым моментом в определении преимущественного типа реализации биохимических реакций насекомых. Нейтрализация сублетальных доз патогенного препарата происходит за счет реактивации биохимических защитных систем, высоких доз битоксибациллина – посредством реакции защитного торможения биохимических процессов.
-
Воздействие битоксибациллином в сублетальной концентрации оказывает на насекомых иммунизирующее действие и способствует формированию, как кратковременных биохимических защитных реакций, так и долговременной иммунной памяти у продолжительно живущих особей. Иммунизация насекомых вносит вклад в развитие общей устойчивости популяций наряду с действием отбора.
-
Ключевыми моментами онтогенеза у насекомых с полным типом превращения являются критические периоды при переходе от личиночной стадии развития к куколке и от куколки к имаго. Критические периоды онтогенеза у насекомых характеризуются перестройкой многих функциональных систем организма, повышенной реактивностью биохимических защитных реакций и более высокой чувствительностью к внешним воздействиям.
-
Активность факторов защитных реакций, индуцированная в критические периоды онтогенеза, у личинок насекомых воспроизводится как на последующих этапах онтогенеза, характеризуя наличие долговременной иммунной памяти, так и в последующих поколениях насекомых на той же онтогенетической стадии, подтверждая трангенерационный эффект передачи индуцированных биохимических механизмов.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на конференциях «Изучение, рациональное использование природных ресурсов», (Уфа, 1991), «Biologically Active Polysaccharides», (Oslo, 1998), «Актуальные проблемы современной биохимии и биотехнологии», (Челябинск, 1999), 6th European Training Course on Carbohydrates, (Hungary, 2000), 4th Carbohydrate Bioengineering Meeting, (Stockholm, 2001), VI Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2002), «Экологические аспекты интенсификации сельскохозяйственного производства» (Пенза, 2002), на XII съезде Русского энтомологического общества (Санкт-Петербург, 2002), на III съезде Всероссийского Общества Генетиков и Селекционеров (Москва, 2004), на Межрегиональном совещании энтомологов Сибири и Дальнего Востока, (Новосибирск, 2006), на IX Всероссийском популяционном семинаре «Особь и популяция – стратегия жизни» (Уфа, 2006), на Международной конференции «Current Evolutionary Thinking in Biology, Medicine and Sociology» (Новосибирск, 2007), на XIII съезде Русского энтомологического общества (Краснодар, 2007), на III съезде Биохимического общества (С.-Петербург, 2002) и IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), на IX Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Ставрополь, 2008).
Публикации. Основные результаты исследований отражены в 22-х научных статьях, в том числе 16 в журналах, рекомендуемых ВАК.
Структура диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, характеристики объектов и методов исследований, экспериментальной части, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка используемой литературы (452 работы, в том числе 308 зарубежных). Работа изложена на 363 страницах, содержит 42 таблицы и 61 рисунок.
Личное участие автора в получении научных результатов. Личный вклад автора заключается в разработке идеи работы, в постановке и проведении экспериментов, в статистической обработке и интерпретации полученных результатов.
Благодарность. Выражаю благодарность коллегам по лаборатории биохимии адаптивности насекомых за конструктивные замечания, помощь и поддержку в выполнении данной работы.
Объекты и методы исследований.
В качестве объектов исследований были использованы одновозрастные личинки, куколки и имаго колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say. из природной популяции и комнатной мухи Musca domestica L. лабораторной линии Cooper, рабочие особи темной лесной Apis mellifera mellifera L. и серой горной кавказской Apis mellifera caucasica Gorb. медоносной пчелы, доставленные с пасеки республики Башкортостан. Условия содержания насекомых соответствовали специальным методикам ведения лабораторной культуры колорадского жука (Беньковская, 2001), медоносной пчелы и комнатной мухи (Салтыкова, 2000). Обработка биологических объектов адаптогенами (хитозан и аскорбиновая кислота), а также модельное воздействие в лабораторных условиях на насекомых битоксибациллином (БТБ), представляющим спорокристаллический препарат на основе Bacillus thuringiensis var. thuringiensis, проводили по методикам, разработанным Е.С. Салтыковой (2000), Л.Р. Гайфуллиной (2004). В экспериментах использовали гемолимфу, гомогенаты кишечника, нервных ганглиев, жирового тела, мышечной массы или целый гомогенат насекомого в зависимости от поставленных экспериментальных задач. Повторность экспериментов была не менее трех раз. Опыты включали по 3 биологических и аналитических повтора.
Приготовление клеточных препаратов гемолимфы производили фиксированием мазков 96%-ым этанолом и окрашиванием по методу Романовского-Гимзы (Кост, 1957). Типы форменных элементов гемолимфы определяли по классификации М.И. Сиротиной (1961). Титр и углеводную специфичность гемагглютининов гемолимфы насекомых определяли по D.Stynen (1982). Спектрофотометрическое измерение фенолоксидазной (ФО) активности проводили по Е.Ю. Животенко (1987), пероксидазной (ПО) активности – по А.Н. Бояркину (1951). Активность каталазы измеряли по методу В.М. Мерщиева [1990]. Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли по С. Чевари (1985). Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) измеряли по Н.В. Алексахиной (1979), удельную активность выражали в мкМ/мин/мг белка. Активность протеиназ и ингибиторов протеиназ (ИП) проводили по S. Saul, M. Sugumaran (1986), выражали в ед.акт./мин/мг белка. Количество ТБК (тиобарбитуровой кислоты) - реагирующих продуктов (МДА – малоновый диальдегид) определяли по Д.И. Стальной и др. (1977) и выражали в нМ/г ткани. Активность кислой фосфатазы (КФ) оценивалась по скорости гидролиза 2-нафтилфосфата (Филиппова, 1985). Содержание гликозоаминогликанов (ГАГ) определяли по П.Н. Шараеву (1987) в мг/г ткани. Активность тирозиназы, дифенолоксидазы (ДФО), супероксиддисмутазы и пероксидазы выражали приростом оптической плотности в минуту, в перерасчете на концентрацию белка (ед.акт./мин/мг белка), удельную активность каталазы выражали в нМ/мин/мг белка. Концентрацию белка определяли по О. Лоури (Lowry et al., 1951). Электрофорез молекулярных форм фенолоксидазы проводили в 7,5% полиакриламидном геле по системе B. Davis (1962). Выявление ферментативной активности на электрофореграммах осуществляли по Г.Ю. Раушенбах (1997).
Статистический анализ полученных данных проводили с использованием среднеарифметического значения, ошибки средней, доверительного интервала, дисперсионного анализа с применением критерия Фишера и непараметрического критерия Краскела-Уоллиса. Достоверность различия средних определяли по t-критерию Стюдента (Лакин, 1990). Статистическая обработка результатов проводилась с использованием компьютерных программ StatSoft (Statistica 6.0).
