Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Экологические особенности и медицинское значение В. cepacia 12
1.2. Основные фенотипические свойства и принципы идентификации В.cepacia 20
1.3. Таксономия и внутривидовое типирование бактерий группы В. cepacia. 29
Глава 2. Материалы и методы 34
2.1. Штаммы 34
2.2. Питательные и селективные среды 36
2.3. Морфологические методы 37
2.4. Биохимические диагностические реакции 39
2.5. Методы выявления продукции цепациацинов и фагов и определения чувствительности к ним штаммов буркхольдерий 44
2.6. Иммунологические реакции 45
2.7. Определение чувствительности к антибактериальным средствам 47
2.8. Постановка реакций в автоматических системах идентификации 48
2.9. Генетические методы диагностики 51
2.10. Статистическая обработка результатов 51
Глава 3. Фенотипические свойства В. cepacia 53
3.1. Изучение характера роста культур В. cepacia на различных средах 53
3.2. Особенности морфологии клеток 56
3.3. Биохимические свойства 58
3.4. Иммунологические реакции в идентификации культур В. cepacia 64
3.5. Чувствительность штаммов В. cepacia к антибактериальным препаратам 68
3.6. Определение активности и специфичности продукции цепациацинов и фагов 71
3.7. Вирулентность В. cepacia в опытах in vivo и in vitro 75
Глава 4. Постановка тестов для предварительной (ориентировочной) идентификации В. cepacia 79
4.1. Отбор диагностических признаков для первичной идентификации штаммов В. cepacia 79
4.2. Оценка профилей в автоматических идентификационных системах 81
Глава 5. Алгоритм окончательной идентификации и типирование штаммов В. cepacia 87
5.1. Генотипирование культур В. cepacia 87
5.2. Принципы полифазной таксономии и алгоритм идентификации В. cepacia 90
Заключение 94
Выводы 102
Практические рекомендации 103
Список литературы 104
- Основные фенотипические свойства и принципы идентификации В.cepacia
- Биохимические свойства
- Оценка профилей в автоматических идентификационных системах
- Принципы полифазной таксономии и алгоритм идентификации В. cepacia
Основные фенотипические свойства и принципы идентификации В.cepacia
До внедрения в лабораторную практику полуавтоматических и автоматических систем типа API, Vitek, а тем более, генетических методик с использованием ПЦР основными методами лабораторной диагностики и идентификации культур было изучение культурально-морфологических и биохимических свойств микроорганизмов. Постановка основных диагностических тестов, как правило, происходила в соответствии с разработанными рекомендациями по идентификации культур, в конечном счете, имеющими в своей основе так называемые идентификационные ключи [34, 88, 89, 114, 120].
Эти же схемы идентификации и набор тестов остаются основными и в настоящее время в клинических лабораториях, не располагающих в большинстве своем финансовыми возможностями и уровнем подготовки специалистов для проведения идентификации культур, генетическими методами и импортными автоматическими системами.
Начальными этапами в схеме идентификации являются культу-рально-морфологические и тинкториальные исследования. В. cepacia относится к относительно неприхотливым микроорганизмам и растет на большинстве полноценных и полусинтетических сред. Для выращивания и поддержания музейных культур обычно используют мясо-пептонный или триптиказо-соевый агар, на этих средах вырастают слабо пигментированные желтовато-кремового цвета колонии в S-форме. Для обнаружения пигментообразования у В. cepacia необходимо использовать специальные среды [194].
При световой микроскопии окрашенных по Граму мазков клеток В.cepacia выявляются палочковидные структуры розового (красного) цвета, размеры клеток (0,5x3 мкм) принципиально не отличаются от типичных представителей энтеробактерий или псевдомонад. При специальном окрашивании на наличие жгутиков видны полярно расположенные пучки жгутиков (лофотрихи), по своей длине во много раз превышающие длину клетки [4, 151].
После установления принадлежности микроорганизма к палочковидным, грамотрицательным бактериям важнейшими этапами идентификации являются характер окисления/ферментации глюкозы (тест Хью-Лейфсона) и наличие цитохромоксидазы. Эти тесты определяют характер дыхания микроба. В. cepacia относится к аэробным микроорганизмам, извлекающим энергию с помощью окислительных реакций, в тесте Хью-Лейфсона глюкоза всегда окисляется, но не ферментируется, оксидазная реакция - положительная, но у ряда штаммов замедленная.
Установление принадлежности бактерий к большой группе так называемых неферментирующих глюкозу грамотрицательных бактерий (ГНФ) позволяет провести дальнейшую идентификацию, т.е. установить видовую принадлежность, используя простые, вполне доступные по набору тестов, идентификационные ключи. Так, A. King, I. Phillips [120] полагали, что для установления видовой принадлежности культур В. cepacia, достаточно убедиться, что ГНФ культура не образует диффундирующий пигмент типа пиоцианина или флуоресцеина, положительна по лизиндекарбоксилазе, отрицательна по дигидролазе аргинина, окисляет мальтозу и манитол. Л.А. Ряпис с соавторами [34] в своем диагностическом ключе для дифференциации псевдомонад относили с 90 % вероятностью к В. cepacia культуры ГНФ не образующие флуоресцирующий пигмент, обладающие лизиндекарбокси-лазой и окисляющие манит. Bergan [60] полагал, что для более точной идентификации В. cepacia, после отрицательного теста на аргининди-гидролазу следует еще получить положительные результаты на наличие лизиндекарбоксилазы, окисление галактозы, лактозы и отрицательные - в реакции денитрификации с образованием N2
Эти ключи, безусловно, полезны для предварительной оценки вида, однако оценочная достоверность точности идентификации по дихотомическим ключам не превышает вероятности в 80 - 90 %, поэтому для дальнейшей более точной дифференциации от фенотипи-чески сходных видов необходима дополнительная постановка ряда тестов.
Минимальный, но достаточный набор этих тестов окончательно не определен, но различные авторы рекомендуют от 20 до 30 [60, 65, 89, 104, 151]. Принципиальное значение придается следующим тестам: окисление набора моно- и дисахаридов, оксидаза, декарбоксила-зы аминокислот, разжижение желатина, гидролиз эскулина, бета-галактозидаза (ONPG), рост при 42С, наличие гемолизинов и ДНК-азы. N. Palleroni [151] полагал, что определенное значение при окончательной идентификации культур В. cepacia может иметь и определение способности утилизировать ряд простых химических соединений.
Помимо определения видовой принадлежности с помощью этих тестов предполагается и возможность разделения культур В. cepacia на биовары (геномовары) [60, 70, 104]. Принципиальное значение отводится лизин- и орнитиндекарбоксилазе, росту при 42С, наличию бета-галактозидазы, окислению сахарозы и разжижению желатина.
Принцип «разумно и достаточно» положен в основу набора фе-нотипических тестов в так называемые коммерческие полуавтоматические системы идентификации: API 20 Е, API 20 NE, Vitek GNi, Vitek NFC, Microscan, Nefermtest и др. [39, 67, 122, 123, 124]. Наиболее популярной для идентификации псевдомонад и буркхольдерий в настоящее время является система API 20 NE [46, 104, 170, 181]. Принцип методики идентификации в этой системе основан на качественной оценке (+ или -) тестов в 20 лунках с различными субстратами, в которые добавляют исследуемую культуру, позволяющей оценить способность окислять различные сахара и выявить наличие определенных ферментов. 21-м тестом является постановка пробы на оксидазу. Вся система разделена на 7 троек, в каждой из которых по наличию или отсутствию положительной реакции определяется кодовое обозначение, варьирующее от 0 до 7. Полученный 7-значный код с помощью фирменного индекса профилей позволяет с определенной долей вероятности идентифицировать вид изучаемой культуры. При сомнительной степени вероятности указаны дополнительные тесты для дискриминации видов со сходными в пределах идентификационной системы фенотипом [51]. Учитывая высокую активность ферментных систем культур В. cepacia для большинства штаммов характерны кодовые обозначения с преобладанием семерок среди заключительных цифр шифра (например, 0477777 с вероятностью 99,9% идентифицирует культуру как в. cepacia).
Стоит отметить, что В. gladioli, фитопатогенный вид буркхольдерий, редко встречающийся в медицинской практике [57, 181, 188, 190], отдельно в фирменном списке идентифицируемых видов не обозначен и фигурирует в дешифраторе кодов вместе с В. cepacia, как возможный вариант. Четких фенотипических тестов для дифференциации этих двух видов до сих пор не выявлено, некоторые авторы полагают, что для в. gladioli характерна меньшая ферментативная активность по ряду субстратов (отрицательная реакция на оксидазу, окисление сахарозы и лактозы, отсутствие лизин- и орнитиндекарбокси-лаз). Однако эти признаки не всегда выражены и у В.cepacia, поэтому абсолютно достоверная дискриминация культур видов В. gladioli и В. cepacia возможна на основе анализа цельноклеточных жирных кислот [58, 192], что впрочем, также оспаривается [70]. Наиболее достоверным методом идентификации В. gladioli остается только постановка ПЦР с видоспецифическими праймерами на основе 23S РНК [57, 188].
Определенное значение для идентификации В. cepacia имеет анализ цельноклеточных белков в гель-электрофорезе с додецил-сульфатом натрия (SDS-PAGE). Показано, что этот метод с применением компьютерных программ анализа электрофореграмм позволяет разграничивать на самостоятельные кластеры штаммы В. cepacia, отделяя их от буркхольдерий других видов и культур В. cepacia-Wke [7, 70, 180, 181]. Однако этот метод требует особых условий для стандартизации этапов постановки, что определяет возможность реализации метода только специалистами в технически обеспеченных лабораториях научных учреждений. Мало вероятно в ближайшей перспективе использование в клинических микробиологических лабораториях методик электрофореза бактериальных протеинов в SDS-PAGE.
В последнее десятилетие наиболее предпочтительным методом идентификации бактерий группы В. cepacia в научных исследованиях, а также и в ряде хорошо оснащенных клинических лабораторий стала полимеразная цепная реакция (ПЦР) [70, 104, 173, 181, 184]. E.Mahenthiralingam et al. [140, 141] разработали ПЦР идентификацию на основе гесА гена, по их данным предложенный в качестве прайме-ра участок гена имел 94 - 95 % сходства между всеми штаммами В. cepacia, а внутри отдельных геномоваров этот фрагмент гесА гена имел уровень сходства 98 - 99 %. При использовании видоспецифич-ных праймеров на основе гесА гена в дальнейшем с помощью ПДРФ-анализа возможно разграничение штаммов на различные типы внутри каждого геномовара.
Биохимические свойства
Наряду с морфологическими признаками колоний и клеток В. cepacia, биохимическая активность культур, выявляемых в специальных тестах, является основой разработанных в настоящее время диагностических схем и ключей идентификации бактерий, включая и вид В. cepacia [4; 47, 87, 104]. В основе этих методик лежит оценка способности окислять (ферментировать) простые и сложные карбогидра-ты, вызывать гидролиз аминокислот, полисахаридов, липидов, а также использовать в качестве единственного источника углерода и энергии различные химические соединения.
Одним из ведущих диагностических признаков является характер катаболизма простых углеводов. В частности по свойству окислять, но не ферментировать глюкозу все виды буркхольдерии, в том числе и В. cepacia, входят в состав так называемых глюкозу нефер-ментирующих микроорганизмов. Все изученные нами буркхольдерии в тесте Хью-Лейфсона вызывали в аэробных условиях пожелтение среды, цвет среды не изменялся в пробирках под слоем вазелинового масла.
Культуры всех штаммов В. cepacia активно окисляли и другие гексозы (фруктозу, галактозу, маннозу). Более сложные отношения культур выявляются с другими сахарами -.пентозами, дезоксисахара-ми, олиго- и полисахаридами. Все штаммы В. cepacia окисляли ксилозу, но ни один не был активен в отношении рамнозы. Дисахариды давали мозаичную картину (табл. 3.3). Лактозу не разлагали 8 штаммов, мальтозу - 3, сахарозу -12, адонитол - 16. Крахмал не разлагался ни одним штаммом В. cepacia.
Важным идентификационным признаком при диагностике культур считается наличие индофенол-оксидазы. За исключением 2-х культур (320 и 8239), все испытуемые штаммы В. cepacia проявляли оксидазную активность, что обеспечивает этим микроорганизмам кислородный тип окислительного фосфорилирования (аэробный тип окислительных реакций).
Декарбоксилазная активность довольно редко проявляется среди микроорганизмов неферментирующих глюкозу [4, 87]. Аргининди-гидролаза свойственна флуоресцирующим псевдомонадам и патогенным буркхольдериям, лизиндекарбоксилаза выявляется у бактерий рода Stenotrophomonas, а орнитиндекарбоксилаза вообще выявляется у редких видов ГНФ, притом не у всех штаммов. В качестве положительных контролен в наших опытах при изучении АДГ использовали штамм P. aeruginosa 4000, а для выявления ЛДК - S. maltophilia 4131.
Среди изученных нами штаммов 7 обладали аргининдигидрола-зой, все они (8239, 5809 - 5813, 320) имели атипичные характеристики в тестах по окислению Сахаров и по данным роста на селективных средах. Остальные штаммы в большинстве своем были лизинположи-тельными (15 из 18), наличие орнитиндекарбоксилазы явление довольно редкое, обращает на себя внимание факт, что этот фермент обнаружен только у лизинположительных культур.
ONPG-тест определяет наличие бета-галактозидазы, довольно редкого фермента для ГНФ-бактерий, но принципиально значимого при идентификации В. cepacia. Этот тест оказался положительным у 13 штаммов нашей коллекции, все штаммы других видов буркхольде-рий были ONPG (-), также как и штаммы культур ADH (+).
Широко используемый тест толерантности к температуре при дифференциации отдельных видов псевдомонад (P. aeruginosa и Р. fluorescens, P. putida) и буркхольдерий (В. mallei и В. pseudomallei) в случае В. cepacia показал, что все культуры не растут при 4С, а при 42С имеется строгая дихотомия, позволяющая включить этот простой тест в список дифференциации при внутривидовом разграничении штаммов В. cepacia [60, 104].
Желатиназная активность также не имеет стабильного проявления у культур В. cepacia и не является видовым признаком, в то же время может служить дополнительным индивудуальным тестом для характеристики отдельных культур в качестве эпидемиологического маркера. Подобным же маркером может служить и тест способности расти при 2,5 % NaCI, который оказался положительным у 12 штаммов В. cepacia.
Оценка спектра усвоения различных органических соединений в качестве источника углерода и энергии проведена на минимальной среде Gilardi [35, 89]. Поражает чрезвычайное разнообразие простых и сложных соединений, ассимилируемых буркхольдериями. При этом спектр препаратов коррелирует с филогенетическим уровнем патоген-ности вида - наименьшим набором отличается В. mallei, затем В. pseudomallei, а В. cepacia и В. thailandensis вообще относятся к "рекордсменам" по широте набора источников энергии (табл. 3.4.).
На основе полученных нами результатов и анализа литературных данных [31, 35, 89, 104], составлена сводная таблица стенотипических свойств буркхольдерий, имеющих значение в медицинской практике (табл. 3.5). Обращают на себя внимание как обязательные положительные тесты для установления видовой принадлежности культур к виду В. cepacia оксидазная реакция и окисление, но не ферментация глюкозы, а также наличие лизиндекарбоксилазы и бета-галактозидазы. При этом отрицательными должны быть тесты на ар-гининдигидролазу, окисление рамнозы и способность образовывать газообразные продукты в тесте на денитрификацию.
Оценка профилей в автоматических идентификационных системах
При идентификации буркхольдерии по системе Nefermtest 24 было исследовано 28 штаммов. Учет проводился по цветным реакциям, характер которых определен стандартами в соответствии с рисунками, прилагаемыми фирмой к- набору тест-системы (рис. 4.7). Полученные нами данные (табл. 4.10) показывают, что в данной тест-системе получены вариабельные результаты на тестах, которые при стандартных исследованиях были стабильными. Особенно принципиальными были расхождения в оценке декарбоксилаз и денитрификации. В итоге отмечено, что штаммы, видовая принадлежность которых обычными лабораторными методами, включая пробы на животных, не вызывает сомнений, по этой системе может правильно не идентифицироваться, причем % таких ошибок достаточно высок, а вероятность точности диагностики даже для референтных штаммов, в свою очередь, низкая.
При идентификации буркхольдерий по этой системе была установлена принадлежность авирулентного штамма В. pseudomallei Vang к виду В. cepacia, что в дальнейшем подтверждилось и другими нашими исследованиями. Этот штамм отличался от других В. pseudomallei по ассимиляции арабинозы, вирулентности для золотистых хомячков. У В. pseudomallei Vang не был зафиксирован синтез специфических ампликонов ни с одним из сконструированных мелиоидозных прайме-ров [40]:
Идентификацию бактерий, относящихся к ГНФ типу, чаще всего проводят с помощью системы API 20 NE [51]. Принцип оценки этим методом заключается в определении кода по 21 качественному признаку, последние сгруппированы в 7 групп:
1 - денитрификация, продукция индола, ферментация глюкозы
2 - аргининдигидролаза, уреаза, гидролиз эскулина
3 - желатиназа, галактозидаза, усвоение глюкозы
4 - усвоение арабинозы, маннозы, манитола
5-усвоение ацетил-глюкозамина, мальтозы, глюконата калия
6 - усвоение капроновой, адипповой и малеиновой кислот
7 - усвоение цитрата натрия и фенилацетата, оксидаза
В каждой триаде отрицательные реакции имеют оценку 0, а положительные в порядке перечисления соответственно, 1, 2 или 4. Положительные реакции в триаде суммируются, таким образом, в 7-значном коде оценка может быть от 0 до 7. Учитывая, что В. cepacia обладает широким спектром ассимилируемых субстратов, а в этой системе идентификации, начиная с 3-й триады, оценивается спектр усвоения различных карбогидратов, становится понятным, что для В. cepacia -идентификационный "код характерен в своей заключительной части формулы высокими цифровыми показателями типа ХХ77777. К примеру, референтный штамм В. cepacia 25416 имеет код 0077577. Кодовые обозначения различных видов буркхольдерии, в том числе и В. cepacia, полученные в ходе наших экспериментов, представлены в таблице 4.11.
Из 15 исследованных штаммов В. cepacia - 12 с вероятностью от 95,2 % до 99,9 % по определителю относятся к виду В. cepacia, три штамма (320, 5809 и 5812) не являются представителями этого вида. Все эти штаммы исключались из вида В. cepacia как при постановке тестов в соответствии с идентификационным ключом, так и при иммунологических исследованиях. Нужно отметить, что в каталоге идентификационных ключей системы API 20 NE при определении вида В. cepacia, в скобках указано, что этот код может соответствовать и виду В. gladioli, поэтому рекомендуется дополнительно поставить 2 теста - окисление сахарозы и целлобиозы, в случае положительной реакции с обоими дисахаридами, авторы относят культуру к В. cepacia, а при отрицательных тестах к В. gladioli.
Однако, как в наших исследованиях, так и по мнению других ав-торов [58, 104], все не так гладко. Почти треть штаммов В. cepacia не окисляют сахарозу, а пятая часть - целлобиозу, в то же время 10 % штаммов В. gladioli способны окислять эти сахара. На сегодняшний день достоверная дискриминация культур этих близкородственных видов возможна лишь на основании генотипических методов (ПЦР, ДНК-зондирование) или при исследовании профиля жирных кислот [58], эти методы применимы лишь в специализированных хорошо оснащенных научных центрах.
Необходимо отметить, что наборы систем API безусловно имеют ценность для предварительной идентификации культур в клинических лабораториях, особенно они полезны для оценки видовой принадлежности редко встречающихся видов патогенной и сапрофитной флоры, однако необходимо помнить, что при анализе многочисленного материала по использованию API 20 NE показано, что в результате проверки точности видовой принадлежности культур генотипическими методами в референтных лабораториях выявлено, что в 10 % случаев происходит гипердиагностика, а в 5 % - гиподиагностика [170], основные виды с которыми происходят неточности видового определения (лжеидентификация) В. cepacia являются - в. gladioli, В. pseudomallei, S. maltophilia, P. aeruginosa, A. xylosoxidans [65, 166, 170]. При группировании штаммов на геномовары, наиболее низкий процент идентификации отмечен для IV геномовара - только 4 % культур этого гено-мовара идентифицируются в системе API как В. cepacia [104].
Принципы полифазной таксономии и алгоритм идентификации В. cepacia
Чрезвычайная пластичность генома В. cepacia в сочетании с наличием разнообразных плазмид и фагов предопределяют убиквитарность распространения этого вида микроорганизма в природе и разнообразие его экологических ниш. Одновременно это создает и практические проблемы при идентификации культур В. cepacia. Разнообразие фенотипических свойств, предопределило то, что в ранних исследованиях микроорганизмы этого вида до установления их генетической близости, классифицировались, по меньшей мере, как 3 независимых таксономических единицы в зависимости от источника выделения (Pseudomonas cepacia, P. multivorans, P. kingii) [56, 87, 176]. Кроме того, даже в наше время по фенотипическим признакам сложно разграничить Ш- сёрас/а от ряда фитопатогенных-и почвенных видов микробов типа В. gladioli, Ralstonia, Pahdoraea [104, 181].
Показано, что использование стандартных микробиологических фенотипических методов не позволяет идентифицировать более 10% культур В. cepacia, как в сторону гипердиагностики, так и гиподиагно стики, общепринятые серологические методы идентификации культур этого вида отсутствуют. Более того, разработанные современные генотипические методы также не обеспечивают 100 % гарантию видовой и внутривидовой таксономической дифференциации штаммов В. серасiа [104 184]; Как полагает P.Vandamme [176, 180] единственно достоверным методом идентификации вида в. cepacia в настоящее время является полифазная таксономия, предусматривающая комплексное исследование изучаемых культур. Окончательный комплексный уровень идентификации предусматривает как генотипические исследования, так и изучение фенотипических биохимических свойств, белковый профиль клеточных структур, состав жирных кислот. Все это в комплексе позволяет не только исключить гипердиагностику за счет близкородственных В. cepacia-Wke видов, но и разграничить культуры В. cepacia на геномовары, что чрезвычайно важно для оценки эпидемиологической значимости отдельных штаммов [58, 60, 177, 179, 184].
Понятно, что подобные исследования могут методически быть обеспечены только в специализированных микробиологических центрах. В наших условиях, как впрочем, и в других научно-исследовательских учреждениях полифазность исследований обеспечивается сочетанием генотипических и фенотипических методов (рис. 5.8.). В-зависимЪсти от цели исследований и условий идентификации (нацеленный поиск В. cepacia - скрининг культур из внешней среды или в очаге инфекции, а также случайное обнаружение культуры в исследуемых пробах) алгоритм первых этапов может существенно отличаться. При нацеленном поиске изучаемая культура уже на первом этапе выросшая на селективной среде или присланная для окончательной идентификации может исследоваться как в ПЦР, так и в МФА, методами, не требующими в принципе наличия «чистой» культуры.
Принципиально при наличии обоих положительных результатов в генетическом и иммунологическом тесте можно с высокой степенью вероятности идентифицировать культуру, как В. cepacia, и ставить пробы на выяснение чувствительности к антибиотикам в случае, если имеем дело с культурами из клинического материала.
При обычных исследованиях бактериологическим путем высев производится на обычную (ТСА или МПА) или селективную среду. В случае выделения «чистой» культуры на этих средах проводят дальнейшую идентификацию по обычным стандартным рекомендациям для культур ГНФ [24, 34, 89, 114]. Для ориентировочной идентификации В: cepacia принципиальное значение имеют следующие признаки: грам (-) палочка, подвижная, окисление/ферментация глюкозы (+/-), оксидаза (+), аргининдигидролаза (-), лизиндекарбоксилаза (+), (3- галактозидаза (+), ДНК-аза (-). Видовая устойчивость к полимиксину и аминогликозидам в принципе проверяется еще на этапе отбора на селективных средах. Дополнительно исследуют еще ряд стенотипических признаков, варьирующих в своем проявлении у вида В. cepacia, но стабильно сохраняющихся у отдельных штаммов. К ним относятся - денитрификация, орнитиндекарбоксилаза, гидролиз эскулина, разжижение желатина и способность расти при 42С и на средах с 2,5 % NaCI. Мозаика проявлений этих 6 признаков фенотипа с успехом может быть эпидемиологическим маркером культур, в определенной мере компенсируя невозможность постановки сложных генотипических методов инфравидового типирования культур В. cepacia.
