Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Пути автотрофной ассимиляции СОг 7
1.1. Восстановительный рибулозобисфосфатный цикл 7
1.2. Восстановительный цикл трикарбоновых кислот 8
1.3. 3-гидроксипропионатный цикл и восстановительный цикл дикарбоновых кислот 9
1.4. Нециклические системы автотрофной ассимиляции СО2 11
Глава 2. Формы РБФК 13
2.1. Форма 1 13
2.2. Форма II 14
2.3. РБФК архей (форма III) 15
2.4. РБФК-подобные белки (форма IV) 18
2.5. Локализация и организация генов, кодирующих РБФК 21
Глава 3. Филогения и эволюция РБФК 28
3.1. Сопоставление филогении РБФК с пластидной и протеобактериальной филогенией 28
3.2. Горизонтальный перенос генов, кодирующих РБФК 29
3.3. Дупликация и дифференциальная потеря гена 31
Глава 4. Изучение биоразнообразия природных сообществ 33
4.1. Молекулярно-биологические методы изучения микробных сообществ 33.
4.2. Использование генов, детерминирующих автотрофию, для анализа природных экосистем 34
Экспериментальная часть 38
Глава 5. Материалы и методы 38
5.1. Объекты исследования 38
5.2.ВьщелениеДНК ; 39
5.3. Выбор праймеров 40
5.4. Амплификация фрагментов исследуемых генов 40
5.4.1. Амплификация фрагментов генов, кодирующих РБФК формы 1 40
5.4.2. Амплификация фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК 41
5.4.3. Амплификация фрагментов генов, кодирующих метанмонооксигеназу 42
5.5. Детектирование продуктов ПЦР ...42
5.6. Очистка ПЦР-фрагментов 43
5.7. Клонирование ПЦР-фрагментов 43
5.7.1. Приготовление компетентных клеток 43
5.7.2. Лигирование 44
5.7.3. Трансформация клеток плазмидной ДНК 44
5.7.4. Выделение плазмидной ДНК 44
5.8. Секвенирование ДНК 45
5.9. Филогенетический анализ исследуемых последовательностей 46
5.10. Депонирование нуклеотидных последовательностей 46
Результаты и обсуждение 47
Глава 6. Разработка и проверка системы олигонуклеотидных праймеров для амплификации фраментов генов, кодирующих РБФК формы І, у бактерий различных таксономических групп 47
6.1. Разработка системы олигонуклеотидных праймеров для амплификации фрагментов генов, кодирующих РБФК формы І, у бактерий различных таксономических групп 47
6.2. Проверка разработанной системы праймеров на автотрофных бактериях с известной первичной структурой генов, кодирующих РБФК формы 1 51
6.3. Оптимизация условий ПЦР для амплификации фрагментов генов, кодирующих РБФК формы 1 55
Глава 7. Филогенетический анализ генов cbbL у представителей различных таксонов прокариот 59
7.1. Выявление, секвенирование и филогенетический анализ генов cbbL у фотолитоавтотрофных бактерий семейства Oscillochloridaceae 59
7.2. Выявление, секвенирование и филогенетический анализ генов cbbL у хемолитоавтотрофных бактерий 67
l.lA.^.Thiobacillus 67
7.2.2. p. Thioalkalivibrio и Thioalkalispira 72
7.2.3. p. Thioalkalimicrobium и Thiomicrospira 79
1.2A.p.Thioclava 93
Глава 8. Определение разнообразия эндосимбиотического сообщества моллюска Bathymodiolus azoricus 98
Выводы 108
Список литературы 109
- Нециклические системы автотрофной ассимиляции СО2
- Дупликация и дифференциальная потеря гена
- Трансформация клеток плазмидной ДНК
- Выявление, секвенирование и филогенетический анализ генов cbbL у фотолитоавтотрофных бактерий семейства Oscillochloridaceae
Введение к работе
Первичная продукция органического углерода в биосфере основана на ассимиляции СОг автотрофными организмами. В процессе эволюции у разных групп автотрофов выработались различные механизмы фиксации СОг: восстановительный рибулозобисфосфатный цикл (цикл Кальвина), восстановительный цикл трикарбоновых кислот, 3-гидроксипропионатный цикл, восстановительный цикл дикарбоновых кислот, восстановительный ацетил-КоА путь (цит. по Кондратьева, 1996).
Ключевым ферментом автотрофной фиксации СОг в цикле Кальвина является рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа (РБФК, КФ 4.1.1.39). В то время, как структурные и биохимические свойства этого фермента обстоятельно исследованы классическими биохимическими методами, данные о его происхождении и эволюции чрезвычайно ограничены. Известно, что автотрофные организмы, ассимилирующие СОг с помощью цикла Кальвина, принадлежат к различным и достаточно удаленным друг от друга эволюционным ветвям. Достаточно широко разнообразие первичных последовательностей РБФК, которые в настоящее время разделены на четыре формы, поэтому вопрос о моно- или полифилетическом происхождении РБФК до сих пор остается открытым.
Для исследования происхождения и эволюции РБФК необходимо использовать молекулярно-биологические методы, позволяющие проводить сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей структурных генов, кодирующих этот белок, у различных групп прокариот. Филогенетический анализ, основанный на сравнении последовательностей генов, кодирующих РБФК, широко применяется в таксономии растений и водорослей и на низших таксономических уровнях соответствует данным других маркеров (Clegg, 1993; Freshwater et al., 1994). Сравнение филогенетических схем (деревьев), построенных на основе анализа нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих РБФК, традиционного анализа генов, кодирующих 16S рРНК, а также, в некоторых случаях, анализа других структурных генов, может позволить выявить особенности эволюции и функционирования генов, кодирующих РБФК, у различных прокариотных микроорганизмов.
Несмотря на большую экологическую и практическую значимость процесса фиксации СОг, до настоящего времени остаются малоизученными вопросы, связанные с оценкой биоразнообразия автотрофных бактерий в природных сообществах, вклада конкретной экосистемы в общую продукцию органического углерода, влияния различных факторов на биоразнообразие сообществ.
Молекулярно-биологические методы позволяют получить данные, отражающие весь спектр эволюционных взаимоотношений в мире прокариот и позволяющие проводить их выявление и идентификацию. Кроме того, применение этих методов в микробной экологии позволяет получить обширную информацию о составе микробного сообщества сравнительно быстро и с высокой степенью точности.
Наиболее полную информацию о биоразнообразии микробных популяций, влиянии на него различных воздействий, динамике популяционных изменений в настоящее время получают с применением подходов, основанных на использовании метода полимеразнои цепной реакции (ПЦР). Использование анализа нуклеотидных последовательностей 16S рРНК в сочетании с методами клонирования позволило изучать состав микробных популяций (Giovannoni et al., 1990; Ward et al., 1990). Такой подход явился большим достижением в микробной экологии, поскольку существенно расширил представление о составе микробных сообществ, позволив идентифицировать микроорганизмы без предварительного культивирования в лабораториях и выделения чистых культур.
В настоящее время все более перспективными объектами для исследований в области молекулярной экологии становятся функциональные гены, позволяющие детектировать и идентифицировать микроорганизмы, выполняющие определенную функцию в данной экосистеме. Разработка и применение на практике универсальных праймерных систем, специфичных к первичным нуклеотидным последовательностям генов, кодирующих ключевые ферменты тех или иных биохимических процессов, позволяет создавать своеобразные функциональные срезы микробных популяций, в которых идентифицируются, среди всех прочих, и микроорганизмы, не выявляемые как классическими микробиологическими методами, так и с помощью анализа клонированных фрагментов суммарного амплификата 16S рДНК сообщества.
В настоящее время специфичные системы праймеров разработаны для амплификации фрагментов генов, кодирующих: метанмонооксигеназу (Holmes et al., 1995; McDonald et al., 1995); метанолдегидрогеназу (McDonald et al., 1995; McDonald a. Murrell, 1997); монооксигеназу аммиака (Rotthauwe et al., 1997); нитрогеназу (Марусина и др., 2001); нитратредуктазу (Gregory et al., 2000); нитритредуктазу (Braker et al., 1998); хлоритдисмутазу (Bender et al., 2004); бисульфитредуктазу (Wagner et al., 1998); арсенатредуктазу (Malasarn et al., 2004), М-субъединицу фотосинтетического реакционного центра пурпурных бактерий (Achenbach et al., 2001) и другие белки.
Для обнаружения и идентификации генов, кодирующих РБФК, ранее предлагались праймерные системы, позволяющие амплифицировать участки этих генов (Paul et al, 1990; Черных, 1995; Pichard et al., 1997; Elsaied a. Naganuma, 2001; Alfreider et al., 2003;
Nanba et al., 2004). Однако степень универсальности этих праймерных систем ограничивалась тем, что они были сконструированы на основании анализа небольшого числа первичных нуклеотидных последовательностей, имевшихся к тому моменту в международных базах данных. На начальных этапах разработки универсальных праймерных систем для выявления гомологичных нуклеотидных последовательностей уровень универсальности критичным образом зависит от объема выборки, на основании анализа которой создается система. В ряде случаев появление даже одной новой последовательности способно существенным образом повлиять на конечный результат.
Цель настоящей работы заключалась в разработке универсальной системы олигонуклеотидных праймеров, позволяющей амплифицировать фрагменты генов, кодирующих большую субъединицу РБФК формы I бактерий, и ее применении для анализа разнообразия исследуемых генов у фото- и хемотрофных бактерий, различающихся по экологическим, физиологическим особенностям и таксономическому положению.
Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:
Конструирование универсальной системы олигонуклеотидных праймеров, позволяющей амплифицировать фрагменты генов, кодирующих большую субъединицу РБФК формы І, у максимально широкого спектра бактерий.
Проверка выбранной системы праймеров на препаратах ДНК, выделенных из бактерий, для которых ранее была продемонстрирована способность к фиксации СОг через цикл Кальвина и известна первичная структура генов, кодирующих РБФК.
Подбор и оптимизация условий ПЦР для амплификации выбранных фрагментов генов, кодирующих РБФК, и применение разработанных системы праймеров и протокола проведения реакции для исследования модельной группы бактерий, использующих восстановленные соединения серы в качестве доноров электронов. Проведение филогенетического анализа полученных последовательностей.
Сопоставление филогенетических деревьев, построенных на основе анализа последовательностей генов, кодирующих РБФК и 16S рРНК.
Проверка применимости разработанной системы праймеров для исследования микробных сообществ.
Нециклические системы автотрофной ассимиляции СО2
У некоторых видов сульфатредукторов, гомоацетатных бактерий и метаногенов функционирует восстановительный ацетил-КоА путь, или путь Вуда (Рис. 5). Ключевым промежуточным соединением этого пути является ацетил-КоА, синтезирующийся из двух молекул СОг. Одна молекула углекислоты восстанавливается до метанола, оставаясь при этом связанной с переносчиком, вторая молекула СОг восстанавливается до СО. Метальные и карбоксильные группы связываются в реакциях трансметилирования и транскарбоксилирования с образованием ацетил-КоА. Процесс осуществляется при участии формиатдегидрогеназы, метилтрансферазы, корриноидсодержащего фермента, СО-дегидрогеназы и коферментов (тетрагидрофолат у ацетогенов, метанофуран и тетрагидрометаноптерин у метаногенов) (Bhatnagar et al., 1991; Кондратьева, 1996). Ключевым ферментом этого пути является СО-дегидрогеназа, обладающая двумя активностями: обратимое окисление СО до СОг и катализ заключительной стадии синтеза ацетил-КоА из СНз-группы, СО и KoASH. Для перечисленных субстратов имеются три сайта связывания, которые обозначаются, соответственно, X, Y, Z (Wood et al., 1991). Н2-\/- фД
Возможно, что именно ассимиляция СОг по пути Вуда является наиболее древней и примитивной формой автотрофии. Это подтверждается рядом фактов. Данный механизм распространен среди анаэробных и экстремально термофильных прокариот из числа эу- и архебактерий, что говорит о возможности функционирования этого пути в условиях высокой температуры земной коры. Ацетил-КоА путь позволяет фиксировать СОг с минимальным энергетическим обеспечением процесса. Важную роль в реакциях фиксации и восстановления СОг играют металлы. Кроме того, данный путь может обеспечить сопутствующую утилизацию различных восстановленных одноуглеродных соединений, как СО, формиат, формальдегид, метанол, являвшихся типичными компонентами первичной атмосферы Земли на ранних этапах ее эволюции.
Таким образом, способность к автотрофии распространена среди всех основных групп прокариот. Пути фиксации углекислоты различны среди разных групп, однако до сих пор непонятен принцип распределения известных путей ассимиляции СОг среди микроорганизмов.
Подавляющее большинство растений и бактерий ассимилируют СОг с помощью восстановительного рибулозобисфосфатного цикла. Зеленые серные и некоторые другие бактерии для ассимиляции СОг используют реакции ВЦТК. 3-гидроксипропионатный цикл и восстановительный цикл дикарбоновых кислот найдены у зеленых несерных бактерий. Некоторые хемоавтотрофные анаэробы, относящиеся к эубактериям и археям, фиксируют СОг по нециклическому ацетил-КоА пути. Высокая степень согласованности процессов всех известных ныне путей ассимиляции углекислоты, множество участвующих в них реакций, сложность необходимых для них кофакторов и ферментов - все это не позволяет признать какой-либо из существующих типов автотрофии более (или менее) совершенным по сравнению с другими. По всей вероятности, они соответствуют современным экологическим нишам, занимаемым организмами, которым эти пути свойственны.
Являясь ключевым ферментом биологической фиксации большей части углерода на нашей планете, РБФК представляет собой самый распространенный белок (Ellis, 1979), и поэтому пристальное внимание к его изучению вполне оправдано. Выделяют 4 формы РБФК.
Форма I состоит из восьми больших (L) (Мг -55 кДа) и восьми малых (S) (Мг 15 кДа) субъединиц. Молекулярная масса нативного фермента (гексадекамера LgSg) около 550 кДа (Tabita, 1988). Большие субъединицы выполняют каталитическую функцию, роль малых субъединиц не вполне ясна. Они не обладают каталитической активностью, но их присутствие значительно увеличивает активность фермента, вероятно, вследствие стабилизации гексадекамерной формы и конформационных сдвигов в активном центре фермента (Kellogg a. Juliano, 1997; Hansen et al., 1999). Нуклеотидная и аминокислотная последовательности малых субъединиц сильно варьируют у различных организмов, тогда как первичная структура больших субъединиц является консервативной (Tabita, 1995).
Форма I РБФК подразделяется на два типа: так называемые «зеленый» («greenlike») и «красный» («red-like»). Эти два типа различаются по аминокислотному составу больших субъединиц. Уровень гомологии белковых последовательностей больших субъединиц внутри каждого типа составляет 69-92%, тогда как гомология последовательностей между двумя типами - только около 53-60% (Delwiche a. Palmer, 1996). «Зеленый» тип представлен двумя вариантами: IA и IB (Tabita, 1995). Хлоропласта высших растений, пластиды зеленых водорослей и цианобактерии имеют вариант IB, филогенетически родственный варианту IA, который обнаруживается у представителей а-, р- и у-протеобактерий (Watson a. Tabita, 1997). Ферменты цианобактерии Prochlorococcus marinus и Synechococcus sp. WH7803 филогенетически более близки протеобактериальному варианту IA РБФК, чем цианобактериальному варианту IB (Shimada et al., 1995; Watson a. Tabita, 1996). «Красный» тип РБФК формы I также может присутствовать в виде двух вариантов, 1С и ID (Tabita, 1995). Многие незеленые водоросли имеют вариант ID, близкий варианту 1С, найденному у представителей а- и Р-протеобактерий. РБФК формы I преимущественно присутствует у фототрофных организмов и аэробных хемолитоавтотрофов (Watson a. Tabita, 1997).
Поскольку реакция оксигенирования может привести к потере около 50% фиксируемого углерода (McFadden, 1978), что сильно уменьшит СОг-зависимый рост организма, наиболее важным кинетическим параметром РБФК является фактор специфичности т, который представляет собой соотношение карбоксилазной и оксигеназной активностей при любых данных концентрациях СОг и Ог [т = (vc[02])/(Vo[CC 2])], т.е. способность фермента выбирать субстрат реакции (Jordan a. Ogren, 1981). Механизм предпочтения субстрата ферментом неизвестен. Значение т-фактора для формы I высших растений обычно больше 80, для формы I бактерий - между 25 и 75, для формы II РБФК - меньше 20 (Jordan a. Ogren, 1981; Shively et al., 1998). Высокое значение т-фактора РБФК означает, что такой фермент может избирательно ассимилировать СО2, несмотря на присутствие кислорода, и является, таким образом, более приспособленным к меньшим концентрациям СОг и/или аэробным условиям.
Дупликация и дифференциальная потеря гена
Для объяснения деления пластид и протеобактерий на «зеленую» и «красную» группы («зеленого»/«красного» расщепления формы I) была выдвинута гипотеза дупликации генов, в некоторой степени альтернативная гипотезе горизонтального переноса генов. Согласно этой гипотезе, в том случае, если до дивергенции цианобактерий и протеобактерий имел место единственный акт дупликации оперона РБФК и если одна из копий гена была утеряна (или не выявляется) в каждой из исследованных линий, то «зеленое»/«красное» расщепление формы I могло бы быть полностью объяснено и разброс таксонов среди этих двух типов просто отражал бы, какая из копий была сохранена.
Гипотеза дупликации гена предполагает длительное сосуществование обоих типов формы I в некоторых линиях. Дуплицированные гены в цианобактериальных линиях должны были сосуществовать 1-2 миллиарда лет, по крайней мере, до возникновения пластид и разделения «красной» и «зеленой» линий.
Если длительное сосуществование «зеленого» и «красного» типов генов, кодирующих РБФК, в течение эубактериальной эволюции верно, то и в настоящее время некоторые цианобактерий и протеобактерий все еще могут содержать оба типа генов, кодирующих РБФК. Однако, к настоящему моменту не найдено ни одной цианобактерий, содержащей множественный набор генов, кодирующих РБФК любого типа (Delwiche а. Palmer, 1996). Недавно оба типа генов, кодирующих РБФК формы I, были найдены у Rh. azotoformans. Тем не менее, предполагается, что более вероятной причиной сосуществования «зеленого» и «красного» типов формы І у этой протеобактерий считается латеральный перенос, а не дупликации генов (Uchino a. Yokota, 2003).
Лучшим свидетельством дупликации генов, кодирующих РБФК, в случаях, не затрагивающих «зеленое»/«красное» расщепление формы I, является наличие более чем одного гена РБФК у некоторых бактерий. Например, сосуществование РБФК форм I и II у некоторых протеобактерий, которое, как предполагается, отражает первичную дупликацию, предшествующую диверсификации форм I и И. Так как РБФК формы II имеет простую, гомодимерную структуру (Lx) и проявляет низкую субстратную специфичность, считается, что она и является предковой формой фермента. Однако можно ожидать, что первичная форма РБФК должна иметь широкое филогенетическое распространение, тогда как форма II (найденная только у протеобактерий и некоторых динофлагеллят), является менее распространенной, нежели форма I. По этой причине нельзя исключать возможность, что форма II возникла в эволюции протеобактерий путем дупликации с последующей потерей малых субъединиц и ускорением эволюции нуклеотидных последовательностей больших субъединиц (Delwiche a. Palmer, 1996).
Вероятно, результатом более поздней дупликации генов является наличие 2-х оперонов, кодирующих РБФК, у протеобактерий A. ferrooxidans Fel (Kusano et al., 1991), Ale. vinosum (Kobayashi et al., 1991), H. marinus (Nishihara et al., 1998), Cv. necator (Husemann et al., 1988).
Следует заметить, что гипотезы горизонтального переноса и дупликации генов не являются взаимоисключающими. Вероятно, оба этих процесса играли роль в эволюции РБФК: формы фермента I и II, по всей видимости, являются продуктами ранней дупликации генов, и дупликация является причиной двух копий генов формы I у различных протеобактерий (см. выше). На основании существующих в настоящее время данных, разделение пластидных и протеобактериальньгх РБФК на «зеленую» и «красную» группы с большей вероятностью можно отнести за счет горизонтального переноса генов. Также, по всей видимости, результатом горизонтального переноса генов являются форма II Gonyaulax (Morse et al., 1995), форма I Pr. marinus и Synechococcus sp. WH7803 (Delwiche a. Palmer, 1996; Watson a. Tabita, 1997), Nitrosomonas europaea (Utaker et al., 2002), A. ferrooxidans ATCC 23270 (Heinhorst et al., 2002), Rh. azotoformans (Uchino a. Yokota, 2003).
Таким образом, для наиболее полного объяснения филогенеза РБФК следует рассматривать возможное участие обоих механизмов.
Несоответствие данных филогенетического анализа, получаемых в результате сравнения последовательностей 16S рРНК и других молекулярных маркеров, обусловленное латеральным переносом генов или их дупликацией/избирательной потерей обнаруживается и для таких белков, как глицеральдегидфосфатдегидрогеназа (Martin et al, 1993), Hsp60 (Viale et al., 1994), АТФ-аза (Hilario a. Gogarten, 1993) и др. Такой широко распространенный и в достаточной степени консервативный ген, как cbbVrbcL, обеспечивает лучшую возможность изучения этого явления, и можно надеяться, более полное понимание эволюции РБФК облегчит интерпретацию сходных ситуаций у других генов (Delwiche a. Palmer, 1996).
Филогенетический анализ, основанный на сравнении последовательностей генов rbcL, широко применяется в таксономии растений и водорослей и на низких таксономических уровнях соответствует данным, полученным при использовании других маркеров (Clegg, 1993; Freshwater et al., 1994).
В настоящее время доступен обширный банк последовательностей РБФК, и он быстро растет. К сожалению, большинство последовательностей - высокогомологичные последовательности rbcL растений. Выявление новых последовательностей генов cbbL ССЬ-фиксирующих бактерий различных таксономических групп будет способствовать разрешению проблем, возникающих при филогенетическом анализе генов, кодирующих РБФК.
В этой связи разработка универсальной системы праймеров для амплификации фрагментов генов cbbL автотрофных микроорганизмов весьма актуальна, поскольку именно ПЦР-анализ является в настоящее время наиболее применимым методом как для исследования структуры генома отдельных микроорганизмов, так и для анализа природных сообществ.
Глава 4. Изучение биоразнообразия природных сообществ
Современная микробиология широко использует методы молекулярной биологии при исследовании филогении прокариот, для детекции и идентификации микроорганизмов, а также при изучении биоразнообразия микробных сообществ. Развитие методов секвенирования нуклеиновых кислот и белков, разработка новых подходов к гибридизации нуклеиновых кислот, использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) и методов геномного фингерпринтинга привело к появлению новой области исследований - молекулярной микробиологии. Задачами таких исследований являются разработка либо адаптация молекулярно-биологических методов для решения различных задач микробиологии.
У каждого из этих методов есть свои преимущества и недостатки. Однако их использование становится не просто вспомогательным, но и необходимым диагностическим инструментом для многих микробиологических исследований.
Современные тенденции развития микробной экологии включают, наряду с совершенствованием традиционных методов, активное использование молекулярно-биологических подходов для изучения микробиологических процессов и микробного разнообразия. Наиболее популярным среди таких методов является подход, основанный на определении нуклеотидных последовательностей 16S рДНК прокариот, составляющих исследуемое природное сообщество. На основе этого метода стало возможным детальное исследование состава микробных сообществ без культивации. Таким образом, бьш исследован пикопланктон Саргасова моря (Giovannoni et al., 1990), цианобактериальные маты горячих источников (Ward et al., 1990), симбионты различных беспозвоночных (Distel et al., 1988; Distel et al., 1995; Naganuma et al., 1997) и многие другие сообщества. Эти исследования также выявили большое количество последовательностей, которые нельзя было идентифицировать на основе существующих баз данных. Этот факт послужил косвенным доказательством того, что количество описанных видов микроорганизмов составляет лишь доли процента от истинного разнообразия микроорганизмов в природе.
Одним из недостатков этого метода является невозможность определения большинства бактерий на штаммовом уровне в силу консерватизма молекулы 16S рДНК. Поэтому этот метод не всегда пригоден для точной идентификации микроорганизмов.
Кроме того, на основе анализа 16S рДНК невозможно оценить разнообразие микроорганизмов, выполняющих определенную экологическую функцию в экосистеме, поскольку группа микроорганизмов, объединенная общим функциональным свойством, может составлять лишь незначительную часть самой популяции. В таких случаях необходимо применение методов, основанных на анализе нуклеотидных последовательностей функциональных генов или их фрагментов, полученных в результате ПЦР со специфическими праймерами.
Системы праймеров, специфично амплифицирующие фрагменты различных функциональных (как правило, ключевых) генов, успешно используются для поиска представителей соответствующих экофизиологических групп бактерий в образцах окружающей среды, а также для оценки разнообразия и изучения распространения этих микроорганизмов в различных экосистемах. В настоящее время специфичные системы праймеров разработаны для амплификации фрагментов генов, кодирующих: метанмонооксигеназу (Holmes et al., 1995; McDonald et al., 1995); метанолдегидрогеназу (McDonald et al., 1995; McDonald a. Murrell, 1997); монооксигеназу аммиака (Rotthauwe et al., 1997); нитрогеназу (Марусина и др., 2001); нитратредуктазу (Gregory et al., 2000); нитритредуктазу (Braker et al., 1998); хлоритдисмутазу (Bender et al., 2004); бисульфитредуктазу (Wagner et al., 1998); арсенатредуктазу (Malasarn et al., 2004), M-субъединицу фотосинтетического реакционного центра пурпурных бактерий (Achenbach et al., 2001) и другие белки.
Трансформация клеток плазмидной ДНК
Замороженные или свежеприготовленные компетентные клетки Е. coll DH5a помещали в ледяную баню. К 100 мкл компетентных клеток добавляли 20 мкл лигазной смеси и инкубировали смесь в течение 1 ч на льду. Далее клетки подвергали тепловому шоку при 42С в течение 1 мин 30 с и охлаждали до комнатной температуры. Затем добавляли 1 мл среды LB и помещали пробирки в термостат на 1 ч на 37С. По окончании инкубации суспензию клеток рассевали на чашки с агаризованной средой LB следующего состава (в г на 1 л дистиллированной воды): NaCl - 5.0, триптон - 10.0, дрожжевой экстракт - 5.0. агар - 18.0, содержащей 50 ед./мл ампициллина, 50 мкг/мл IPTG, 40 мкг/мл X-Gal для цветной селекции клонов. Клетки выращивали в термостате при 37С в течение ночи.
Для проверки эффективности проводили трансформацию клеток с интактной плазмидой pGEM-3Zf(+), имеющей ген устойчивости к ампициллину, по методике, описанной выше. В качестве контроля чистоты эксперимента проводили посев нетрансформированных клеток на ту же среду.
Плазмидную ДНК выделяли из культуры клеток Е. coli DH5oc, выращенной в жидкой среде LB с ампициллином (50 ед./мл) в течение ночи при 37С. Выделение плазмидной ДНК проводили с применением набора реактивов «Wizard MiniPreps» (Promega, США), согласно рекомендации производителя. Полученные препараты плазмидной ДНК хранили в холодильнике при -18С. 5.8. Секвенирование ДНК
Секвенирование проводили по методу Сэнгера (Sanger et al., 1977) с использованием набора «Silver Sequence DNA Sequencing System» (Promega, США) согласно рекомендациям производителя, с незначительными модификациями
Мечение праймеров осуществляли кинированием по 5 -концу с помощью фермента Т4 полинуклеотидкиназы (Fermentas, Литва). Объем смеси составлял 1 мкл и имел следующий состав: Iх буфер ПНК (50 мМ трис-HCl, рН 7.6; 10 мМ MgCl2; 5 мМ ДТТ,
0.1 мМ спермидин; 0.1 мМ ЭДТА); 1 ед. ПНК; 2 пмоль праймера; 0.3 МБк аденозин-5 [у-32Р] трифосфата. Смесь инкубировали 20 мин при 37С, затем фермент инактивировали нагреванием 5 мин при 65С.
Плазмиды со вставкой секвенировали с универсальных плазмидных праймеров M13F, M13R26, SP6 и Т7 (Sambrook et al., 1989). Секвенирование ПЦР-фрагментов исследуемых генов проводили с использованием соответствующих амплифицирующих и секвенирующих праймеров.
Составляли реакционную смесь следующего состава: 4.5 мкл ПЦР-продукта или плазмиды со вставкой (10-25 нг/мкл), 2.5 мкл 5х буфера (250 мМ трис-HCl, рН 9.0; 10 мМ MgCh), 0.5 мкл ДНК полимеразы Taq Sequencing Grade (5 едУмкл) (Promega, США), 1 мкл меченого праймера (0.2 пмоль/мкл). Полученную смесь раскапьшали по 2 мкл в пробирки и добавляли по 1 мкл соответствующих терминирующих нуклеотидных смесей d/ddNTP Mixes (Promega, США). Сверху наслаивали по 15 мкл минерального масла. Сиквенсную реакцию проводили в термоциклере Cetus 480 (Perkin Elmer, США) со следующим температурно-временным профилем амплификации: 1-й цикл - 94С X 2 мин, 55С - 30с, 72С - Імин; последующие 30 циклов - 94С х 30 с, 55С х 30 с, 72С X 1 мин; заключительный цикл -72С X 7 мин.
По окончании реакции добавляли стоп-раствор следующего состава: 10 мМ NaOH; 95% формамид; 0.05% бромфеноловый синий; 0.05% ксилен-цианол. Продукты реакции отбирали из-под масла и хранили в морозильной камере при - 18С.
Фракционирование набора полученных фрагментов проводили путем электрофореза в 7%-ном полиакриламидном геле толщиной 0.19 мм в денатурирующих условиях (в присутствии 7 М мочевины) на приборе SQ3 Sequencer (Hoefer, США). Последовательность нуклеотидов считывали непосредственно с радиоавтографов гелей (Чемерис и др., 1999). 5.9. Филогенетический анализ исследуемых последовательностей
Первичный сравнительный анализ полученных denovo последовательностей с последовательностями базы данных GenBank проводили с помощью программы NCBI Blast (http://wvAV.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Редактирование последовательностей проводили с помощью редактора BioEdit (http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). Выбранные последовательности выравнивали между собой с помощью программы CLUSTAL Wv 1.75 (Thompson et al., 1994). Построение филогенетических деревьев исследуемых бактерий проводили с использованием алгоритмов: neighbor-joining (Saitou a. Nei, 1987), реализованного в пакете программ TREECON W (Van de Peer a. De Wachter, 1994), maximum-parsimony (Fitch, 1971), distance matrix (Fitch a. Margoliash, 1967) и maximum-likelihood (Felsenstein, 1981), реализованных в пакете программ PHYLIP (Felsenstein, 1989).
Расчет относительных частот использования кодонов (RSCU) для генов, кодирующих РБФК, и проведение анализа соответствия осуществляли с помощью пакета программ CodonW (John Peden, http: //www.molbiol.ox.ac.uk/cu ).
Уровни синонимичных (dS) и несинонимичных (dN) замен рассчитывали при помощи программы YNOO (пакет программ PAML, (Yang, 2000)), используя метод (Yang a. Nielsen, 2000).
В результате проведения работы были определены первичные нуклеотидные последовательности для 36 фрагментов генов.
Нуклеотидные последовательности фрагментов генов, кодирующих РБФК, были депонированы в базе данных GenBank под номерами: AY450586, AY450588, AY450589; AY914800-AY914807, DQ139401-DQ139404; AY656720-AY656723, DQ272527-DQ272534; DQ390447- DQ390449; AY945759, AY945760.
Нуклеотидные последовательности фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК, были депонированы в базе данных GenBank под номерами: DQ139400, AY945758.
Нуклеотидные последовательности фрагментов генов, кодирующих метанмонооксигеназу, были депонированы в базе данных GenBank под номерами: AY945761, AY945762.
Выявление, секвенирование и филогенетический анализ генов cbbL у фотолитоавтотрофных бактерий семейства Oscillochloridaceae
К группе аноксигенных нитчатых фототрофных бактерий (АНФБ) относятся представители родов Chlorojlexus, Oscillochloris, Chloronema, Heliothrix и Roseiflexus (Garrity a. Holt, 2001; Hanada et al., 2002). Эти микроорганизмы, образующие многоклеточные трихомы, оказались филогенетически значительно удаленными от остальных ветвей фототрофов и, в то же время, родственными ряду хемотрофных бактерий {Herpetosiphonales), включенных в филум Chloroflexi (Garrity a. Holt, 2001). До недавнего времени все АНФБ относили к семейству Chloroflexaceae. В настоящее время представители рода Oscillochloris на основании исследования фенотипических и генетических свойств выделены в новое семейство Oscillochloridaceae (Keppen et al., 2000). Филогенетическое исследование накопительной культуры АНФБ, идентифицированной как Chloronema giganteum , показало, что последовательность гена 16S рРНК этой бактерии попадает в один кластер с генами представителей семейства Oscillochloridaceae (Gich et al., 2001). Недавно описанный Candidatus Chlorothrix halophila , выделенный из гиперсоленого микробного мата, филогенетически относится к ветви, включающей Chloroflexus и Oscillochloris (Klappenbach a. Pierson, 2004). Roseiflexus филогенетически далеко отстоит от других представителей группы АНФБ и выделяется в отдельную ветвь (Hanada et al., 2002).
Способность к автотрофному росту показана у представителей родов Oscillochloris и Chloroflexus, а также у Candidates Chlorothrix halophila . Показано, что у С/7, aurantiacus могут функционировать как восстановительный цикл дикарбоновых кислот (Ivanovsky et al., 1993; Уголькова и Ивановский, 2000) (Рис. 4), так и 3-гидроксипропионатный цикл (Strauss and Fuchs, 1993) (Рис. 3).
Относительно углеродного метаболизма Candidates Chlorothrix halophila известно только то, что 3-гидроксипропионатный цикл, скорее всего, не принимает участия в автотрофной ассимиляции СОг, поскольку активность ключевого его фермента -пропионил-СоА синтазы - у этой бактерии выявлена не была (Klappenbach a. Pierson, 2004).
У бактерий семейства Oscillochloridaceae (облигатных фотолитоавтотрофов, растущих только в анаэробных условиях в присутствии сульфида или водорода) автотрофная ассимиляция углекислоты осуществляется через цикл Кальвина. Наличие активности РБФК было показано у различных штаммов Oscillochloris, однако тип и структурные особенности детерминирующих его генов ebb оставались неизвестными (Ivanovsky et al., 1999; Берг и др., 2005).
Объектами исследования являлись 3 мезофильных штамма АНФБ семейства Oscillochloridaceae, выделенных из разных пресноводных мест обитания. Типовой штамм Osc. trichoides DG6 был выделен из сероводородного источника на Кавказе, Oscillochloris sp. R- из водоемов Подмосковья, Oscillochloris sp.C6 - из водоемов Сибири.
Дополнительно к проведенному ранее определению нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих 16S рРНК типового штамма Osc. trichoides DG-6 и штаммов Oscillochloris sp. R, BM и A19 (Keppen et al., 2000), нами было проведено секвенирование аналогичного гена вновь выделенного штамма Oscillochloris sp. Сб. В результате была получена последовательность длиной 1350 нуклеотидов, соответствующая позициям 38-1447 по номеклатуре Е. со!і.
На основании сравнительного анализа последовательностей генов, кодирующих 16S рРНК всех исследованных штаммов рода Oscillochloris, была выявлена высокая степень их гомологии (97,8-100%). Все они образовывали на филогенетическом дереве (Рис. 12) компактный кластер, существенно удаленный от представителей других родов филогенетической линии АНФБ, из которых наиболее близкой к исследуемым бактериям была накопительная культура АНФБ, идентифицированная как Chloronema giganteum (89.9-91.0% гомологии).
Кроме того, при сравнительном анализе секвенированных последовательностей генов, кодирующих 16S рРНК штаммов рода Oscillochloris, с аналогичными последовательностями, представленными в банке данных GenBank, был обнаружен только один отдаленно родственный (92.8-93.1% гомологии) некультивируемый клон AKYH632 АНФБ из почвенного сообщества (номер доступа в GenBank AY921893). На построенном филогенетическом дереве этот клон не относился непосредственно к кластеру штаммов рода Oscillochloris, а занимал промежуточное положение между ним и ветвью lChloronema giganteum .
Для выявления генов cbbL у исследуемых штаммов АФНБ Osc. trichoides DG-6 и Oscillochloris sp. R и C6 была использована разработанная нами система олигонуклеотидных праймеров. ПЦР-продуктов в реакциях с праймерной системой RublgF-RublgR, специфичной для генов cbbL «зеленого» типа, выявлено не было. ПЦР-продуктов в реакциях с праймерной системой RublrF-RublrR, специфичной для генов cbbL «красного» типа, также не было выявлено. Однако при этом не был выявлен и ПЦР-продукт, соответствующий фрагменту гена cbbL «красного» типа для грамположительной бактерии Sulfobacillus acidophilus NAL (номер доступа в GenBank U75301), ДНК которой была использована в качестве положительного контроля (указанная последовательность не была учтена при разработке праймерной системы, поскольку имела слишком малую длину). Этот факт послужил основой для ревизии праймерной системы, специфичной для генов cbbL «красного» типа.
В целях усовершенствования используемой праймерной системы был проведен поиск дополнительного праймера(ов) для амплификации фрагментов генов cbbL «красного» типа. В результате сравнительного анализа имевшихся в базе данных ранее (на момент создания системы праймеров) и вновь секвенированных фрагментов генов cbbL «красного» типа (общее число депонированных последовательностей генов «красного» типа составило 27) был выбран другой консервативный участок консенсусной последовательности, на основании которого был сконструирован вырожденный обратный праймер (RubIr892R) (Рис. 13).
Использование нового праймера позволило амплифицировать фрагменты генов cbbL «красного» типа у более широкого круга бактериальных объектов. К моменту окончания работы число депонированных последовательностей генов, кодирующих РБФК формы I «красного» типа, достигло 39, причем праймер RubIr892R был гомологичен всем опубликованным последовательностям.
