Введение к работе
Актуальность проблемы.
Вопрос достаточности и качества природной пресной воды является одной из наиболее актуальных проблем XXI века. Важнейшими природными центрами формирования ультрапресных вод в условиях равнинных ландшафтов, характерных для бореальной зоны России и других стран Северного полушария, являются болотные экосистемы (Заварзин, Дедыш, 2008). Формирующиеся в болотах гумусированные кислые воды питают многочисленные озера и реки северных регионов. Анализ вод малых ацидных озер, расположенных на заболоченных водосборах Верхней Волги показал, что микроорганизмы в них представлены преимущественно клетками малых размеров, которые с трудом поддаются идентификации с помощью флуоресцентной in situ гибридизации и стандартного набора группо-специфичных зондов (Куличевская и др., 2011). Существенная часть этих клеток представлена ультрамикроформами, проникающими через «бактериальные» фильтры с диаметром пор 0.22 мкм, которые повсеместно используются для очистки воды, питательных сред, сывороток и проч. от клеток микроорганизмов.
Несмотря на то, что интерес к фильтрующимся формам микроорганизмов появился давно (Sherman, Safford, 1928; Kleinberger-Nobel, 1951; Имшенецкий, Солнцева, 1958), сведения о них остаются весьма ограниченными. Впервые термин «ультрамикробактерия» был применен в 1981 году для описания морских гетеротрофных бактерий с диаметром клеток менее 0.3 мкм, которые медленно росли на стандартных питательных средах и не увеличивались в размерах при продолжительном культивировании в лаборатории (Torella, Morita, 1981). В настоящее время термин «ультрамикробактерия» применяют для обозначения клеток объемом менее 0.1 мкм (Schut et al., 1997; Velimirov, 2001), а имеющиеся сведения об их биологии и разнообразии суммированы в ряде обзоров (Velimirov, 2001; Panikov, 2005; Duda, 2011; Дуда и др., 2012). Большинство этих организмов являются свободноживущими гетеротрофами, однако известны и паразитические формы (Huber et al., 2002; Сузина и др., 2011), а также потенциально опасные представители (Audic et al., 2007).
Многие ультрамикробактерии способны проникать через фильтры с диаметром пор 0.22 мкм. Признание этого факта микробиологами долгое время сдерживалось тем обстоятельством, что фильтрующиеся формы клеток или вообще не прорастают на стандартных питательных средах, или же образуют ультрамикроколонии, незаметные невооруженным глазом (Torella, Morita, 1981; MacDonell, Hood, 1982; Hahn, 2004). Эту проблему «некультивируемости» фильтрующихся форм удалось частично решить путем использования сильно разбавленных питательных сред и продолжительной инкубации посевов. Применение такого подхода для анализа образцов воды ряда рек, озер и прудов позволило получить коллекцию изолятов фильтрующихся форм бактерий, относящихся к филогенетическим группам Bacteroidetes, Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Actinobacteria и Spirochaetes, многие из которых были в дальнейшем охарактеризованы в качестве новых таксонов (Hahn, 2004; Hahn et al., 2009, 2010, 2012).
Ни один из приемов культивирования, однако, не позволяет охватить все разнообразие присутствующих в образце микроорганизмов. Хорошей альтернативой здесь является использование молекулярных методов, хотя перечень работ по молекулярной идентификации фильтрующихся форм микроорганизмов остается крайне скудным. Он ограничен исследованиями проб фильтрованной средиземноморской воды (Haller et al., 1999), грунтовых вод урановой шахты (Miyoshi et al., 2004), а также торфа кислых сфагновых болот (Panikov, 2005; Лысак и др., 2010). Идентификация основных популяций фильтрующихся бактерий была также проведена для воды ряда рек и озер Швейцарии (Wang et al., 2007). Было показано, что мл воды этих пресноводных водоемов содержит около 104 микробных клеток, способных проникать через фильтры с диаметром пор 0.22 мкм, что составляет от 0.03 до 3.6% от общей численности бактериопланктона (Wang et al., 2007). Для водоемов России таких исследований не проводилось. Настоящая работа, таким образом, была предпринята для восполнения дефицита информации о численности и природе фильтрующихся форм микроорганизмов в водах пресноводных экосистем севера Европейской части России.
Цели и задачи исследования.
Цель работы - молекулярная идентификация ультрамикро-форм бактерий и архей в ультрапресных водах экосистем водосбора Верхней Волги, а также водах Рыбинского водохранилища.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Определение численности клеток микроорганизмов, проникающих через фильтры с диаметром пор 0.22 мкм, в водах малых озёр и болот водосбора Верхней Волги, а также воде Рыбинского водохранилища.
-
Оценка применимости культуральных подходов для выявления и изучения фильтрующихся микробных клеток.
-
Молекулярная идентификация фильтрующихся форм бактерий и архей воды исследуемых экосистем путём формирования и анализа библиотеки клонов генов 16S рРНК, а также сравнение состава фильтрующихся микроорганизмов в водах водохранилища и водосборных территорий.
Научная новизна и значимость работы.
В настоящей работе впервые получены данные о численности и филогенетической принадлежности фильтрующихся форм микроорганизмов в ультрапресных водах природных экосистем водосбора Верхней Волги и Рыбинского водохранилища. Это первое системное исследование фильтрующихся микробных клеток, выполненное для водоемов России. Исследование показало, что численность фильтрующихся микроорганизмов в природных водах может быть довольно высока и достигать 104 клеток в 1 мл воды. Установлено, что состав фильтрующихся бактерий на заболоченных водосборных территориях отличен от такового в водах водохранилища. Организмов, близких известным патогенам в составе фильтрующихся бактерий не обнаружено. В составе фильтрующихся архей всех исследованных пресноводных экосистем впервые выявлены представители неизученного и не полученного пока в культурах кластера LDS филума Euryarchaeota. Результаты настоящей работы свидетельствуют о том, что археи этой группы представлены клетками ультрамикро- диапазона.
Практическая значимость.
Идентификация и изучение ультрамикроформ микроорганизмов ультрапресных экосистем севера России имеет приоритетное значение в рамках проблемы водопользования, оценки потенциальных рисков и совершенствования методик очистки воды. В ходе выполнения работы получено и проанализировано около 250 клонированных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК фильтрующихся бактерий и 300 клонированных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК фильтрующихся архей; из них в GenBank депонировано 215 последовательностей. База данных этих последовательностей может быть использована для разработки молекулярных методов детекции фильтрующихся микроорганизмов, основанных на использовании ПЦР или микрочипов.
Апробация работы.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных и российских конференциях и симпозиумах:
-
-
Международной молодёжной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, ИНМИ РАН, 2010.
-
16-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых учёных «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА», Пущино, ИБФМ РАН, 2012.
-
Конференции молодых учёных «Молекулярная и клеточная биология: прикладные аспекты», Москва, 2012.
-
4th Congress of European Microbiologists (FEMS-4), Geneva, Switzerland, 2011.
5. 14th International Symposium on Microbial Ecology (ISME-14), Copenhagen, Denmark, 2012.
Публикации.
Материалы диссертации содержатся в 8 печатных работах: 3 экспериментальных статьях и 5 тезисах конференций.
Объём и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, глав, заключения и выводов, изложенных на ... страницах, включая ... таблиц, ... рисунков и списка литературы из ... наименований, из них ... - на русском и .... - на английском языке.
Место проведения работы и благодарности.
Работа была выполнена в лаборатории Микробиологии болотных экосистем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института микробиологии им С.Н. Виноградского РАН с 2009 по 2013 годы под руководством д.б.н. С.Н. Дедыш.
Использованные в работе образцы воды и торфа были предоставлены автору к.б.н. А.Н. Буториным и д.б.н. В.Т. Комовым (ИБВВ РАН). Электронно-микроскопические исследования фильтрованной воды были проведены совместно с В.В. Сорокиным (ИНМИ РАН) и к.б.н. Н.Е. Сузиной (ИБФМ РАН). Сравнительный анализ видового состава фильтрующихся микроорганизмов различных экосистем проведен совместно с Ю.М. Серкебаевой (ИНМИ РАН).
Работа выполнена при финансировании в рамках программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».
Автор выражает искреннюю благодарность всем вышеупомянутым участникам данной работы, а также особую признательность д.б.н. С.Н. Дедыш и к.б.н. С.Э. Беловой за полезные практические советы и помощь на всех этапах работы.
Похожие диссертации на Молекулярная идентификация фильтрующихся форм бактерий и архей ультрапресных вод
-
