Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Физиолого-биохимическая характеристика бактерий Macromonas bipunctata и Rhodopseudomonas palustris
1.1.1. Особенности метаболизма бесцветных серобактерий М. bipunctata Ю
1.1.2. Эколого-бйохимическая характеристика фототрофных бактерий R. palustris 10
1.1.3. Особенности генома R. palustris 12
1.1.4. Распространение и практическое значение исследуемых бактерий 14
1.2. Сравнительная характеристика МДГ из организмов различных таксономических групп 5
1.2.1. Способы получения высокоочищенных препаратов МДГ 15
1.2.2. Общая характеристика каталитического действия 16
1.2.3. Кинетические параметры 1?
1.2.4. Влияние концентрации ионов водорода 18
1.2.5. Влияние интермедиатов и ионов 19
1.2.6. Температурный оптимум 22
1.2.7. Особенности малатдегидрогевазной системы организмов, живущих в экстремальных условиях 23
1.2.8. Множественные молекулярные формы МДГ 26
1.3. Характеристика структуры молекулы малатдегидрогеназы 29
1.3.1. Анализ аминокислотного состава МДГ из различных объектов 30
1.3.2. Вторичная, надвторичная и третичная структурные организации белковой молекулы МДГ 36
1.3.3. Строение и механизм действия активного центра МДГ 41
1.3.4. Характеристика четвертичной структуры МДГ 43
1.3.5. Факторы, обеспечивающие стабильность и олигомерное состояние молекулы МДГ 45
1.3.6. Характеристика структуры гена МДГ 50
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 55
2.1. Цель и задачи исследования 55
2.2. Объекты и методы исследования^ 56
2.2.1. Объекты исследования 56
2.2.2. Методы исследования 56
2.2.2.1. Состав питательных сред для культивирования микроорганизмов 5 6
2.2.2.2. Определение активности ферментов 57
2.2.2.3. Определение количества белка 58
2.2.2.4. Выделение и очистка МДГ 59
2.2.2.5. Электрофоретические исследования 60
2.2.2.5.1. Аналитический электрофорез 60
2.2.2.5.2. Определение гомогенности ферментных препаратов 61
2.2.2.5.3. Специфическое проявление малатдегидрогеназы 61
2.2.2.5.4. Специфическое проявление изоцитратдегидрогеназы 62
2.2.2.5.5. Специфическое проявление изоцитратлиазы 62
2.2.2.5.6. Определение молекулярной массы субъединиц МДГ 62
2.2.2.6. Определение молекулярной массы нативного фермента 63
2.2.2.7. Ингибиторный анализ 64
2.2.2.8. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов^ 64
2.2.3. Статистическая обработка экспериментальных данных 65
2.3. Полученные результаты и их обсуждение 66
2.3.1. Влияние различных условий культивирования на активность МДГ и некоторых ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла у исследуемых микроорганизмов 66
2.3.1.1. Исследование активности ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла из R. palustris и М. bipunctata 66
2.3.1.2. Изоферментный состав некоторых ферментов из исследуемых бактерий 70
2.3.2. Получение гомогенных препаратов МДГ из бактерий родов Macromonas и Rhodopseudomonas 72
2.3.2.1. Очистка малатдегидрогеназы 72
2.3.2.2. Определение гомогенности ферментных препаратов 78
2.3.3. Физико-химические свойства МДГ 78
2.3.3.1. Определение молекулярной массы нативной МДГ из изучаемых объектов 78
2.3.3.2. Определение субъединичного строения МДГ ^ ^ 81
2.3.4. Кинетические и регуляторные характеристики МДГ 85
2.3.4.1. Влияние концентрации ионов водорода 85
2.3.4.2. Определение константы Михаэлиса 86
2.3.4.3. Определение константы субстратного ингибирования 89
2.3.4.4. Влияние интермедиатов и ионов на активность МДГ 95
2.3.4.5. Температурный оптимум 100
2.3.5. Функциональная роль изоформ МДГ у R. palustris 104
2.3.5.1. Зависимость четвертичной структуры МДГ от условий культивирования R.palustris Ю4
2.3.5.2. Влияние итаконата и малоната на соотношение димерной и 107
тетрамерной изоформ МДГ из пурпурных бактерий R. palustris
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 111
ВЫВОДЫ 115
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 118
- Физиолого-биохимическая характеристика бактерий Macromonas bipunctata и Rhodopseudomonas palustris
- Состав питательных сред для культивирования микроорганизмов
- Определение активности ферментов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Малатдегидрогеназный ферментный комплекс обеспечивает нормальное функционирование клеточного дыхания, перенос восстановительных эквивалентов, отток С4-углеродных скелетов на биосинтетические процессы. Кроме того, малатдегидрогеназа (МДГ, КФ 1.1.1.37.) участвует в протекании глюконеогенеза и является ферментом глиоксилатного цикла. Наличие в клетке различных процессов, связанных с функционированием одного фермента, требует сложной многоуровневой регуляции его активности.
К механизмам такой регуляции может относиться наличие в клетке изоферментов, обладающих отличными свойствами и кодирующихся разными генами (Ileana, Podesta, 2000; Kirby, 2000; Yoshikawa et. al., 2001). Эукариоты содержат множественные формы МДГ, вовлеченные в многочисленные метаболические пути и расположенные в различных клеточных компартментах (Kwak et. al, 1996; Hunter et. al, 2001; Yoshikawa et. al, 2001; Cox et. al., 2005). Так, в клетках эукариот димерный изофермент малатдегидрогеназы имеет митохондриальную локализацию и участвует в регуляции катаболизма (цикл трикарбоновых кислот, ЦТК), а тетрамерная МДГ, локализованная в цитоплазме или этиопластах, функционирует для обеспечения анаболических процессов клетки (Епринцев, Игамбердиев, 1995).
Для бактерий не характерен изоферментный полиморфизм, однако малатдегидрогеназа может существовать в виде полимерных изоформ с различной молекулярной массой. Так, для Beggiatoa leptomitiformis выявлено наличие изоформ малатдегидрогеназы, имеющих димерное либо тетрамерное строение, которые участвуют в различно направленных метаболических потоках и отличаются по кинетическим свойствам (Епринцев и др., 2004).
Особенностью метаболизма бактерий является то, что ЦТК независимо от условий роста выполняет конструктивную функцию, которая совмещена с энергетической при использовании органических субстратов в качестве единственного источника энергии (Ленгелер и др., 2005). Глиоксилатный шунт как анаплеротическая последовательность реакций строго необходим при росте микроорганизмов на ацетате для восполнения субстратов ЦТК, расходуемых на биосинтетические цели. Дискуссионным остается вопрос о функционировании шунта в условиях фотолитоавтотрофного роста при наличии активно действующего цикла Кальвина.
Наличие корреляции между присутствием или отсутствием глиоксилатного цикла и функционированием той или иной формы МДГ остается слабо изученным. Для решения вопроса о том, в каких условиях индуцируется глиоксилатный шунт, и связано ли это с образованием конкретной изоформы малатдегидрогеназы, использовали в качестве модели бактерии Rhodopseudomonaspalustris uMacromonas bipunctata.
Давно известно, что у фототрофных анаэробов, таких как Rhodobacter capsulatus, Rhodospirillum rubrum, Rhodomicrobium vannielii, функционирует тетрамерная форма МДГ в конструктивном обмене (Tayeh, Madigan, 1987). Бактерии вида R. palustris характеризуются наибольшей вариабельностью метаболизма и способны осуществлять все типы питания (Oda et. al., 2002). При переходе от одного типа питания к другому в метаболизме бактериальных клеток происходит изменение соотношения роли ЦТК и глиоксилатного цикла (Eley et. al., 1979). Определенный интерес представляет исследование структурной организации малатдегидрогеназной ферментной системы в R. palustris в различных условиях культивирования. Бесцветные серобактерии М. bipunctata способны метаболизировать только органические вещества, утилизация которых обеспечивается не только циклом трикарбоновых кислот, но и глиоксилатным циклом.
В связи с этим, выяснение структурной организации и функциональной роли малатдегидрогеназы из R. palustris в условиях фото- и хемотрофного роста, органо- и литотрофного питания, а также из микроорганизма М. bipunctata при культивировании на различных источниках углерода, позволит внести существенный вклад в исследование механизма регуляции бактериального метаболизма.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было выяснение роли малатдегидрогеназной ферментной системы в метаболической адаптации R. palustris и М. bipunctata к различным условиям культивирования. Для выполнения цели были поставлены следующие задачи:
изучить изменение активности, а также изоферментный состав некоторых ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла в исследуемых бактериях, культивируемых на различных питательных субстратах;
выделить и получить в электрофоретически гомогенном состоянии изоформы МДГ из R. palustris и М. bipunctata;
изучить на высокоочищенных ферментных препаратах физико-химические и кинетические свойства малатдегидрогеназы;
исследовать четвертичную структуру МДГ из пурпурных бактерий в фото- и хемотрофных, а также органо- и литотрофных условиях;
методом ингибиторного анализа выявить функциональную роль димерной и тетрамерной изоформ МДГ у R. palustris;
исследовать влияние различных интермедиатов и катионов на активность малатдегидрогеназы;
изучить влияние температуры на скорость ферментативной реакции;
разработать гипотетическую модель участия малатдегидрогеназной системы в регуляции метаболизма R. palustris.
Научная новизна. Впервые получены гомогенные препараты изоформ малатдегидрогеназы из серобактерий М. bipunctata, и из фототрофных микроорганизмов R. palustris, отличающиеся по физико-химическим, кинетическим и регуляторным свойствам, а также особенностям структурной организации. Показано, что у бактерий R. palustris, способных к переключению метаболических потоков, малатдегидрогеназная система принимает участие в регуляции метаболизма за счет структурно-функциональных изменений белковой молекулы. Выявлено, что у этих микроорганизмов димерная форма фермента обеспечивает функционирование ЦТК, а тетрамерная форма МДГ участвует в регуляции анаболических реакций (глиоксилатный цикл), тогда как у хемоорганотрофа М. bipunctata малатдегидрогеназа участвует в осуществлении и энергетического метаболизма, и конструктивного в димерной форме.
Практическая значимость. Практическая значимость настоящей работы состоит в расширении и углублении знаний о роли структурно-функциональных изменений МДГ в механизмах адаптации к изменяющимся факторам внешней среды, а также в выявлении четкой корреляции между индукцией глиоксилатного цикла и синтезом тетрамерной формы МДГ. МДГ находит широкое применение в исследовательской практике, являясь удобным объектом для изучения структуры активных центров оксид оредуктаз, регуляции ферментативной активности, четвертичной структуры фермента, термодинамических параметров реакций. Гомогенные препараты МДГ могут быть использованы для регенерации НАД или НАДН при исследовании других ферментных систем, в гомогенном иммуноферментном анализе многих
6 антигенов в качестве фермента-маркера, в пищевой промышленности для исследования качества продуктов. Прикладные аспекты изучения бесцветных серобактерий и пурпурных несерных бактерий определяются их использованием для удаления токсичных соединений серы из промышленных и бытовых сточных вод, воздушной среды производственных помещений и других объектов, а также применением R. palustris для очистки сточных вод с использованием полученной биомассы в животноводстве и в других целях.
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по биохимии, микробиологии, в спецкурсах по энзимологии, биохимическим механизмам адаптации прокариот, а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 9-ой и 10-ой международных Пущинскихй конференциях молодых учёных "Биология - наука 21-ого века" (Пущино, 2005, 2006), Международной научной конференции «Современные проблемы адаптации и биоразнообразия» (Дагестан, 2006), межрегиональной конференции «ИОНИТЫ-2004» (Воронеж, 2004), 2-ой и 3-ей региональных конференциях молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2004, 2006); межрегиональных конференциях, посвященных памяти А.А. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж, 2004, 2005, 2006), ежегодной научной сессии отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета (2006).
Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены ВІЗ публикациях - 8 статьях и 5 тезисах.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (245 источников). Иллюстрационный материал включает 28 рисунков и 13 таблиц.
Имеющиеся данные о метаболизме одноклеточных бесцветных серобактерий рода Macromonas свидетельствуют, что М. hipunctata, штаммы Д-405, Д-406 и Д-407 являются хемоорганогетеротрофами и не способны к хемолитотрофии [17].
У бактерий М. hipunctata функционирует полный цикл трикарбоновьлх кислот, единственной особенностью которого является низкая активность фумаратгидратазы, которая ведет к накоплению фумарата в среде культивирования. Бактерии хорошо растут на ацетате, сукцинате, малате и некоторых других органических кислотах, и независимо от источника углерода у М. hipunctata наряду с ЦТК функционирует глиоксилатньтй цикл, который позволяет шунтировать реакцию превращения фумарата в манат, компенсируя низкую активность фумаратгидратазы [46].
Особенностью углеродного метаболизма М. hipunctata является то, что при росте на средах, содержащих органические кислоты ЦТК, этот микроорганизм способен синтезировать и откладывать внутриклеточно включения оксалатов кальция [69]. Возможность такого процесса обусловлена наличием у М. hipunctata высокой активности фермента оксалоацетатгидролазы, который катализирует реакцию расщепления оксалоацетата на ацетат и оксалат [52]. Ацетат, образующийся в больших количествах, индуцирует работу глиоксилатного цикла при росте бактерий на интермедиатах ЦТК. 1Л .2. Эколого-биохимическая характеристика фототрофных бактерий R. palustris
Пурпурные несерные фотосинтезирующие бактерии R. palustris относятся к группе а - Proteobacteria и широко распространены в природе [84, 123, 221]. Данный вид проявляет исключительную метаболическую гибкость, т.к. может расти либо анаэробно на свету (осуществляя фотосинтез), либо гетеротрофно (аэробно в темноте) на интермедиатах цикла трикарбоновых кислот [131]. При этом R. palustris в качестве доноров электронов способен использовать как органические, так и неорганические вещества, то есть осуществлять органотрофныЙ или литотрофный тип питания [36].
Состав питательных сред для культивирования микроорганизмов
Целью настоящей работы было выяснение роли малатдегидрогеназнои ферментной системы в метаболической адаптации R. palustris и М. blpunctata к различным условиям культивирования.
Для выполнения цели были поставлены следующие задачи:
1. изучить изменение активности, а также изоферментный состав некоторых ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла в исследуемых бактериях, культивируемых на различных питательных субстратах;
2. выделить и получить в электрофоретически гомогенном состоянии изоформы МДГ из R. palustris и М. blpunctata;
3. изучить на высокоочищенных ферментных препаратах физико-химические и кинетические свойства малатдегидрогеназы;
4. исследовать четвертичную структуру МДГ из пурпурных бактерий в фото- и хемотрофных, а также органо- и литотрофных условиях;
5. методом иыгибиторного анализа выявить функциональную роль димерной и тетрамерной изоформ МДГ у R. palustris;
6. исследовать влияние различных интермедиатов и катионов на активность малатдегидрогеназы;
7. изучить влияние температуры на скорость ферментативной реакции;
8. разработать гипотетическую модель участия малатдегидрогеназнои системы в регуляции метаболизма R. palustris.
Определение активности ферментов
В качестве объектов исследования служили пурпурные несерные фототрофные бактерии R. palustris штамм f-8pt и пресноводные бесцветные серобактерии М. bipimctata штамм Д-405 .
Чистые культуры были получены из коллекции микроорганизмов лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов Института микробиологии РАН.
