Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. Основные принципы адаптации биологических систем 7
1.2. Структура и функция холинэстсраз 16
1.3. Молекулярные формы холинэстсраз 38
1.4. Холинэстсразы гидробионтов 42
1.5. Характеристика района обитания объектов исследования 57
2. Материалы и методы исследования 64
2.1. Объекты исследования 64
2.2. Методы определения кинетических констант ферментативного гидролиза 68
2.3. Метод определения константы необратимого действия фосфор-органических ингибиторов 70
2.4. Метод определения констант обратимого ингибирования 70
2.5. Гель-хроматография холинэстсраз 71
2.6. Статистическая обработка результатов 71
3. Холинэстеразы мозга млекопитающих. Адаптация к нырянию 72
4. Адаптация к локомоции 79
4.1. Холинэстеразы мозга лососевых 79
4.2. Холинэстеразы мозга тресковых 87
4.3. Холинэстеразы мозга тихоокеанской сельди 96
5. Адаптация к гидростатическому давлению. Холинэстеразы мозга донных видов рыб 103
6. Механизмы адаптации эволгационно древних видов. Холинэстсразы мозга хрящевых и костистых рыб 126
7. Адаптация к условиям существования 132
7.1. Холинэстсразы кальмаров семейства Ommastrephidae 132
7.2. Холинэстеразы тихоокеанских головоногих моллюсков 139
7.2.1. Холииэстсразы кальмаров семейства Gonatidae 144
7.2.2. Холииэстсразы командорского кальмара. Механизмы внутривидовой адаптации 156
7.3. Адаптация холииэстераз ракообразных 190
7.4. Адаптация холииэстераз гемолимфы двустворчатых моллюсков 200
8. Адаптация к температуре 212
8.1. Холииэстсразы микроорганизмов 212
8.2. Холинэстеразы мозга рыб семейства карповых 219
Заключение 227
Выводы 245
Список литературы 248
- Основные принципы адаптации биологических систем
- Методы определения кинетических констант ферментативного гидролиза
- Холинэстеразы мозга лососевых
- Холинэстсразы кальмаров семейства Ommastrephidae
Введение к работе
Адаптация - одно из наиболее общих и широко применяемых биологических понятий. Именно благодаря своей широте и многоплановости проблема адаптации утратила четкие границы. Между тем общие закономерности адаптивных процессов, очевидно есть.
Построение общей теории адаптации потребует установления общих закономерностей адаптивных процессов на всех уровнях биологической организации. Если такие закономерности будут установлены, то пути становления и развития биологической организации получат новое освещение, расширятся возможности прогнозирования эволюции отдельных видов и экосистем.
Формы адаптации, как биологического явления, многообразны, как и многообразны подходы к ее изучению. В современной биологии накоплено огромное количество материала, посвященного описанию адаптации организмов к различным условиям обитания. Как правило, проблема адаптации решается методами классической, «описательной», биологии. Между тем любые изменения физиологии и морфологии организмов имеют биохимическую основу, а биохимические адаптации не менее разнообразны, чем внешние адаптивные признаки.
Известны работы по проблемам стратегии биохимической адаптации (Хочачка, Самсро, 1977, 1988), посвященные оценке влияния отдельных факторов среды в постановочных опытах (температура, рН, осмотическое давление и т.д.) на конкретные ферменты обмена и дыхания. Выбор биохимических объектов для экологических исследований не всегда оправдан, так как их свойства могут зависеть от физиологического состояния животного.
Другим направлением в современных экологических исследованиях являются работы, посвященные оценке влияния ухудшающихся условий существования па функционирование живых систем. Использование при этом биохимических маркеров (глутатион, мсталлотсонсины, каратиноиды, фер-
5 менты углеводного обмена и т.д.) позволяет оценить степень клеточного повреждения под влиянием неблагоприятных факторов среды (Лукьянова, 2001).
Современный уровень развития естествознания убедительно доказывает, что в основе всех приспособительных изменений биологических систем лежат молекулярные процессы (Davies, Kratzer, 1996). В первую очередь на флюктуации параметров внешней среды реагируют ферменты. Особое место среди ферментов занимают холинэстеразы (ХЭ), которые по важности выполняемых ими функций относятся к конститутивным ферментам, а их свойства не зависят от физиологического состояния особи (Ленинджср, 1976; Эпштейн, 1992). В связи с ключевой ролью холииэстераз в процессе передачи нервного импульса модуляция активности фермента под действием различных соединений издавна является предметом исследования фармакологов, токсикологов, биохимиков. Однако работы, посвященные холинэстсра-зам гидробиоитов, касаются в основном свойств фермента некоторых видов головоногих моллюсков и ограниченного количества рыб (Бресткин и др., 1997). В последние годы активно развивается направление использования холииэстераз при оценке степени загрязнения среды обитания гидробиоитов пестицидами (Caraville, 2000), фосфорорганическими соединениями (Рауепе et al., 1996) и солями тяжелых металлов (Somero, 1997). В то же время до настоящего исследования проблема определения механизмов биохимической адаптации холииэстераз гидробиоитов не исследовалась.
В связи с указанным комплексное исследование свойств холииэстераз гидробионтов (субстратной специфичности, субстратно-ингибиторных свойств и хроматофафнческих характеристик) различных таксономических рангов (млекопитающих, рыб, беспозвоночных) является актуальным. Установление закономерностей свойств холииэстераз от таксономического положения и среды обитания животного представляет интерес для науки и позволяет определить стратегию биохимической адаптации холинэргических систем у гидробионтов.
Целью исследования — комплексное изучение свойств холинэстсраз и использование кинетических характеристик ферментативного катализа для определения стратегии биохимической адаптации у гидробиоптов.
Основные принципы адаптации биологических систем
Явление адаптации относится к основным биологическим явлениям, свойственно всем живым существам и так или иначе проявляется на всех уровнях организации жизни. Именно в силу его общности определения адаптации даются с разных точек зрения и далеко не во всем совпадают у разных авторов. В самом общем значении адаптации (приспособления) часто понимают как соответствие условиям жизни, а выработку адаптации — как установление этих соответствий (Хайлов, 1967). До настоящего времени в биологии в определении адаптации преобладал организменный подход. Например: «Адаптации являются постоянно возникающими, изменяющимися, совершенствующимися и иногда исчезающими эволюционными приспособлениями организма к среде в самом широком понимании ...» (Тимофеев-Ресовский и др., 1969, с. 246). В данном случае явление адаптации определяется посредством другого термина (приспособление), являющегося синонимом первого.
Проникновение в биологию принципов системного исследования привело к выработке определения адаптации не только таких систем, как организм, но и иадорганизмснных систем - популяций, видов ценозов: «... можно определить адаптацию как сформированный в филогенезе целенаправленный механизм, обеспечивающий поддержание целостности живых систем, имеющих самостоятельное значение в эволюции» (Ушаков, 1963, с. 8). К таким системам автор относит ценотические, видовые, популяционные, семейно-стадные, орга-низменные и клеточные. Ряд исследователей (Шмальгаузен, 1961; Шкорбатов, 1967) понятие «целенаправленного механизма» предлагают заменить понятием функциональной устойчивости как одним из характерных свойств жизни. Адаптация в трактовке Г.Л.Шкорбатова (1971, с. 133) определяется как «совокупность реакций живой системы, поддерживающих се функциональную устойчивость при изменении условий окружающей среды».
В большинстве систем классификации адаптации отражено наличие двух основных групп адаптивных изменений: индивидуальных, индуцируемых условиями среды, и групповых, генетически детерминированных. Различия этих основных групп адаптации не абсолютны. Способность к индивидуальным адаптивным изменениям, границы приспособительных изменений организмов в отношении того или иного фактора генетически обусловлены, как и всякий другой признак. Исходя из этих представлений, можно принять, что в эволюционном плане каждая новая групповая адаптация вырабатывается в процессе естественного отбора как реакция надорганизменной системы (популяции, вида, ценоза) на изменение условий существования. Индивидуальные адаптации вырабатываются организмом в процессе онтогенеза тоже как реакции на изменение условий, но уже в пределах наследственно детерминированной физиологической пластичности организма.
Очень часто адаптации исходя из методов их исследования подразделяют па отологические, морфологические, физиологические, биохимические и другие группы. Подразделение это условно, так как трудно представить приспособительные изменения макроструктур организмов без определенных функциональных изменений в их тканях и органах, которые, в свою очередь, связаны с изменениями клеточных микроструктур и, в конечном счете, с конкретными изменениями биохимии клетки.
Г.Л.Шкорбатовым (1971) в качестве общего принципа классификации адаптации предложено использовать соответствие типов адаптации основным типам существующих в природе биологических систем, а именно: а) онтогенетических систем (организменный уро 9 вень организации), б) филогенетических систем (популяционно-видовой уровень организации), в) ценотических систем (биоценоти-ческий и экосистемпый уровни организации). Адаптации онтогенетических систем, часто именуемые акклимациями, характеризуются адаптивными изменениями поведения, структуры и функции в пределах нормы реакции вида. Осуществляются по типу конформаций, регуляций, латенций. Для них характерна полная обратимость. Механизмы их связаны с модуляцией активности ферментов, активацией и репрессией генов. Для адаптации филогенетических систем характерны групповые, генетически обусловленные адаптивные реакции. Адаптации такого типа практически полностью необратимы и связаны с перестройкой генотипов особей и генофонда популяции или вида под контролем естественного отбора. Адаптации цснотичсских систем имеют в своей основе постепенные количественные и качественные изменения структуры экосистем в результате климатических, антропогенных и других влияний, идущих по типу сукцессии.
Адаптации по их эволюционному значению могут быть подразделены на две группы: эволюционно-прогрессивные, связанные с активацией жизненных функций, и эволюционно-консервативные, обеспечивающие устойчивость к неблагоприятным воздействиям среды и массовость развития без повышения уровня организации (Шкор-батов, 1982). Последовательность возникновения некоторых типов адаптации является частью более общей проблемы эволюции факторов и механизмов эволюции. Из рассмотренных выше типов адаптации, присущих онтогенетическим системам, латенции, в широком понимании включающие инактивацию жизненных функций и формирование структур пассивной защиты, как более примитивные, возникли ранее конформаций и регуляций. Конформаций нельзя рассматривать как пассивный ответ на изменение абиотических факторов. Этот тип адаптации обеспечивает активную жизнедеятельность при изменении внутренней среды организмов, что требует сложных физиолого-биохимических реакций.
Наиболее совершенными и, очевидно, наиболее молодыми адаптациями являются регуляции и компенсации. Эти адаптации позволили создать в процессе естественного отбора наиболее активные и быстро эволюционирующие группы организмов.
Методы определения кинетических констант ферментативного гидролиза
При проведении межвидового сравнения в пределах одного рода (Оп-corhynchus) отмечаются значительные различия в величинах значений константы Михаэлиса (Km). Так, наибольшим значением величины Km для процесса гидролиза АТХ и БТХ характеризуется ХЭ кижуча, а для ПТХ — ХЭ горбуши. Наименьшим значением величины Km характеризуются: но АТХ -ХЭ горбуши (различия с другими ХЭ в 2-12 раз); по ПТХ - ХЭ кеты (различия с другими ХЭ 3-Ю раз); по БТХ - ХЭ нерки (различия с другими ХЭ в 38-270 раз).
Важной составляющей интегрального процесса взаимодействия фермента с субстратом является значение величины Vm/Km, в определенной мерс отражающей сродство субстрата к активному центру фермента. Из представителей рода Oncorhynchus наибольшим сродством к АТХ характеризуется ХЭ горбуши (преимущество перед другими ХЭ в 2,8-5,6 раза), а к ПТХ -ХЭ кеты и кижуча (преимущество в 2-4 раза). Отличительной степенью величины сродства к БТХ характеризуется ХЭ нерки: превосходство по сравнению с другими видами рыб рода Oncorhynchus составляет 44-69 раз. Однако следует отметить, что из всех исследованных рыб семейства лососевых наибольшим значением величины Vm/Km характеризуется ХЭ мозга семги: значение величины Vm/Km для ХЭ семги в 2,3 раза больше, чем для ХЭ нерки.
Таким образом, на основании проведенного исследования субстратной специфичности можно выделить отличительные черты ХЭ рыб семейства лососевых. Во-первых, все изученные ХЭ отличаются слабо выраженной субстратной специфичностью: скорость гидролиза субстратов практически не зависела от их структуры. Во-вторых, наибольшая активность фермента обнаружена в нервной ткани кижуча. По показателю удельной активности ХЭ мозга кижуча превосходит фермент из оптических ганглиев тихоокеанского кальмара. В-третьих, по субстратной специфичности ХЭ мозга чавычи отличается от всех ранее изученных ферментов. В доступной нам литературе нет описания фермента, не способного гидролизовать ПТХ и БТХ. В-четвертых, выявлены межвидовые и межродовые различия в свойствах ХЭ, что подтверждает тезис о видовой специфичности фермента, которая, по-видимому, зависит от особенностей экологии видов.
В связи с полученными данными по различиям в свойствах фермента рыб одного семейства представляло интерес сравнение свойств ферментов одного вида рыб, выловленных в одном году, но в различных частях видового ареала. Такое сравнение стало возможным провести на примере ХЭ мозга кеты, выловленной в Магаданской области (р. Тауй), Приморском крае (зал. Ольги) и Сахалине (р. Островка) в 2001 г. (табл. 12).
Во-первых, следует отметить, что ХЭ кеты из трех районов различались по кинетическим параметрам гидролиза субстратов. Так, ХЭ приморской кеты и кеты Магаданской области не катализировали гидролиз БТХ, а ХЭ кеты из Сахалина не гидролизовала ПТХ и БТХ. ХЭ мозга кеты из Приморья и Магаданской области характеризуются равными значениями величин удельной активности по АТХ и ПТХ, но различались в 7 раз по величине значения Km и в 3 раза но величине сродства для процесса гидролиза ПТХ.
Мозг кеты из Сахалина характеризуется в 2 раза меньшей (по АТХ) удельной активностью ХЭ и значением Vm по сравнению с ХЭ мозга кеты из Магаданской области и Приморья. В то же время достоверных различий по величине значений Km между изученными ХЭ кеты из разных районов не выявлено. Выявленные различия в величинах максимальной скорости гидролиза проявляются на меньшем (в 2,4-3,4 раза) значении сродства АТХ к ХЭ сахалинской кеты, чем для ХЭ кеты из Магаданской области и Приморья.
ХЭ мозга горбуши, выловленной в Магаданской области и на Сахалине в 2001 г., имеют различную субстратную специфичность: ХЭ мозга горбуши из Магаданской области не гидролизовала ПТХ и БТХ, в то время как ХЭ мозга сахалинской горбуши не гидролизовала только БТХ. Отмечается значительное преимущество ХЭ магаданской горбуши по величине удельной активности (в 4 раза) и максимальной скорости гидролиза ЛТХ (в 5 раз). Тем не менее при равенстве значений константы Михаэлиса (Km) ХЭ сахалинской горбуши характеризуется в 4,7 раза болыиим значением сродства к ЛТХ по сравнению с ХЭ магаданской горбуши. Одной из важнейших характеристик фермента является его чувствительность к действию необратимых ФОИ. При исследовании свойств ХЭ мозга лососевых предстояло ответить на вопрос: сколько холинэстераз содержится в нервной ткани рыб. Для выяснения этого вопроса нами применен метод субстратно-ингибиторного анализа - определение чувствительности ХЭ к различным по структуре ФОИ с использованием нескольких субстратов. В качестве ФОИ нами исследованы специфические ингибиторы БуХЭ (ДФФ) и АХЭ (ГД-42), а также ФОИ, проявивший наибольшую специфичность действия по отношению к ХЭ кальмаров (ЛГ-56). Полученные данные представлены в табл. 13.
Как видно из представленных в табл. 13 данных, величины бимолекулярной константы ингибирования кц для исследованных ФОИ практически не зависели от структуры субстрата только у ХЭ мозга кижуча. По-видимому, холинэстеразная активность мозга этого вида рыб обусловлена одним ферментом. В то же время величины кц но ДФФ для ХЭ горбуши и ХЭ кеты существенно зависели от природы субстрата. Кроме того, чувствительность ХЭ мозга кета к ЛГ-56 также зависела от природы субстрата. Таким образом, можно предположить, что нервная ткань горбуши и кеты гетерогенна по холинэстеразной активности.
Сравнительное исследование чувствительности ХЭ мозга рыб семейства лососевых к различным по структуре ФОИ позволило выявить ряд особенностей этих ферментов. Так, чувствительность ХЭ мозга изученных видов рыб к специфическому ингибитору БуХЭ была очень низка (субстрат -АТХ). Различия с «рсперным» ферментом составляли для ХЭ мозга кижуча пять порядков, а для ХЭ мозга семги - два порядка. Выявлены и значительные межвидовые различия в чувствительности ХЭ рыб к ДФФ. Наибольшую эффективность данный ингибитор проявлял по отношению к ХЭ мозга семги (кц= 1,2 10 ), наименьшую — кХЭ мозга кижуча (кц = 4,6 10 ).
Холинэстеразы мозга лососевых
Тихоокеанская сельдь (Clttpea pallasii Val,) относится к многочисленным, флюктуирующим видам рыб, широко распространенным в северной части Тихого океана. В Японском, Охотском и Беринговом морях она представлена тремя экологическими формами — морской, прибрежной, озерно-лагунной — и 34 популяциями, 8 из которых, корейская, сахалино-хоккайдская, зал. Петра Великого, охотская, гижигинско-камчатская, корфо-карагинская, анадырская, восточноберинговоморская, отнесены к морской форме. Сельдь морской формы всю жизнь проводит в соленой морской или океанической воде, придерживаясь прибрежной шельфовой зоны и нередко совершая в ее пределах довольно протяженные нагульные, зимовальные и нерестовые миграции (Науменко, 2001).
В северо-западной Пацификс морские сельди представлены несколькими популяциями, которые различаются биологическими, экологическими и морфологическими характеристиками, численностью, местоположением районов размножения. Нередко различные популяции смешиваются в периоды нагула или зимовки.
Среди морских сельдей имеется одна гигантская популяция, называемая сахалино-хоккайдской. Репродуктивная часть ареала в периоды пика ее численности простирается на многие сотни километров вдоль побережья о-вов Хонсю, Хоккайдо, Сахалин, Кунашир, Итуруп. В состав ее нагульного ареала входят водные пространства Японского, Охотского морей и части океана, прилегающей к вышеназванным островам. Следующая по значимости популяция — охотская. Протяженность ее репродуктивного ареала значительно меньше, чем Сахалин о-хоккайдской. В сезон летнего откорма охотская сельдь занимает всю западную часть Охотского моря, включая северо-восточное побережье Сахалина (Елкин, 1988; Радчен ко, Глебов, 1995). На следующей, с точки зрения промысловой значимости, ступеньке стоят гижигинско-камчатская, корфо-карагииская и восточноберинговомор-ская сельди. Гижигинско-камчатская сельдь обитает в восточной части Охотского моря, включая прнтауйский район, зал. Шслихова и западпокамчатскии шельф. На северо-западной окраине ареала она смешивается с охотской сельдью. Корфо-карагинская сельдь распространена в западной части Берингова моря. Она представляет единое стадо, лишенное каких-либо внутренних, более мелких, локальных или сезонных образований. За всю историю ее изучения не обнаружено устойчивых межрайонных различий в биологических и морфологических показателях (Максименков, 1979; Качина, 1981).
Восточнобсринговоморская сельдь локализована на обширном шельфе вдоль беринговоморского побережья штата Аляска. По ряду генетических и морфологических анализов, сопоставлению биологических показателей 11 строению чешуи была показана неоднородность ее популяции (Наумснко, 1979; Rowell, 1990). Ступенькой ниже стоят популяции, хозяйственное значение которых сравнительно невелико. К этой группе относятся корейская, де-кастринская и сельдь зал. Петра Великого. Области распространения их весьма ограниченны, протяженных миграций они не совершают. Весь их жизненный цикл протекает около берегов. Корейская сельдь обитает у южного и восточного побережий одноименного полуострова, сельдь зал. Петра Великого - у берегов Приморского края, де-кастринская - в северной части Татарского пролива вдоль материкового и островного (о. Сахалин) побережий.
Зоной обитания тихоокеанской сельди являются окраинные районы северной части Тихого океана. На материковой отмели, простирающейся вдоль азиатского побережья, она распространена непрерывно от Желтого (юго-западная оконечность п-ова Корея) и далее в Японском, Охотском, Беринговом морях вплоть до Берингова пролива. Каких-либо постоянных межпону-ляционных границ не существует, а если они и указываются, то нередко перекрывают друг друга. Встречается сельдь и на отмелях Командорских островов, Курильской, Алеутской гряд. У американского побережья сельдь обычна от п-ова Сыоард (Аляска) до Сан-Диего (Калифорния). Таким образом, се общий ареал почти соответствует границам Тихоокеанской бореаль-ной биогеографической области.
Нами изучены свойства холинэстсраз мозга сельди, выловленной в Беринговом (Анадырский залив), Охотском морях и в Татарском проливе (в районе г. Советская Гавань).
Из трех изученных ХЭ сельди только фермент мозга сельди, выловленной в Охотском море, катализировал гидролиз всех трех изученных субстратов (рис. 8). Кривые pS-зависимости имеют колоколообразную форму, что указывает на угнетение активности ферментов избытком субстрата. ХЭ мозга сельди из Охотского моря по всем параметрам холинэстеразного катализа отличалась от других ХЭ сельди (табл. 15). Во-первых, эта ХЭ гпдролизонала БТХ со скоростью (VOTH, %) в 2 раза большей, чем АТХ. Во-вторых, но сравнению с другими ХЭ сельди, ХЭ мозга сельди из Охотского моря харак 99 тсризустся в 40 раз более низким значением Vm и большими (в 52-68 раз) значениями величины константы Михаэлиса (Km) (сравнение по субстрату -ЛТХ). Тем не менее наибольшим значением величины сродства (Vm/Km) к АТХ характеризуется ХЭ мозга сельди из Татарского пролива, а к ПТХ - ХЭ мозга сельди из Берингова моря.
Основное выявленное отличие ХЭ мозга сельди из Охотского моря, по сравнению ферментом мозга сельди из других районов, в 6 раз большее содержание фермента в нервной ткани (величина удельной активности фермента) сельди из этого района.
Холинэстсразы кальмаров семейства Ommastrephidae
В 1941 г. появились данные о высокой активности ХЭ в зрительном ганглии атлантического кальмара Loligo pileali (Nachmansohn, Meyerhof, 1941). Показана высокая скорость гидролиза АХ, ниже пропионилхолина и ацетил-р-метилхолина, низкая (17 % от скорости гидролиза АХ) бутирилхо-лина и неспособность гидролизовать бензоилхолин, трибутирин, метилбути-рат (Bullock, Nachmansohn, 1942; Hoskin et аЦ 1959; Detbarn, 1963). Высокие концентрации АХ (20 Ю-2 М) тормозили активность этой ХЭ (Nachmansohn, Rothenberg, 1945).
Холиюстсразы различных видов кальмаров значительно различаются по удельной активности. Наивысшая активность фермента обнаружена в оптических ганглиях кальмаров сем. Ommastrephidae, среди которых «лидирует» Т. angolansis (1,4 Е/мг).
Генеральным направлением прогрессивной эволюции кальмаров подотряда Oegopsida - гектокотилизация. Кальмары сем. Ommastrephidae находятся на вершине этого процесса (Нигматулин, 1979). Представители этого семейства очень активные пловцы, развивают большие скорости при движении и даже выскакивают из воды, за что их называют «летающие кальмары». По-видимому, высокая физиологическая активность, подвижность и быстрота реакции на внешние раздражители способствовало появлению высоких концентраций ХЭ.
Исходя из концепции, высказанной ранее, и на основании данных по субстратной специфичности (см. табл. 4) и индивидуальности ХЭ (см. табл. 2) наиболее прогрессивным, по-видимому, считается подсемейство Todarodi-пае, род Todarodes. Что же касается в целом сем. Ommastrephidae, то его эволюция шла по двум направлениям: в подсемействе Ommastrephinae — создание двух ХЭ, а в Todarodinac (род Todarodes) - одной ХЭ.
В этом отношении интересно сопоставить данные: 1) субстратной специфичности, 2) активности и 3) гомогенности ХЭ нервной ткани кальмаров всех исследованных семейств. По первым данным наиболее примитивными видами являются представители сем. Onychoteuthidae, по вторым и третьим -Gonatidae. В общем, представители этих двух семейств - самые древние виды.
Для оммастрсфид вопрос об эволюционной продвинутости несколько сложнее. С одной стороны, данные по активности, подтверждают вывод систематиков, что эволюционно наиболее молодыми видами являются кальмары сем. Ommastrephidae, а данные об индивидуальности ферментов уточняют его: из оммастрсфид наиболее прогрессивно подсемейство Todarodinae, а с учетом всех других характеристик - род Todarodes, а из них, по-видимому, вид Т. angolansis.
При исследовании чувствительности ХЭ нервной ткани оптических ганглиев О. bartrami из четырех ареалов обитания было установлено (Шевцова и др., 1977), что величина бимолекулярной константы ингибирования к», определенная для нескольких ингибиторов (ЛГ-62, Гд-42, ГА-59, ГА-102) с использованием в качестве субстрата АХ, отличается от таковой по БуХ в 2,5-10,0 раза, а для ингибитора ДФФ - в 95-1200 раз (см. табл. 18). Данные факты являются подтверждением вывода о гетерогенности холинэстеразной активности нервной ткани этого вида кальмара. Выявленные факты не давали ответа на вопрос, являются ли различия в свойствах ХЭ гомогенатов ткани разным количественным соотношением индивидуальных ферментов (например, АХЭ и БуХЭ) или эти ферменты имеют качественные различия в каталитических параметрах каждого из ферментов гомогената для соответствующего ареала вида. Было высказано предположение (Эпштсйн, 1992), что различиям на подвидовом уровне должны соответствовать качественные различия у индивидуальных ХЭ, а ис количественные. Как показали исследования индивидуальности ХЭ с помощью ингибитора ДФФ (Шевцова, 1983) по методу, предложенному Г.М.Григорьевой, Н.Конычсвой (1979), в исходной ткани О. bartrami обнаружены две ХЭ: одна типа ЛХЭ, другая типа БуХЭ. Сравнение кинетических параметров субстратного гидролиза до и после действия ДФФ, а также бимолекулярных констант ktl по каждому субстрату показало сходство параметров индивидуальных ферментов юга Атлантики, но принципиальные различия в свойствах фермента как типа АХЭ (ДФФ — малочувствительная холинэстераза), так и типа БуХЭ (ДФФ — чувствительная холинэстераза) (см. табл. 2). Как и предполагалось, выявленные различия носят качественный характер. Одновременно была показана независимость всех полученных кинетических параметров от пола и стадии зрелости особей любого из изученных видов (Шевцова, 1983).
Анализ каталитических свойств ХЭ кальмара Бартрама из четырех ареалов обитания в Тихом и Атлантическом океанах показал, что особи из Южной Атлантики и Большого Австралийского залива (юг Тихого океана) характеризуются близкими кинетическими параметрами по всем исследованным ингибиторам, что позволяет предположить необособленность этих районов, а виды кальмара, обитающие в нем, составляют единую «южную» форму. Ареал этой формы циркумполярный и ограничен двумя течениями -Южным Пассатным на севере и течениями северных ветров на юге. По-видимому, кальмары с течениями проникают из Южной Атлантики в Индийский океан, а затем, в Большой Австралийский залив, который служит местом нагула этого вида кальмара. По мере роста и созревания кальмары вновь возвращаются в Индийский океан для размножения. Отличия «южных» форм от «северных» значительнее для тихоокеанских особей, чем для атлантических. Этот вывод коррелирует с историей формирования видового ареала. Кальмары из южной части ареала могли проникать в севсроатлантичсскую и северотихоокеанскую зону в эпоху оледенения через восточные районы Атлантики и Тихого океана (Зуев и др., 1975) во время отсутствия экваториального барьера высоких температур. По-видимому, последнее разъединение североатлантической и южной формы произошло позже, чем ссвсротихоокс 135 анской и южной, поэтому степень дивергенции свойств ХЭ в первом случае ниже, чем во втором.
Высказано предположение, что на основании биологического анализа (Зуев и др.,1985) и отличий в свойствах ХЭ кальмара О. bartrami из четырех частей ареала можно рассматривать как три географические формы (Шевцова, 1983).
ХЭ большинства исследованных видов кальмаров (исключение - О. banksi) с наибольшей скоростью катализировали гидролиз АХ. По этому показателю ХЭ кальмаров похожи на АХЭ эритроцитов человека (Абрамович и др., 1973) или АХЭ мозга (Бресткин, Певзнср, 1971). В то же время ХЭ зрительных ганглиев кальмаров с высокой скоростью катализирует гидролиз БуХ: скорость гидролиза БуХ составляла 59-81 % от таковой для АХ. По этому показателю ХЭ кальмара нельзя отнести к типичной АХЭ, которая не гидролизует БуХ. Фермент кальмаров, обладая свойствами как АХЭ, так и БуХЭ, занимает промежуточное положение в эволюционном отборе. Нельзя также исключить, что в ганглиях кальмара присутствует два фермента: один - эволюционно-молодой - АХЭ, второй - относительно древний — БуХЭ. Можно лишь высказать предположение, что он эволюционирует к более прогрессивной форме фермента — АХЭ, элиминируя фермент характеризующийся БуХЭ активностью (Бресткин и др., 1997).
Как видно на рис. 21, ХЭ кальмаров из разных семейств значительно различаются как по величине удельной активности, так и по зависимости активности фермента от значений кинетических параметров гидролиза субстратов. Причем эти различия отмечаются для кальмаров, обитающих в одних географических провинциях.
