Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 7
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
ГЛАВА I. Сравнительный микробиологический анализ неферментирующих
грамотрицательных бактерий В.cepacia и P.aeruginosa - возбудителей
оппортунистических инфекций 16
Клиническое значение бактерий В.cepacia и патогенез, вызванной ими инфекции 16
Клиническая значимость P.aeruginosa 21
Таксономия бактерий B.cepacia 22
Особенности генома B.cepacia 27
Необычные метаболические свойства B.cepacia 31
Таксономия бактерий рода Pseudomonas 32
Геном P.aeruginosa 33
ГЛАВА П. Идентификация бактерий B.cepacia. Сравнительный анализ с
идентификацией P.aeruginosa 36
Идентификация и дифференциация бактерий В .cepacia 36
Идентификация бактерий P.aeruginosa 39
Устойчивость к антимикробным препаратам B.cepacia 40
ГЛАВА III. Факторы патогенности бактерий комплекса B.cepacia и
P.aeruginosa 44
Факторы патогенности бактерий B.cepacia 44
Факторы патогенности P.aeruginosa 47
Биоплёнки, как способ выживания клинически значимых микроорганизмов. Формирование биоплёнки у бактерий комплекса B.cepacia и
P.aeruginosa 51
Пути развития острой или персистентной формы инфекции, вызванной бактериями P.aeraginosa 56
«Quorum sensing» - система регуляции внеклеточных факторов патогенности у бактерий комплекса В.cepacia и P.aeraginosa 59
Изучение патогенеза инфекций, вызванных бактериям комплекса В.cepacia при моделировании на животных 66
Изучение патогенеза инфекций, вызванных бактериями P.aeruginosa при моделировании на животных 69
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА ГУ.Материалы и методы 72
Штаммы 72
Модель персистентной инфекции 76
Анализ кДНК в клетках B.cepacia и P.aeraginosa по матрице
иРНК 77
Методы изучения свойств госпитальных штаммов Burkholderia cepacia 79
Изучение действия лактонов на бактерии B.cepacia и P.aeraginosa 83
Изучение клеточных иммунных реакций 85
Разработка комплексного микробиологического подхода для
идентификации бактерий Burkholderia cepacia 87
ГЛАВА V. Создание управляемой модели персистентной инфекции и
выяснение причин реализации патогенности бактерий Burkholderia cepacia и
Pseudomonas aeruginosa 92
Характеристика штаммов, использованных в опыте 92
Создание экспериментальной модели персистентной инфекции 94
*
5.3. Условия перехода персистентной формы инфекции в острую под
действием различных индукторов 102
5.4. Условия перехода инфекции, вызванной В.cepacia, из острой в
персистентную форму 106
ГЛАВА VI. Изучение действия субингибирующих концентраций антибиотиков на экспрессию генов, регулирующих продукцию факторов патогенности у бактерий комплекса Burkholderia cepacia и Pseudomonas
aeruginosa 112
6.1. Изучение влияния ципрофлоксацина на экспрессию генов факторов
патогенности 112
ГЛАВА VII. Выявление и характеристика компонентов регуляторной системы Quorum sensing у клинических штаммов бактерий Burkholderia
cepacia 119
7.1.Выявление компонентов регуляторной системы Quorum sensing у
клинических штаммов B.cepacia 119
7.2.Изучение продукции потенциальных факторов патогенности клиническими
штаммами B.cepacia 124
ГЛАВА VIII. Формирование биоплёнок клиническими штаммами бактерий
комплекса Burkholderia cepacia в зависимости от их фенотипических и
генотипических характеристик 126
Определение способности клинических штаммов бактерий комплекса B.cepacia формировать биоплёнку 126
Продукция потенциальных факторов патогенности бактериями комплекса B.cepacia и их способность к формированию
биоплёнок 131
Генотипирование штаммов бактерий комплекса B.cepacia с различной способностью к формированию биоплёнок 133
Корреляция между наличием у штаммов «эпидемических» маркеров и способностью штаммов к формированию биоплёнок 135
8.5. Изучение антибиотикочувствительности штаммов с разной способностью к
формированию биоплёнки 137
ГЛАВА IX. Роль регуляторной системы «QUORUM SENSING» в симбиотическом взаимодействии бактерий BURKHOLDERIA CEPACIA и
PSEUDOMONAS AERUGINOSA при смешанной инфекции 143
9.1 .Взаимоотношения бактерий P.aeruginosa и B.cepacia 143
9.2.Взаимоотношение B.cepacia 370 и P.aeruginosa РА103 in vivo 146
9.3.Влияние автоиндукторов (лактонов) системы QS на свойства B.cepacia и
P.aeruginosa in vitro 146
9.4.Влияние автоиндукторов (лактонов) системы QS на свойства B.cepacia и
P.aeruginosa in vivo 153
9.5.Влияние автоиндукторов на образование биоплёнок у бактерий B.cepacia
P.aeruginosa 154
ГЛАВА X. Влияние бактерий Burkholderia cepacia и Pseudomonas aeruginosa на клеточные иммунные реакции экспериментальных
животных 160
10.1.Влияние штаммов B.cepacia и P.aeruginosa на функциональную активность
иммунокомпетентных Т- и В- лимфоцитов 160
Глава XI. Разработка системы идентификации бактерий Burkholderia
cepacia 168
П.І.Фенотипические методы для исследования свойств госпитальных штаммов
бактерий B.cepacia 169
11.2.Молекулярно-биологические методы для исследования госпитальных
штаммов бактерий комплекса В .cepacia 171
XII. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 185
ВЫВОДЫ 205
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 209
Использованные сокращения
АОК -антителобразующие клетки
ВБИ -внутрибольничные инфекции
СИК -субингибирующие концентрации
ЭБ -эритроциты барана
BCSEM - маркер эпидемических штаммов В. cepacia
сері - ген, кодирующий синтазу автоиндуктора В. cepacia
Сері -синтаза автоиндуктора В. cepacia
cepR - ген, кодирующий транскрипционный регулятор В. cepacia
CepR - транскрипционный регулятор В. cepacia
ISH - эпидемиологический маркер В. cepacia (гибрид двух инсерционных
последовательностей) LasI - синтаза автоиндуктора P. aeruginosa LasR - транскрипционный регулятор P. aeruginosa Luxl -синтаза автоиндуктора Vibrio flsheri LuxR -транскрипционный регулятор Vibrio flsheri
Введение к работе
Актуальность работы. В течение последнего десятилетия были получены данные, свидетельствующие о том, что бактерии В.cepacia, ранее относимые к роду Pseudomonas, являются оппортунистическими микроорганизмами, способными вызывать госпитальные инфекции (раневые, катетер-ассоциированные инфекции, пневмонии). Особую опасность бактерии В.cepacia представляют для лиц с иммунодефицитами различного генеза -больных кистозным фиброзом (или муковисцидозом) и хроническим грануломатозом, у которых данные микроорганизмы способны вызвать эндокардиты, некротизирующую пневмонию с септицемией, зачастую заканчивающуюся летальным исходом (так называемый «цепация - синдром») (Gilligan Р.Н.,1995, Lutter Е., Lewenza S., Dennis J.J. et al.,2001). Вопрос, почему бактерии В. cepacia в одних случаях выделяются из мокроты больных муковисцидозом и не вызывают инфекционных осложнений, а в других вызывают тяжёлые поражения лёгких, приводящие к смерти, до настоящего времени остаётся открытым. В последнее время участились случаи госпитальных пневмоний, вызванных В. cepacia, у послеоперационных больных, находящихся на искусственной вентиляции лёгких. Учитывая ограниченные данные, касающиеся микробиологических свойств этого микроорганизма и патогенеза вызываемой им инфекции, можно отнести его к малоизученным возбудителям оппортунистических инфекций.
Одним из наиболее клинически значимых представителей рода Pseudomonas является вид P. aeruginosa. Бактерии P. aeruginosa нередко вызывают тяжёлые поражения лёгких у больных муковисцидозом при смешанной инфекции в ассоциации с бактериями В. cepacia. Учитывая вышесказанное, целесообразным является сравнительное изучение вирулентных свойств видов В. cepacia и P. aeruginosa для определения вирулентности бактерий В. cepacia и путей развития инфекционного процесса
при инфицировании В. cepacia.
В 1992 г. вид P. cepacia на основании секвенирования гена 16S rRNA был отнесен к новому роду Burkholderia, включающему в настоящее время 22 вида, среди которых есть возбудители особо опасных инфекций человека и животных - сапа и мелиоидоза- В. mallei и В. pseudomallei. Вид В. cepacia является наименее изученным представителем этого рода. Бактерии этого вида обитают в почве и воде, а также способны вызывать заболевания у человека, животных и растений, которые можно отнести к сапронозам (Anzai, Kim Y.H., Park J.Y. et al. 2000, Gilligan P.H.,1995, Lutter E., Lewenza S., Dennis J.J. et al.,2001, Luczak J.B., Cannon C.L., Pier G.B., 2002, Gilligan P.H.,1995). Возможность существования этих бактерий в различных средах обитания может быть обусловлена необычно большим геномом (в 2 раза больше, чем у Е. coli и в 1,5 раза больше генома Р. aeruginosa), а также наличием в его составе многочисленных инсерционных последовательностей и 3-х кольцевых репликонов (Mahenthiralingam Е., Urban Т.А., Goldberg J.B., 2005). Данные, касающиеся факторов патогенности В. cepacia и механизмов их регуляции, практически отсутствуют, так же как и недостаточно изучены причины возникновения инфекции у больных с иммунодефицитами различного генеза, механизмы и факторы её передачи и молекулярно-генетические механизмы изменчивости, обеспечивающие высокие адаптационные возможности этого микроорганизма для существования и размножения в различных условиях обитания. До середины 1990-х годов оставалось неясным, являются ли бактерии В. cepacia самостоятельными этиологическими агентами оппортунистических инфекций или они являются микроорганизмами, выявляемыми при тяжелых легочных инфекциях, вызываемых P. aeruginosa и S. aureus. В настоящее время достоверно доказана способность к колонизации В.cepacia в бронхоальвеолярных путях. У клинических штаммов В.cepacia доказано наличие таких факторов патогенности, как пили, адгезины и гемолизин, кроме этого, как и все грамотрицательные бактерии, бактерии В. cepacia имеют
липополисахарид- эндотоксин. Можно предположить, что эти факторы детерминируются генами, имеющими сложную структуру и регуляцию и, возможно, обладающими свойствами мобильных генетических элементов -транспозонов, ряд из которых, вероятно, расположен на нескольких кольцевых ДЬЖ. Подтверждением этому является чрезвычайная пластичность комплекса В. cepacia (Mahenthiralingam Е. et al, 2005).
Исследования экспрессии генов факторов патогенности бактерий В. cepacia являются чрезвычайно важными для понимания адаптивной изменчивости этих микроорганизмов, проблем эволюции бактерий В. cepacia, эпидемиологии инфекций, вызываемых этими возбудителями.
Актуальным является вопрос о родстве штаммов В. cepacia, выделяемых из окружающей среды (прежде всего, почвы) и от больных. Это необходимо для понимания эволюции этих микроорганизмов и их устойчивости ко многим антимикробным препаратам, связанной, возможно, с горизонтальной передачей генов. Помимо изучения родства между штаммами В. cepacia необходимо для предупреждения тяжёлых осложнений и назначения эффективного лечения, а также для уточнения таксономии, проводить идентификацию этих бактерий. Несмотря на интенсивные исследования В. cepacia, проведенные в 1990-е годы, многие вопросы, касающиеся идентификации и типирования В. cepacia остаются недостаточно изученными. Прежде всего, это связано с несовершенством микробиологических методов, используемых для выделения и идентификации В. cepacia. В настоящее время 9 фенотипически сходных, но генетически различных видов (геномоваров) в литературе принято называть «комплексом бактерий В. cepacia». Учитывая наличие 9 геномоваров, для окончательного типирования В. cepacia необходимо использовать молекулярно-биологические методы. Бактерии В. cepacia принадлежат к патогенам, идентификация которых требует одновременного использования современных бактериологических, биохимических и молекулярно-генетических методов. Подобным комплексом микробиологических методов исследования обладает не
каждая бактериологическая клиническая лаборатория, что затрудняет быструю и эффективную диагностику. Можно полагать, что разработка оптимальной схемы идентификации и типирования позволит значительно эффективнее выявлять В. cepacia, а следовательно, решать разнообразные проблемы микробиологии и эпидемиологии ВБИ, вызываемых бактериями В.cepacia.
Цель работы: Выявление свойств В. cepacia, ассоциированных с патогенностью, и путей их различной реализации при острой и персистентнои формах экспериментальной инфекции.
Задачи исследования:
Разработать экспериментальную модель персистентнои инфекции, вызванной бактериями В. cepacia и P. aeruginosa, и изучить условия и факторы, необходимые для перехода персистентнои инфекции в острую форму и обратно.
Исследовать молекулярно-генетические механизмы перехода острой формы инфекции, вызванной бактериями В. cepacia и P. aeruginosa, в персистентную инфекцию под действием субингибирующих концентраций некоторых антибиотиков и идентифицировать гены, дифференциально экспрессирующиеся при острой и персистентнои формах инфекции.
Выявить продукцию факторов патогенности, в том числе и способность к формированию биоплёнки, у клинических штаммов В. cepacia и определить влияние бактерий В. cepacia на клеточные иммунные реакции экспериментальных животных.
Изучить роль регуляторной системы «Quorum sensing» в генетическом контроле экспрессии факторов патогенности В. cepacia.
Оценить характер взаимодействия бактерий В. cepacia и P. aeruginosa in vitro и in vivo на разработанной экспериментальной модели инфекции.
Испытать действие химически синтезированных ацилгомосерин лактонов, отличающихся длиной углеродной цепи, на свойства бактерий В. cepacia и P. aeruginosa in vitro и in vivo.
7. Разработать комплексную микробиологическую систему индикации бактерий В. cepacia у больных и определить эпидемиологическую значимость штаммов, выделенных от больных пневмониями в клиниках г. Москвы.
Научная новизна работы.
Впервые изучены свойства бактерий В. cepacia, ассоциированные с патогенностью, и пути их различной реализации при разных формах экспериментальной инфекции.
Показано, что антибиотик ципрофлоксацин, являющийся ингибитором ДНК-гиразы и подавляющий синтез белков, в субингибирующей концентрации снижает экспрессию гена сері, регулирующего продукцию синтазы автоиндуктора, у бактерий В. cepacia и гена plcR, отвечающего за продукцию гемолизина P. aeruginosa. Экспрессия гена сері В. cepacia, который участвует в регуляции экспрессии факторов патогенности, и гена plcR P. aeruginosa обнаружена при острой форме инфекции и подавляется при персистентной форме, созданной с использованием субингибирующей концентрации (СИК) ципрофлоксацина.
Создана управляемая экспериментальная модель персистентной инфекции, вызванной бактериями В. cepacia, на основе полученных данных об ингибировании экспрессии факторов патогенности СИК ряда антибиотиков, позволившая изучить действие различных индукторов и супрессоров на инфекционный процесс. При оценке модели впервые учитывались четыре критерия персистенции: отсутствие гибели экспериментальных животных, высев из органов возбудителя, замедленный рост бактерий на питательных средах с изменением морфологии колоний, а также подавление экспрессии факторов патогенности. Установлено, что сигнальные молекулы лактона у-гидроксибутановой кислоты способствовали индукции перехода персистентной инфекции, вызываемой В. cepacia, в острую форму. Показано, что иммунодепрессант циклофосфан содействовал переходу персистентной
инфекции, вызываемой P. aeruginosa, в острую форму. Критерием перехода персистентной формы в острую была гибель мышей, из селезёнки которых выделяли бактерии В. cepacia и P. aeruginosa.
Установлено, что патогенез инфекционного процесса, обусловленного В. cepacia отличается от такового, вызванного бактериями P. aeruginosa, что выражается в различных влияниях В. cepacia и P. aeruginosa на массу иммунокомпетентных органов - селезёнки и тимуса, на образование АОК мышей к гетерологичному антигену (ЭБ) и на пролиферативную активность спленоцитов мышей, вследствие реализации действия различных факторов патогенности бактериями В. cepacia и P. aeruginosa.
Продемонстрировано, что бактерии В. cepacia обладают регуляторной системой CepI/CepR "Quorum sensing". Регуляция экспрессии генов факторов патогенности у бактерий В. cepacia и P. aeruginosa осуществляется с помощью сходных регуляторных систем "Quorum sensing" CepI/CepR (В. cepacia) и LasI/LasR, Rhll/RhlR (P. aeruginosa), относящихся к LuxIR -типу, отличающихся незначительными различиями у автоиндукторов - ацилгомосерин лактонов, а именно длиной углеродной цепи.
Впервые выдвинута гипотеза о том, что у штаммов В. cepacia, имеющих сері и cepR гены, активация продукции факторов патогенности происходит под действием собственных лактонов, что может быть при моноинфекции, тогда как штаммам В. cepacia, содержащим только cepR ген, для активации продукции факторов патогенности необходимы экзогенные ацилгомосерин лактоны бактерий, имеющих полноценную регуляторную систему "Quorum sensing". Подобное явление может происходить при смешанной инфекции, что подтверждено на модели экспериментальной смешанной инфекции in vitro и in vivo обнаружением синэргического усиления патогенности ассоциации В. cepacia и P. aeruginosa.
Установлена возможность взаимодействия регуляторных систем этих бактерий, включая систему "Quorum sensing", приводящего к взаимовыгодному
использованию компонентов регуляторньгх систем.
Впервые показано, что причиной роста вирулентности бактерий В. cepacia и P. aeruginosa при экспериментальной смешанной инфекции и в опытах с синтетическими ацилгомосерин лактонами in vitro и in vivo может быть совместное действие автоиндукторов системы "Quorum sensing" этих близкородственных микроорганизмов.
Впервые продемонстрировано различное действие отдельных лактонов и их сочетаний на В. cepacia и P. aeruginosa на основании изучения действия искусственно синтезированных ацилгомосерин лактонов с различной длиной углеродной боковой цепи на свойства бактерий.
Установлено, что бактерии В. cepacia и P. aeruginosa могут использовать в своей жизнедеятельности сразу несколько экзогенных лактонов, продуцируемых другими близкородственными бактериями, приспосабливаясь, таким образом, к условиям своего обитания in vitro и in vivo.
Впервые показано, что на способность В. cepacia образовывать биоплёнки влияет одновременное добавление в среду выращивания двух ацилгомосерин лактонов с различной длиной углеродной цепи, что подтвердило роль системы "Quoram sensing" в этом процессе.
Впервые продемонстрировано, что у штаммов, обладающих выраженной способностью к образованию биоплёнки, наиболее часто выявляются факторы патогенности (гемолитическая и хитинолитическая активность), а также гены сері и cepR, являющиеся компонентами регуляторной системы "Quorum sensing", что может служить доказательством взаимосвязи между наличием генов системы "Quorum sensing", продукцией факторов патогенности и формированием биоплёнок.
Впервые определены критерии потенциальной способности к формированию биоплёнки у исследуемых штаммов: выявление в ПНР гена cbl, ответственного за продукцию пилей, участвующих в прикреплении бактерий к поверхности тканей, органов и поверхностей медицинского оборудования при
образовании биоплёнок, и принадлежность штаммов преимущественно к 4-му геноварианту при типировании в RAPD-ПЦР.
Практическая значимость.
Собрана коллекция из 74 штаммов В. cepacia, включающая 55 клинических штаммов, выделенных от больных пневмониями в больницах г. Москвы, которые используются в лаборатории генной инженерии патогенных микроорганизмов и в лаборатории экологии возбудителей инфекций ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН в микробиологических и молекулярно-генетических исследованиях.
Разработан алгоритм индикации бактерий В. cepacia, включающий бактериологический анализ и ПЦР для идентификации геномоваров В. cepacia, генотипирование штаммов с помощью RAPD-ПЦР и выявление эпидемиологических маркеров BCESM (маркера эпидемических штаммов), ISH (гибрида двух инсерционных последовательностей), обнаруженного у эпидемических штаммов, и гена cbl. При использовании этого алгоритма установлено, что клинические штаммы, циркулирующие в различных стационарах города Москвы, относятся к геномовару ША, обозначенному как Burkholderia cenocepacia. Доказана эпидемиологическая значимость российских штаммов, у которых были выявлены эпидемиологические маркеры. Показано, что в стационарах г. Москвы циркулируют штаммы типичные для московского региона, и штаммы со специфическими генотипическими характеристиками для каждого стационара. Разработанный алгоритм индикации В. cepacia оформлен в виде методических рекомендаций «Выявление и идентификация бактерий комплекса Burkholderia cepacia» (Чернуха М.Ю., Алексеева Г.В., Шагинян И.А., Москва, 2005г.) для клинических бактериологических лабораторий, которые утверждены советом по внедрению ГУ НИИЭМ им
Н.Ф.Гамалеи РАМН. Алгоритм индикации В. cepacia описан в главе «Идентификация бактерий комплекса Burkholderia cepacia с помощью ПЦР» (Алексеева Г.В., Чернуха М.Ю., Шагинян И.А.) в учебно-методическом пособии «Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и её применение в бактериологии» (Ред. Гинцбург А.Л.., Романова Ю.М., М., 2006). Алгоритм индикации бактерий В.cepacia используется в лаборатории молекулярной эпидемиологии госпитальных инфекций ГУ НИИЭМ им Н.Ф.Гамалеи РАМН при обследовании больных муковисцидозом для идентификации бактерий В. cepacia и может быть использован в любой бактериологической лаборатории при наличии приборов и реактивов для проведения ПЦР.
Полученные результаты позволяют представить механизм смешанной инфекции у больных муковисцидозом, вызванной бактериями В. cepacia и Р. aeruginosa, обладающих сходными регуляторными системами "Quorum sensing", и определить, что причиной тяжёлого клинического состояния пациентов является рост вирулентности этих близкородственных бактерий за счёт совместного действия ацилгомосерин лактонов- компонентов системы "Quorum sensing".
Научные программы. Работа была выполнена в рамках грантов РФФИ и МО РФ (1997-2005гг).
![Использование липосомальных форм антимикробных препаратов для лечения раневой инфекции в эксперименте [Электронный ресурс]](/i/i/4326/211478.png "Использование липосомальных форм антимикробных препаратов для лечения раневой инфекции в эксперименте [Электронный ресурс] Снатенков Евгений Александрович")
