Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Основные биологические свойства возбудителей сальмонеллеза 9
1.2. Антигенная структура и химический состав сальмонелл 11
1.3. Протеомный анализ и его значение 15
1.4. Методы изучения генома. Современное состояние 21
1.5. Лабораторная диагностика сальмонеллезов 40
2. Собственные исследования 42
2.1. Материалы и методы 42
2.2. Результаты собственных исследований 54
2.2.1. Анализ полипептидов различных штаммов сальмонелл методом диск-электрофореза в ПААГ-ДСН 54
2.2.2. Изучение антигенных свойств белков различных штаммов сальмонелл методом иммуноблоттинга 68
2.2.2.1. Изучение состава и свойств антигенных комплексов изолированных клеточных структур сальмонелл (жгутики, клеточная стенка) 75
2.2.3. Исследование геномов сальмонелл 81
2.2.3.1. Разработка модифицированного способа выделения ДНК сальмонелл для молекулярно-генетических исследований 82
2.2.3.2. Подбор праймеров для индикации представителей рода Salmonella методом ПЦР 86
2.2.3.3. Выявление гипервариабельных областей генома сальмонелл методом ПЦР, с использованием произвольных праймеров 92
3. Обсуждение результатов исследований 104
4. Выводы 123
5. Практические предложения 125
6. Список использованной литературы 127
7. Приложения 155
- Протеомный анализ и его значение
- Анализ полипептидов различных штаммов сальмонелл методом диск-электрофореза в ПААГ-ДСН
- Разработка модифицированного способа выделения ДНК сальмонелл для молекулярно-генетических исследований
- Выявление гипервариабельных областей генома сальмонелл методом ПЦР, с использованием произвольных праймеров
Введение к работе
Актуальность темы. Инфекционные болезни наносят существенный экономический ущерб животноводству. Одной из наиболее распространенных является сальмонеллез, который вызывает заболевание и падеж молодняка сельскохозяйственных животных и представляет определенную опасность для здоровья людей [48, 62, 78, 90, 97,109,117].
Сальмонеллы относятся к числу убикваторных микроорганизмов [81]. К заболеванию восприимчивы млекопитающие, птицы, холоднокровные и даже насекомые. Переболевшие животные и люди длительный период времени остаются носителями и выделителями сальмонелл.
Наличие широкого круга естественных носителей (млекопитающих, птиц, рептилий и человека), длительное пребывание в заражённом организме, высокая устойчивость против неблагоприятных условий внешней среды обусловлены большой пластичностью биологических свойств этих микроорганизмов.
Для возбудителей сальмонеллеза характерны выраженная вариабельность антигенной структуры и изменчивость [22].
Кроме того, из-за широкого применения живых вакцин возникает необходимость идентификации вакцинных и эпизоотических штаммов.
Дифференциацию и идентификацию сальмонелл осуществляют на основании культурально-биохимических, морфологических свойств и типоспеци-фическими сыворотками, биопробой на лабораторных животных, что является весьма трудоемким.
Распространенность, наносимый ущерб, угроза здоровью людей и сложность диагностики, определяет необходимость разработки более совершенных методов идентификации и дифференциации сальмонелл. В связи с этим представляет определенный интерес исследование генома возбудителей сальмонеллеза, отличающихся по антигенным и вирулентным свойствам, с использованием современных методов молекулярной биологии и иммунохимии.
Цель и задачи исследований. Целью работы явилось изучение электро-форетических и антигенных свойств полипептидов сальмонелл, отличающихся по антигенным и вирулентным свойствам, индикация и идентификация их геномов полимеразной цепной реакцией. Для решения данной цели были выдвинуты следующие задачи:
Изучить полипептидный состав разных штаммов сальмонелл.
Определить антигенные свойства полипептидов сальмонелл, различных сероваров.
Провести геноидентификацию штаммов сальмонелл методами ПЦР и RAPD-ПЦР.
Научная новизна. Впервые методами диск-электрофореза в полиакрила-мидном геле в присутствии ДСН и иммуноблоттинга установлены сходства и различия в качественном и количественном составе полипептидов и выявлены специфические антигенно-активные фракции в зависимости от антигенных и вирулентных особенностей штаммов.
Разработан фенольно-детергентный метод выделения тотальной ДНК сальмонелл, позволяющий получать чистые, нативные и концентрированные препараты нуклеиновых кислот возбудителя, на который подана заявка на изобретение (приоритетная справка от 08.04.2002г. №2002109103/13 (009486)).
Создан ПЦР-диагностикум со специфичными праймерами, позволяющий проводить экспресс-индикацию сальмонелл.
Разработан эффективный вариант ПЦР с произвольными праймерами для геноидентификации представителей рода Salmonella.
Практическая ценность. Результаты проведенных исследований рекомендуется учитывать при индикации и дифференциации штаммов возбудителей сальмонеллеза. Выявленные антигенно-активные фракции могут быть использованы для получения высокоспецифичных антигенов и сывороток для создания более совершенных серологических тест-систем диагностики сальмонеллеза.
7 Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:
III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 26 июня - 1 июля 2002).
Научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии (Казань, 2002).
Международной научно-практической конференции по актуальным проблемам болезней молодняка в современных условиях (Воронеж, 2002).
IV Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний" (Москва, 2002).
Международной научно-производственной конференции по актуальным проблемам агропромышленного комплекса, посвященной 130-летию КГАВМ им. Н.Э. Баумана (Казань, 30-31 мая 2003).
Международной научно-практической конференции по актуальным проблемам ветеринарной медицины, посвященной 60-летию факультета ветеринарной медицины УГСХА (Ульяновск, 25-26 сентября 2003)
Ежегодных заседаниях ученого совета ВНИВИ при обсуждении отчетов о НИР (2002, 2003).
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 9 работ, в числе которых 2 статьи и 7 тезисов. Разработаны и утверждены директором ВНИВИ "Методические рекомендации по определению элек-трофоретических и антигенных свойств полипептидов сальмонелл методами диск-электрофореза в ПААГ-ДСН и иммуноблоттинга", "Методические рекомендации по индикации сальмонелл методом ПЦР".
Основные положения, выдвигаемые на защиту:
- Электрофоретические профили и антигенные свойства полипептидов
сальмонелл варьируют в зависимости от их антигенных и вирулентных
особенностей.
Фенольно-детергентный метод выделения хромосомальной ДНК сальмонелл позволяет получать нативные и чистые препараты нуклеиновых кислот возбудителей, пригодные для молекулярно-генетических исследований.
Индикация и геноидентификация сальмонелл методом ПЦР со специфичными и произвольными праймерами.
Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 157 страницах и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов собственных исследований, выводы, практические предложения, библиографический список использованной литературы (248 источников, в том числе 122 иностранных, 6 ссылок на сайты Internet) и приложения. Диссертация содержит 15 таблиц и 17 иллюстраций.
Протеомный анализ и его значение
Одной из наиболее типичных черт развития науки в последние десятилетия является возникновение и бурный рост новых отраслей биологии, таких как молекулярная биология, молекулярная генетика, молекулярная фармакология и др. Все они представляют собой ответвления биохимии и изучают жизненные явления на молекулярном уровне. Важнейшей предпосылкой их быстрого и успешного развития следует считать разработку принципиально новых и высокоэффективных методов разделения сложных смесей макромолекулярных веществ, составляющих основу живой материи. В современной литературе методы, используемые для изучения белков, получили название протеомного анализа [163,178].
К таким методам относятся электрофорез, массспектрометрия, аффинная хроматография, рентгеноструктурный анализ, седементационный анализ, компьютерное моделирование и др.
Ведущее место среди этих методов, бесспорно, принадлежит электрофорезу, который благодаря своей доступности, относительной простоте и разнообразию решаемых с его помощью задач получил необычайно широкое распространение. К настоящему времени разработано огромное множество методических вариантов электрофореза [67, 72, 73].
Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) занимает ведущее положение среди аналитических методов фракционирования белковых молекул за счет высокой разрешающей способности и возможности получения таких характеристик белков, как заряд, молекулярная масса, изоэлектрическая точка, конформация [24]. Диск-электрофорез (от англ. discontinuous - прерывистый) представляет собой метод разделения, в котором используется неоднородная «прерывистая», в отношении рН, разделяющая система с полиакриламидным гелем в качестве носителя.
Применение для дезинтеграции микробной клетки различных синтетических и природных детергентов [31] позволило расширить информативность электрофоретического анализа белков. Особенно большую популярность получил анионный детергент - додецилсульфат натрия (лаурилсульфат натрия, ДСН, SDS), который вводят и в состав разделительной полиакриламидной системы электрофореза. Особенности связывания ДСН с белками [157] позволяют разделяться полипептидам в соответствии с величиной молекулы, то есть по молекулярной массе, которую можно определить по стандартным белкам с известной массой молекул [237].
При температурной обработке белков в присутствии ДСН и восстановителя (например, 2-меркаптоэтанола), они распрямляются и связывают около 1,4 г ДСН на 1 г белка [24]. В результате связывания ДСН полипептидные цепи приобретают однородный электрический заряд, в результате чего отношение заряд/масса у них становится постоянным. Когда в соответствии с этим зарядом они электрофоретически перемещаются в полиакриламидном геле, их подвижность обратно пропорциональна логарифму массы [67], что позволяет определить молекулярную массу исследуемого белка.
Широкое распространение в последнее время находит двумерный (2D) электрофорез, когда разделение макромолекул проводится в двух перпендикулярных друг другу плоскостях, позволяющий составлять пептидные «карты» изучаемых объектов [122, 154, 162, 178, 183, 196, 213].
В настоящее время накоплен обширный материал по анализу белковых спектров самых разнообразных микроорганизмов [9, 23, 36, 42, 46, 49, 60, 79, 84, 155]. В частности, исследования такого рода проводились с представителями родов Brucella [51, 52, 61, ПО], Micobacterium [40, 44, 99, 126], Bacillus [12, 19], Caulobacter [54], Halobacteria [47], Staphylococcus [32, 37, 39, 41]. При изучении растворимого белкового комплекса микобактерий многие исследователи наблюдали четкие межвидовые различия в протеинограммах микобактерий [40, 126].
В отношении изучения полипептидного состава у представителей рода Salmonella в доступной литературе также имеются отдельные сообщения [14, 33], касающиеся сравнительного изучения гидрофобных белков и полипептидных спектров некоторых представителей (S. typhimurium).
Особый интерес представляют данные по анализу спектров мембранных белков в таксономическом аспекте, поскольку мембраны эволюционно консервативные структуры бактериальной клетки, и в тоже время заключают в себе почти все функции общие и специфические, присущие бактериальной клетке в целом [104]. По данным ряда авторов [92, 118, 225] электрофореграммы мембранных белков позволяют идентифицировать бактериальные L-формы. Установлены отчетливые межродовые отличия среди L-форм Proteus, Streptobacillus, Staphylococus, Streptococus. Быстрая идентификация L-форм при этом возможна при сопоставлении с протеинограммами эталонных штаммов.
Белкам внешних мембран микробных клеток в последнее время посвящено большое количество исследований [122, 123, 174, 183]. Такой интерес во многом связан с тем, что в состав внешних мембран микробных клеток входят белки, которые, будучи характерными для данного рода или вида, являются их иммунологическими маркерами и определение антител к ним используется при диагностике инфекционных заболеваний [53].
Белки внешней мембраны микробных клеток оказывают протективное действие при их использовании в виде антигена.
Протективный эффект белков внешней мембраны установлен для таких микроорганизмов, как Salmonella typhimurium [230], Pseudomonas aeruginosa [181], Francisella tularensis [211].
В отношении грамотрицательных бактерий, имеются данные по изучению электрофореграмм белков внешней мембраны, трудно дифференцируемых по фенотипическим признакам микроорганизмов, в частности группа неферме-тирующих глюкозу бактерий рода Pseudomonas [23]. Показано, что спектр белков внешней мембраны может служить критерием оценки принадлежности бактерий к роду Pseudomonas. Этот вывод был подтвержден при идентификации неферментирующих глюкозу бактерий рода Moraxella, Bordetella и Acetobacter. В результате установлен коэффициент подобия внутри каждого рода 98-100%, а между родами 30-50%.
Таким образом, имеющиеся данные типирования культур микроорганизмов по профилям белков внешней мембраны свидетельствуют о их достаточной информативности.
Для применения в практических целях характеристик белкового состава бактерий наиболее привлекательными являются методы, позволяющие простыми способами получить наиболее полную информацию о белковом спектре клетки [13,45, 50,208, 240].
Приведенные данные свидетельствуют о том, что характеристики белкового состава интересны и представляют практическую значимость, как для таксономии, так и в плане практической идентификации и дифференциации бактерий [23, 39-41,45,169, 223].
Изучение антигенной структуры микробных белков, равно, как и выявление антител к отдельным белкам, нередко связано с необходимостью анализа многокомпонентных смесей. Как правило, это обстоятельство требует не только фракционирования анализируемой смеси, но и идентификации полученных фракций. Традиционные методы фракционирования (например, иммунодиффу-зия или иммуноэлектрофорез) зачастую оказываются недостаточно эффективными и не позволяют получать исчерпывающую информацию об антигенной природе изучаемых макромолекул.
В литературе описывается метод иммуноиндикации, сочетающий в себе фракционирование белков с помощью электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН с последующим выявлением антигенных фракций антителами, конъюги-рованными с каким-либо маркером (фермент, биотин-авидин, люминесцентные соединения, тяжелые металлы, радиоизотопы). Метод получил название иммунного ("Western") блоттинга [151, 226].
Анализ полипептидов различных штаммов сальмонелл методом диск-электрофореза в ПААГ-ДСН
В предварительных опытах путем разгонки лизатов сальмонелл в однородных и градиентных системах была установлена наиболее высокая разрешающая способность разделения полипептидов в градиентном полиакриламид-ном геле с концентрацией мономеров 10-20%, которая оказалась наиболее оптимальной для полипептидов сальмонелл. Поэтому, сравнительное изучение полипептидных профилей сальмонелл и близкородственных бактерий проводили с использованием электрофореграмм, полученных в этой системе.
Анализируя полученные данные, следует отметить, что в электрофоре граммах лизатов сальмонелл в градиенте концентрации 10-20% при окраске
Кумасси ярко-голубой R-250, выявлялось от 32 до 41 полипептидных фракций с молекулярной массой от 12,6 до 227,6 кД (рис. 2.2, 2.3, 2.4). Результаты компьютерного анализа электрофореграмм обобщены в таблице 2.3. Обозначения: Мм. — молекулярная масса (кД); % - процентное содержание фракции.
Анализируя данные таблицы 2.3, электрофореграммы и денситограммы лизатов сальмонелл можно отметить, что основное количество белковых фракций распределялось в интервале молекулярных масс от 20,1 до 94 кД, где у них обнаруживалось до 27 фракций. В частности у S. choleraesuis 370 в этой зоне выявлялись до 21 фракции, у S. choleraesuis ТС-177 до 25 фракций, а у S. enter-itidis 418 и 5. typhimurium 371 — 27 и 22 фракции соответственно.
Для всех исследованных штаммов сальмонелл характерно наличие крупномолекулярных полипептидов в интервалах молекулярных масс 219,2-227,6 кД, 97,3-98,7 кД, 76,0-85,0 кД, 50,0-53,5 кД. Обнаружены также сравнительно одинаковые по процентному содержанию полипептидные фракции в диапазоне молекулярных масс 28,0-37,0 кД.
У представителей сероварианта S. choleraesuis присутствовала фракция с молекулярной массой 149 кД, которая не обнаруживалась у S. enteritidis 418 и 5. typhimurium 371. Для представителей S. enteritidis и S. typhimurium, характерным являлось относительно равномерное распределение полипептидных фракций в диапазоне молекулярных масс 30-67 кД (рис. 2.2, таблица 2.3), а так же наличие 13 сравнительно сходных по молекулярной массе, но различающихся по процентному содержанию фракций (103,1-103,5 кД; 97,3-97,6 кД; 76,1-76,4 кД; 61,1-61,4 кД; 53,3-53,5 кД; 41,0-41,4 кД; 31,3-31,4 кД; 29,0-29,3 кД; 22,2-22,4 кД; 20,3-20,5 кД; 18,5-18,9 кД; 18,0-18,1 кД; 16,6-16,7 кД). Электрофоретические профили шт.370 (вирулентный) и шт.ТС-177 (вакцинный) характеризовались наличием 13 общих мажорных фракций с молекулярными массами 15,8; 17,5; 18,5; 20,5; 28,0; 29,0; 37,0; 42,0; 45,0; 50,0; 53,0; 149,0; 219,2 кД. Необходимо отметить, что процентное содержание каждой из этих фракций преобладало у штамма 370. Так, у вирулентного штамма S. choleraesuis 370 концентрация этих полипептидов составляла 3,46; 6,69; 5,28; 5,59; 2,77; 2,92; 7,31; 6,69; 6,59; 5,29; 7,88; 5,78 и 2,60% соответственно, тогда как у вакцинного ТС-177 эти полипептиды обнаружены относительно в малом количестве (2,32; 3,46; 1,00; 4,84; 2,09; 1,93; 4,80; 4,99; 3,97; 1,30; 5,70; 0,15 и 2,42%). Общее же количество полипептидов составляло у шт. S. choleraesuis 370 - 33, у шт. S. choleraesuis ТС-177 - 36 фракций. В то же время выявлялись и отличия между ними в содержании отдельных полипептидов: у шт. S. choleraesuis ТС-177 отсутствовали фракции с молекулярной массой 12,7; 13,7; 15,0; 16,5; 21,9; 24,0; 25,8; 35,2; 38,5; 43,0; 48,0; 60,0 и 73,7 кД, обнаруженные у S. choleraesuis 370, и присутствовали полипептиды с молекулярными массами 24,9; 36,0; 40,1; 49,0; 58,2; 65,0; 71,2 и 88,4 кД, не характерные для вирулентного штамма 370.
Сравнительный анализ полипептидных фракций штаммов S. enteritidis 418 и S. typhimurium 371 выявил у них четыре общие фракции с молекулярной массой 23,6; 37,0; 43,0 и 46,0 кД, из которых фракции 23,6 и 37,0 кД имели практически одинаковое содержание с незначительными колебаниями 5,67-5,69% и 3,40-3,42% соответственно. По молекулярной массе и содержанию остальных фракций штаммы различались между собой. У 5". typhimurium 371 не обнаруживались низкомолекулярные фракции с молекулярными массами менее 16,0 кД, выявляемые у представителей S. choleraesuis и 5". enteritidis.
Штамм S. typhimurium 371 имел сходство с обоими представителями S. choleraesuis (шт. 370 и шт. ТС-177) по трем полипептидным фракциям - 18,5; 37,0 и 219,2 кД, а с электрофоретическим профилем 5". choleraesuis ТС-177 еще по четырем полипептидам с молекулярными массами 23,6; 24,9; 76,4 и 88,4 кД.
Полипептиды изучаемых штаммов сальмонелл характеризовались различными относительными электрофоретическими подвижностями (таблица 2.4). Таблица 2.4 - Электрофоретическая подвижность полипептидов сальмонелл в градиентном геле с концентрацией акриламида 10-20% (окраска Кумасси ярко-голубой R-250; п=5)
Rf (Retardation factor) - относительная электрофоретическая подвижность белков в ПААГ.
Основная масса полипептидов сальмонелл обладала средней электрофо-ретической подвижностью, при этом процент фракций варьировал в зависимости от штаммов.
Для изучения полипептидных профилей сальмонелл в сравнении с другими представителями кишечной группы бактерий были взяты штаммы Е. coli 1257 и Y. enterocolitica шт. "Шойбулакский". Полипептидные спектры лизатов этих бактерий в значительной степени отличались от сальмонелл. В частности, электрофоретические профили Е. coli 1257 и Y. enterocolitica имели большее количество полипептидных фракций по сравнению с сальмонеллами в интервале молекулярных масс от 14,4 до 94 кД (рис. 2.2). У штамма Е. coli 1257 выявлялась полипептидная фракция с большим процентным содержанием (10,3%), с молекулярной массой 43 кД. В тоже время, обнаруживались, полипептиды
сходные по молекулярной массе и процентному содержанию с сальмонеллами.
Известно, что использование нескольких методов окрашивания может служить источником дополнительной информации при изучении электрофоре-тических свойств белковых смесей [38]. Мы в своей работе для изучения белкового полиморфизма сальмонелл использовали два различных метода окрашивания: белковым красителем Кумасси ярко-голубой R-250 и импрегнацией азотнокислым серебром.
На рисунках 2.5, 2.6 и 2.7 представлены результаты диск электрофореза полипептидов ДСН-лизатов сальмонелл, окрашенных азотнокислым серебром в градиенте концентрации ПААГ 10-20%. Анализируя полученные данные, следует отметить, что метод окрашивания азотнокислым серебром превосходит по чувствительности методы с применением красителей для выявления белков, так как обеспечивает обнаружение дополнительных фракций.
В таблице 2.5 представлены данные о молекулярной массе и процентном содержании белковых фракций в градиенте концентрации 10-20% после окрашивания азотнокислым серебром. Этот метод окраски позволил выявлять до 49 фракций в диапазоне молекулярных масс от 12,4 до 238,9 кД. Можно отметить то, что у всех исследованных сальмонелл при импрегнации азотнокислым серебром выявлялись дополнительно высокомолекулярные полипептиды, с молекулярной массой 238,4-238,9 кД.
Разработка модифицированного способа выделения ДНК сальмонелл для молекулярно-генетических исследований
Этап выделения нуклеиновых кислот при проведении молекулярно-генетических исследований в большинстве случаев предшествует проведению собственно анализа и, хотя методы экстракции ДНК и РНК из микробной клетки разработаны уже давно, для отдельных микроорганизмов требуется их модификация, кроме того, методы анализа генома предъявляют высокие требования к качеству используемого генетического материала.
В связи с этим, нами был разработан фенольно-детергентный метод выделения ДНК. Данный способ выделения ДНК осуществляется следующим образом:
Выделение ДНК сальмонелл фенолъно-детергентным методом. 1.) В 200 мкл стерильной дистиллированной воды суспендировали 1 мг смытой с МПА и сконцентрированной культуры сальмонелл. К полученной суспензии бактерий добавляли равный объем лизирующего раствора (80% фенол, 1,2% NaOH, 1% ДСН, рН 9,3-9,5) тщательно пипетировали и выдерживали при температуре 37С в термостате в течение 1 часа, время от времени перемешивая содержимое пробирки аккуратным покачиванием. 2.) После экспозиции к лизату добавляли 200 мкл хлороформа, перемешивали содержимое пробирки, пока не образовывалась эмульсия. Затем смесь центрифугировали при 7000g в течение 5 мин. Отбирали образовавшуюся водную фазу и повторно проводили экстракцию хлороформом в соотношении 1:1 и вновь проводили центрифугирование экстракта. 3.) К извлеченной после последнего центрифугирования водной фазе добавляли 2 объема 96% этанола. Полученную смесь тщательно перемешивали и 1 час экспонировали при минус 20С. 4.) ДНК осаждали путем центрифугирования при 7000g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливали, осадок промывали 70% этанолом и подсушивали при комнатной температуре. ДНК растворяли в 100 мкл ТЕ буфера (10л Мтрис-НС1,1 ліМЗДТА, рН 8,0).
Как видно из вышеизложенного, принцип метода заключается в том, что разделения реакционной смеси на две фазы (фенол-вода) не происходит за счет наличия в лизирующем растворе фенолята натрия, образующегося в результате взаимодействия фенола с гидроксидом натрия. Фенол, как сильный акцептор протонов, разрушает водородные связи между нуклеиновой кислотой и белками, способствуя диссоциации нуклеопротеидного комплекса. Фенол, кроме того, вызывает денатурацию белков, что еще более снижает их растворимость в воде.
Высокая депротеинизирующая активность используемой смеси позволяет заменить резкое встряхивание препарата осторожным медленным перемешиванием и тем самым свести к минимуму гидродинамические воздействия на освобождающиеся нуклеиновые кислоты.
Спектрофотометрические показатели полученных препаратов ДНК (А260/А280) варьировали в пределах 1,8-2,0, что говорит о высокой степени чистоты препаратов ДНК от примесей белков и фенола.
Практический выход ДНК сальмонелл составил 18,8-20,4 мкг/мг сухой массы микроорганизмов.
Для оценки нативности нуклеиновых кислот растворы ДНК, полученные фенольно-детергентным методом в количестве 1 мкг, вносили в лунки 0,8% агарозного геля, содержащего этидиум бромид в концентрации 0,5 мкг/мл и подвергали горизонтальному электрофорезу в буфере ТАЕ при напряжении 5 В/см в течение 1-2 часов [65].
ДНК определяли по наличию светящейся в ультрафиолетовом свете на-тивной фракции, отошедшей на расстояние 0,2-0,5 см от лунки, в которую была внесена проба.
Кроме того, с целью сравнения, нами для выделения ДНК сальмонелл были испытаны следующие методы: метод щелочного лизиса по Н. Bimboim и
J. Doly [127]; метод J. Marmur [179]; метод L. Gafford и С. Randall [149], модифицированный А.Р. Садриевым с соавт. [87].
Результаты этих исследований представлены на рис. 2.11.
Как видно из рисунка, при выделении ДНК сальмонелл методом щелочного лизиса по Н. Birnboim и J. Doly получить нативные экстракты нуклеиновой кислоты в виде дискретной полосы не удалось. ДНК при этом разрушалась, о чем свидетельствует шлейф по треку разгонки препаратов нуклеиновой кислоты.
Применение метода J. Marmur вызвало частичное разрушение ДНК. Спектрофотометрические показатели полученных препаратов (А260/А280) колебались в пределах 1,5-1,6, что свидетельствует о наличии в них примеси белков, поэтому точное измерение количества ДНК в данном случае было невозможным.
При использовании метода L. Gafford и С. Randall в модификации А.Р. Садриева с соавт. структура ДНК не нарушалась, о чем свидетельствовало расположение фракции нуклеиновой кислоты в начале трека. Спектрофотометрические показатели полученных препаратов ДНК (А2бо/Аг8о) колебались в пределах 1,8-1,9, что говорит о высокой степени чистоты препаратов ДНК от примесей белков. Практический выход ДНК сальмонелл составил 17,0-18,7 мкг/мг сухой массы микроорганизмов (50-55% от всей ДНК микробной клетки).
Однако отрицательным свойством данного метода является его длительность из-за того, что при использовании этой методики необходимо проводить инкубацию реакционной смеси в течение 16-18 часов. Кроме того, указанный метод предполагает 4-х кратную экстракцию хлороформом, что в значительной степени усложняет и удлиняет процесс выделения ДНК.
Преимущества предложенного нами фенольно-детергентного метода заключаются в том, что метод прост в применении, непродолжителен по времени и дает приемлемые результаты в отношении нативности, чистоты и концентрации препаратов ДНК сальмонелл.
В дальнейшем нами планировалось использовать полученные препараты ДНК в молекулярно-генетических исследованиях, в частности в полимеразной цепной реакции.
Выявление гипервариабельных областей генома сальмонелл методом ПЦР, с использованием произвольных праймеров
В наших опытах была предпринята попытка провести дифференциацию штаммов сальмонелл при помощи ПЦР с произвольными праймерами. С этой целью опробовали одиночные синтетические олигонуклеотиды, с длиной 10, 18 и 19 нуклеотидов и имеющие следующие последовательности: #128 5 - GCATATTCCG -З7 #129 -GCGGTATAGT-y VI 5;- CCAGAGTCTACACCATAAC -3 V3 5 - AACGATCGCAGCGATGAC -3; Путем варьирования количеством компонентов, температуры, времени и количества циклов в предварительных экспериментах определили оптимальный режим проведения ПЦР с каждым из праймеров, результаты которых представлены в таблицах 2.10,2.11.
Подготовку проб для ПП-ПЦР проводили по следующей методике: суспензии микроорганизмов каждого штамма (концентрация 1 млрд. м.к./мл) ли-зировали воздействием 10 MNaOH до конечной концентрации 0,2 М с последующим осторожным перемешиванием и добавлением через 10-20 секунд 2 М tris-HCl (рН 7,4) до конечной концентрации 0,66 М.
После центрифугирования при 7000 g - 3 мин, 10-кратно разведенный су-пернатант использовали в качестве пробы для ПЦР.
Амплификацию полиморфных локусов ДНК (ПП-ПЦР) с произвольным праймером #129 выполняли в объеме 25 мкл с содержанием 2 мкл ДНК содержащей пробы, 60 мМ tris-HCl (рН 8,5), 2,5 мМ MgCl2, 25 мМ КС1, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,1% тритона Х-100, 200 мкМ dNTPs, 1 мкМ праймера и 0,625 ед. акт. Taq polymerase. Расчетный состав компонентов реакционной смеси для праймера #129 представлен в таблице 2.12.
Для произвольных праймеров VI, V3 реакционная смесь имела следующий состав: 2 мкл ДНК содержащей пробы, 60 мМ tris-HCl (рН 8,5), 3,5 мМ MgCh, 25 мМ КС1, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,1% тритона Х-100, 200 мкМ dNTPs, 5 мкМ праймера и 0,625 ед. акт. Taq polymerase. Состав компонентов представлен в таблице 2.13.
Продукты амплификации вносили в лунки 2% агарозного геля с содержанием бромистого этидия 0,5 мкг/мл и подвергали горизонтальному электрофорезу в буфере ТБЕ при напряжении 10 В/см в течение 1,5-2 часов с последующей визуализацией в УФ-трансиллюминаторе и фотографированием. Соблюдая вышеуказанные условия ПП-ПЦР, проводили сравнительные исследования геномов сальмонелл следующих штаммов:
S. choleraesuis 370 (вирулентный), S. choleraesuis ТС-177 (вакцинный), S. typhimurium 371 (вирулентный), S. typhimurium 3 (вакцинный), S. enteritidis 418 (патогенный изолят от больного человека). Было установлено, что праймер #128 при опробованных нами различных температурных режимах и составах реакционной смеси не приводил к ампли-фицированию участков исследуемых ДНК сальмонелл (отсутствие ампликонов в агарозном геле). Поэтому последующие серии опытов проводились с прайме-рами VI, V3 и #129.
Праймер VI в ПП-ПЦР со всеми исследуемыми геномами сальмонелл генерировал появление одного ампликона, с длиной 1200 пар нуклеотидов (рис. 2.15).
Стрелкой обозначен генерируемый фрагмент - 1200 bp Как видно из рисунка амплификации - праймер VI не позволяет провести дифференциацию исследованных штаммов сальмонелл, по причине наличия одного ампликона равной длины у всех представителей.
В наших дальнейших исследованиях использовался праймер V3. Полученные результаты ПЦР показаны на рис. 2.16 и в таблице 2.14.
Как видно из рисунка 2.16 и таблицы 2.14, ПЦР с праймером V3 обеспечивает возможность серовариантной дифференциации исследованных сальмонелл, не позволяя различать штаммы одного сероварианта, в данном случае -вакцинные и патогенные.
В результате ПП-ПЦР с праймером V3 в фореграммах исследованных штаммов сальмонелл наряду с различающимися содержалось по 6 одинаковых мажорных ампликонов со следующими длинами: 2019, 955, 718, 568 и 419 пар нуклеотидов. Кроме того, фореграммы серовариантов S. choleraesuis и S. typhimurium имели по одному одинаковому ампликону длиной 442 п.н., а фореграмма штамма S. enteritidis 418 содержала 4 фрагмента одинаковых по длине с фрагментами фореграмм S. typhimurium: 1546,1162, 785 и 376 п.н.
При проведении ПП-ПЦР с ДНК штаммов S. choleraesuis 370 и S. choleraesuis ТС-177 праймер V3 генерирует образование 9 ампликонов у каждого штамма длиной 2019, 1602, 1317, 955, 843, 718, 568, 442 и 419 п.н. Фореграмма продуктов ПП-ПЦР с ДНК S. choleraesuis отличалась от таковых S. typhimurium (штаммы 371 и 3) - наличием ампликонов длиной 1602, 1317 и 843 п.н. и отсутствием ампликонов длиной 1546, 1162, 785, 644 и 376 п.н.; штамма S. enteritidis - отсутствием ампликонов длиной 1546, 1162, 785, и 376 п.н. и наличием ампликонов длиной 1602,1317, 843 и 442 п.н.
При проведении ПП-ПЦР с ДНК штаммов S. typhimurium 371 и S. typhimurium 3 с праймером V3 образовались 11 ампликонов у каждого штамма длиной 2019, 1546,1162, 955, 785, 718, 568, 644,442,419 и 376 п.н. Фореграмма продуктов ПП-ПЦР с ДНК S. typhimurium отличается от таковых S. choleraesuis (штаммы 370 и ТС-177) наличием ампликонов длиной 1546, 1162, 785, 644 и 376 п.н. и отсутствием ампликонов длиной 1602, 1317 и 843 п.н.; штамма S. enteritidis 418 — наличием ампликонов длиной 644 и 442 п.н.
