Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Гибридизационно-флуоресцентные амшшфикационные тест-системы в ДІЖ-диагностике инфекционных заболеваний 14
1.2. Молекулярно-генетические методы идентификации патогенных буркхольдерий 24
1.3. Способы подготовки проб исследуемого материала и очистки ДНК микроорганизмов для проведения генодиагностики 32
ГЛАВА 2. Материалы и методы 40
2.1. Штаммы микроорганизмов, питательные среды, условия культивирования 40
2.2. Подготовка проб биологического материала, из объектов внешней среды и пищевых продуктов для анализа методом ПЦР 45
2.3. Концентрирование клеток патогенных буркхольдерий на этапе подготовки проб из объектов внешней среды 46
2.4. Выделение ДНК 47
2.5. Постановка реакции амплификации с флуоресцентными олигонуклеотидными зондами 51
2.6. Проведение электрофореза и флуоресцентная детекция продуктов амплификации. Учет результатов ПЦР 53
2.7. Моделирование экспериментальной инфекции 53
2.8. Статистическая обработка результатов 54
ГЛАВА 3. Подбор праймеров и олигонуклеотидньк зондов для конструирования гибридизационно -флуоресцентных амплификациошшх тест-систем 55
3.1. Выбор и характеристика праймеров и гибридизационных олигонук-леотидных зондов для обнаружения Burkholderia pseudomallei и Burk-holderia mallei 55
3.2. Оптимизация условий проведения реакции амплификации на препаратах ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза 61
ГЛАВА 4. Оценка специфичности сконструированных праимеров и зондов для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза
ГЛАВА 5. Выбор оптимального способа подготовки проб почвы и пищевых продуктов для последующей постановки ПЦР 82
5.1. Определение эффективности различных способов очистки и выделения ДЬЖ возбудителей сапа и мелиоидоза для их обнаружения методом ПЦР в пробах почвы и пищевых продуктов 82
5.2 Использование магноиммуносорбентов при исследовании проб, контаминированных патогенными буркхольдериями
ГЛАВА 6. Генодиагностика сапа и мелиоидоза при экспериментальной инфекции
Заключение 98
Выводы 108
Список литературы 111
- Гибридизационно-флуоресцентные амшшфикационные тест-системы в ДІЖ-диагностике инфекционных заболеваний
- Штаммы микроорганизмов, питательные среды, условия культивирования
- Выбор и характеристика праймеров и гибридизационных олигонук-леотидных зондов для обнаружения Burkholderia pseudomallei и Burk-holderia mallei
- Определение эффективности различных способов очистки и выделения ДЬЖ возбудителей сапа и мелиоидоза для их обнаружения методом ПЦР в пробах почвы и пищевых продуктов
Введение к работе
Патогенные буркхольдерии - Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei - являются возбудителями особо опасных инфекций. В силу изменившихся социально-экономических условий (расширение транспортных связей, туристические поездки в эндемичные области, миграция населения, завоз экзотичных животных) возникает угроза чрезвычайных ситуаций, увеличивающих риск поражения людей опасными биологическими агентами, в том числе патогенными буркхольдериями. Кроме того, потециальная возможность применения возбудителей сапа и мелиоидоза в качестве биологического оружия, внезапность его использования с поражением людей и животных, контаминацией питьевой воды, пищевых продуктов и объектов окружающей среды требуют повышенной готовности к реагированию органов здравоохранения.
Необходимость верификации диагноза в первые дни заболевания предопределяет высокие требования к чувствительности, специфичности и экс-прессности методов лабораторной диагностики инфекций, вызываемых данными микроорганизмами.
Одним из таких методов является полимеразная цепная реакция, к достоинству которой, наряду с высокой специфичностью и быстротой получения результатов, относится возможность выявления низких концентраций возбудителей инфекций в различных биологических объектах и пробах окружающей среды.
Зарубежными и отечественными исследователями опубликованы данные о конструировании различных праймеров для идентификации патогенных буркхольдерии. В качестве ДНК мишеней были рекомендованы гены 16SpPHK [77], 23SpPHK [155], спейсерные области 16-23SpPHK [149], кластер генов LPS, кодирующий капсульный липополисахарид [211], гены системы Ш-типа секреции (TTS1) [196, 281], флагеллярный ген [50]. В боль- шинстве работ использовался ПЦР-анализ с электрофоретической детекцией [71, 77, 109, 149, 155, 183, 196, 281].
Однако при анализе большого количества проб и использовании для детекции продуктов амплификации электрофоретического оборудования существует вероятность получения ложноположительных результатов, связанных с контаминацией реакционных смесейспецифическими ампликонами. В связи с этим возникает необходимость использования альтернативных способов детекции ПЦР-продуктов, позволяющих учитывать результаты реакции, не открывая пробирки. Одним из таких подходов является разработка ПЦР-тест-систем с флуоресцентной детекцией [79, 195]. В основе методов лежит специфическая флуоресцентная гибридизация в процессе амплификации, регистрируемая детектором флуоресценции по окончании реакции [95, 107, 226] или в режиме реального времени [115, 195].
Применение гибридизационно-флуоресцентных систем детекции без открывания пробирки исключает рассеивание продуктов амплификации — основного источника ложноположительных результатов ПЦР, а таюке обеспечивает объективный аппаратный учет результатов [130, 234]. Детекция в режиме реального времени позволяет наглядно отображать этапы ПЦР и количественно оценивать продукты реакции [128]. Кроме того, регистрация прибором флуоресценции разной длины волны позволяет применять ДІЖ внутреннего контроля для подтверждения достоверности отрицательных результатов.
Данный метод обнаружения возбудителей особо опасных инфекций (ООИ) отличает высокая чувствительность, специфичность, быстрота получения результатов, возможность автоматизации при минимальном объеме исследуемого материала.
Снижение требований к организации ПЦР-лабораторий, а также способность выполнения ПЦР-анализа силами одного сотрудника позволяет использовать такие амплификационные тест-системы в условиях автономной мобильной ПЦР-лаборатории.
Мобильные ПЦР-лаборатории с набором диагностических гибридиза-ционно-флуоресцентных тест-систем могут быть использованы как в составе специализированных противоэпидемических формирований, так и в лабораториях, осуществляющих плановый территориальный эпидемиологический мониторинг. Однако для выявления возбудителей сапа и мелиоидоза такие тест-системы до сих пор не разработаны.
На основании вышеизложенного, создание гибридизационно-флуоресцентных ПЦР-тест-систем для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза остается актуальным по сегодняшний день.
Цель работы - конструирование специфичных флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов и разработка методических подходов для специфической индикации и ускоренной идентификации патогенных буркхольдерий с помощью ПЦР с флуоресцентной детекцией результатов.
Задачи исследования:
Подобрать специфичные праймеры и олигонуклеотидные зонды на основе нуклеотидных последовательностей генов 23SрРНК, III типа секреции (TTST) и флагеллярного гена fliC для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза.
Определить основные параметры ПЦР, обеспечивающие высокую чувствительность и специфичность выбранных праймеров и олигонуклеотидных зондов, на широком наборе гомологичных и гетерологичных видов микроорганизмов. Оптимизировать условия проведения ПЦР на приборах с детекцией «по конечной точке» и в режиме реального времени для выявления патогенных буркхольдерий.
Провести анализ различных способов очистки и выделения ДНК патогенных буркхольдерий из биологического материала и объектов окру- жающей среды для исследования методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов.
Оценить возможность использования магноиммуносорбентов на этапе подготовки проб из объектов окружающей' среды и пищевых продуктов для исследования методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов на наличие ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза.
Оценить эффективность применения сконструированных праймеров и зондов для ускоренной идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза при экспериментальной инфекции.
Научная новизна:
Для идентификации патогенных буркхольдерий впервые сконструированы олигонуклеотидные флуоресцентно-меченые зонды, являющиеся фрагментами генов 23S рРНК, III типа секреции (TTSI) и флагеллярного гена fliC, на основе которых возможна разработка амплификационных тест-систем для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза с регистрацией результатов амплификации «по конечной точке» и в режиме реального времени.
Определена высокая эффективность использования ПЦР с флуоресцентной детекцией результатов как при идентификации чистых культур патогенных буркхольдерий, так и при выявлении ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза в пробах из объектов внешней среды, в пищевых продуктах, искусственно контаминированных В. mallei и В. psendomallei, а также в биологическом материале от экспериментально зараженных животных.
Впервые проведен сравнительный анализ эффективности олигонуклео-тидных праймеров и флуоресцентных зондов с учетом результатов амплификации как «по конечной точке», так и в режиме реального времени для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза. Показано, что ПЦР в режиме реального времени, в отличие от флуоресцентной детекции «по конечной точке», позволяет не только наглядно отображать этапы ПЦР, но и количест- венно оценивать продукты реакции при выявлении ДНК патогенных бурк-хольдерий.
Предложены эффективные способы подготовки проб различного характера, инфицированных патогенными буркхольдериями, для анализа методом ПЦР. Впервые представлены доказательства использования магноимму-носорбентов (МИС) с целью селективного концентрирования клеток возбудителей сапа и мелиоидоза на этапе пробоподготовки и очистки ДНК от примесей веществ, ингибирующих ПЦР.
Показана возможность использования олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов для конструирования амплификационных тест-систем с целью выявления патогенных буркхольдерий в условиях работы передвижной автономной ПЦР-лаборатории.
Практическая ценность:
В результате проведенных исследований созданы экспериментальные серии тест-систем для ускоренной идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза в биологическом материале и объектах окружающей среды методом ПЦР с флуоресцентной детекцией.
По результатам работы составлены методические рекомендации, утвержденные директором ВолгоградНИПЧИ (протокол № 10 от 26.12.07 г.), по использованию ПЦР с флуоресцентной детекцией для идентификации В.mallei и В. pseudomallei, выявления возбудителей сапа и мелиоидоза в пробах из объектов внешней среды и пищевых продуктов, контаминированных патогенными буркхольдериями, а также при различных экспериментальных формах сапа и мелиоидоза.
Показано, что разработанные олигонуклеотиды в составе диагностических тест-систем, могут быть использованы для исследования проб из объектов внешней среды, пищевых продуктов и биологического материала, подозрительных на контаминацию В. mallei и В. pseudomallei, как в стационарной специализированной лаборатории, так и в условиях передвижной автономной ПЦР-лаборатории.
По результатам работы проведены межведомственные комиссионные испытания в соответствии с Программой, согласованной с генеральным директором ЗАО НПФ «ДНК-технология» Д.Ю. Трофимовым и утвержденной директором Волгоградского научно-исследовательского противочумного института В.В. Алексеевым и генеральным директором ООО «РБ-спектр» А.А. Семенюком 16.01.2008 года.
Материалы диссертационной работы используются сотрудниками института в рамках учебных программ по первичной специализации и перепо-готовке специалистов: Программы курсов повышения квалификации бактериологов и эпидемиологов по противодействию биотерроризму, утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 01.02.2001 г., Программы курсов повышения квалификации врачей — бактериологов общей медицинской сети, центров Госсанэпиднадзора и противочумных учреждений по специфической индикации и лабораторной диагностике особо опасных инфекций, санитарной охране территории и противоэпидемической защите населения, утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 28.09.1999 г., а также Программы курсов повышения квалификации медицинских работников (с высшим и средним специальным образованием) сани-тарно-карантинных пунктов и отделов (СКП и СКО), утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко. Кроме того, материалы настоящей работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий для студентов медико-биологического факультета Волгоградского государственного медицинского университета.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Системы олигонуклеотидов, сконструированные на основе участков генов 23S рибосомальной РНК, orflS из кластера генов III типа секреции (TTSl) и флагеллярного гена/ІіС, включающие прямые, обратные праймеры и гибридизационные зонды, меченые флуорофорами, обеспечивают как специфическую амплификацию фрагментов ДНК, так и регистрацию результатов реакции по повышению уровня флуоресценции.
Гибридизационно-флуоресцентные олигонуклеотидные зонды трех ДНК-мишеней - участков генов 23S рРНК, fliC и orfl3 увеличивают специфичность реакции амплификации и повышают достоверность результатов при индикации и идентификации В. mallei и В. pseudomallei.
Системы олигонуклеотидов, разработанные для обнаружения генов 23S рРНК, orfl3 и флагеллярного гена fliC, позволяют идентифицировать чистые культуры патогенных буркхольдерий при их концентрации 1 х 103 м.к./мл в условиях гибридизационно-флуоресцентной детекции «по конечной точке» и 1 х 10 м.к./мл с детекцией в режиме реального времени.
Олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные зонды пригодны для специфической индикации возбудителей сапа и мелиоидоза при исследовании проб из объектов окружающей среды, пищевых продуктов, искусственно контаминированных В. mallei и В. pseudomallei, а также биологического материала, полученного от экспериментально зараженных животных.
Использование магноиммуносорбентов на этапе подготовки проб из объектов окружающей среды и пищевых продуктов для исследования методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов обеспечивает выявление ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза при их концентрации не менее 1x10 м.к./мл (г).
Апробация работы
Основные материалы диссертации были представлены на конференции к 100-летию Астраханской противочумной станции «Природно-очаговые особо опасные инфекции на Юге России, их профилактика и лабораторная диагностика» (Астрахань, 2001); на зарубежной научной конференции «Natu- ral infectious diseases» (Монголия, 2001); VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002); VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005); Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Новосибирск, 2005); научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2006); VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств» (Оболенск, 2006); XI Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2006), IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии Борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007), V международном конгрессе по мелиоидозу (Thailand, 2007), IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества Независимых Государств» (Волгоград, 2008), 66-й юбилейной научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2008), а также на ежегодных итоговых научных конференциях Волгоградского НИПЧИ.
По теме диссертации опубликовано 18 научных работ, из них 3 - в рецензируемых периодических изданиях, рекомендованных ВАК для защиты докторских и кандидатских диссертаций, 3 — в зарубежной печати.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 136 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 6-ти глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 283 источника, в том числе 38 отечественных и 245 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 16 рисунками.
Гибридизационно-флуоресцентные амшшфикационные тест-системы в ДІЖ-диагностике инфекционных заболеваний
В большинстве ПНР-лабораторий используется детекция продуктов реакции амплификации методом электрофореза в агарозном геле. Данный способ прост в исполнении и обладает достаточной чувствительностью. Однако его использование может приводить к контаминации реакционных смесей специфическими ампликонами. В связи с этим возникает необходимость в использовании альтернативных способов детекции ПЦР-продуктов, позволяющих учитывать результаты реакции, не открывая пробирки, и в настоящее время для этих целей все большее применение находят флуоресцентные методы. Внедрение гибридизационно-флуоресцентных ПЦР-тест систем для идентификации патогенных микроорганизмов стало возможным благодаря широкодоступным флуоресцентным детекторам продуктов реакции амплификации. Их использование позволяет исключить этап электрофореза, являющийся основным источником ложноположительных ПЦР-результатов, и снимает проблему контаминации. Флуоресцентные технологии отличает безопасность и высокая чувствительность, благодаря чему они приобретают все более широкое распространение.
Существует два типа детекции: «по конечной точке» (измерение уровня флуоресцентного сигнала по окончании ПЦР) [97, 106, 226] и в режиме реального времени (регистрация флуоресценции в процессе реакции амплификации) [79, 195]. Причем, в обоих случаях детекция проводится без открывания пробирок и извлечения продуктов реакции из них, что значительно снижает риск контаминации. Детекцию продуктов ПЦР проводят с помощью специальных приборов - ПЦР-детектора или термоциклера с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме реального времени.
На начальных циклах ПЦР флуоресценция выражена мало и мало изменяется. Этот уровень свечения называется базовым. Сигнал флуоресценции в ходе ПЦР возрастает пропорционально количеству продукта амплификации [128, 200]. Мониторинг сигнала позволяет построить кинетическую кривую реакции, при этом момент заметного увеличения сигнала и отрыва его от фонового — так называемый пороговый цикл (Ct, threshold cycle), т.е. цикл, когда интенсивность флуоресценции начинает превышать базовый порог. Чем больше количество ДНК в образце, тем раньше наблюдается начало роста сигнала флуоресценции и тем меньше пороговый цикл [154, 174].
Существует два методических подхода при флуоресцентной детекции результатов ПЦР. Неспецифическая - обнаруживает любую двухцепочечную ДНК, образующуюся в процессе реакции, включая, помимо искомой последовательности, также праймер-димеры и другие неспецифические продукты амплификации [130, 269]. При специфической детекции - лишь интересующую последовательность [73].
Стандартным методом неспецифической детекции двухцепочечной ДНК является использование интеркалирующих красителей, флуоресцирующих только при связывании с ДНК [130], которые уже давно используются для обнаружения продуктов ПЦР методом электрофореза в агарозном геле. В качестве основных представителей этих веществ можно назвать бромистый этидий, красители SYBR Green I и SYBR Gold. К преимуществам применения интеркалирующих агентов следует отнести низкую стоимость реактивов и возможность использования их с готовыми тест-системами. К недостаткам - высокую канцерогенную способность бромистого этидия, вероятность неспецифических реакций и, как следствие, получение ложноположительного результата [223]. Кроме того, использование данной технологии невозможно в мультиплексном формате.
Альтернативным методом является ПЦР в режиме реального времени [79, 195], при котором происходит детекция только специфического продукта амплификации. Существует множество специфических систем детекции, которые используют различные ДНК-зонды. Эти зонды могут быть мечены широким рядом красителей, которые отличаются друг от друга различными спектрами возбуждения и эмиссии. Все зонды имеют флуорофор - молекулу, обладающую способностью к флуоресценции в результате поглощения энергии света определенной длины волны и переизлучению ее на другой длине волны, и гаситель флуоресценции, который значительно изменяет уровень флуоресценции при нахождении флуорофора и гасителя в непосредственной близости друг к другу [154, 174]. Различают два основных типа гасителей — флуоресцирующие и «темновые». В первом случае, переданная гасителю энергия излучается в виде света, отличающегося от свечения свободного от гасителя флуорофора, а во втором — рассеивается в виде тепла, т.е. свечение отсутствует. Эффект гашения резко снижается при увеличении расстояния между молекулами флуорофора и гасителя. В большинстве случаев нарушение этого гасящего взаимодействия вызывает увеличение флуоресценции, пропорциональное образованию продукта.
Преимущество флуорогенных зондов перед ДНК-связывающимися красителями в том, что специфическая гибридизация между зондом и мишенью приводит к генерации флуоресцентного сигнала. Другим преимуществом флуорогенных зондов является то, что они могут быть мечены различными флуорофорами. Используя зонды, меченные различными флуорофора-ми, можно обнаружить нескольких амплифицированных последовательностей в одной реакции ГЩР.
Существует несколько типов зондов: гидролизные [83], и гибридизаци-онные [73]. К гидролизным зондам относятся TaqMan зонды [127], Molecular Beacons [150, 160, 248] и Scorpions [103, 213, 228].
Штаммы микроорганизмов, питательные среды, условия культивирования
Еще 20 лет назад [242] показано, что такая минимальная обработка проб, как прогрев осадка промытых клеток в буфере, содержащем неионный детергент, позволяет более эффективно обнаруживать бактерии в клинических пробах. Простой термический лизис не всегда достаточен, но проведение его в присутствии сорбента-катионообменника или амфолита, связывающего ингибиторы ПЦР и оставляющего в растворе ДНК, обеспечивает эффективное обнаружение патогенов в клеточных осадках. Примером реагента для такой обработки проб является лизирующий буфер с сорбентом. В настоящее время широко используется лизис биоматериала в высокоионной денатурирующей среде - концентрированный йодистый натрий или гуани-динтиоцианат, протеиназа К [16], протеиназа К - SDS [16, 17, 77], лизоцим и протеиназа К, лизоцим — SDS, ионные (SDS) и (или) неионные детергенты (Triton Х-100) [16, 17, 173], NaQH с нейтрализацией рН НС1 [30], NaOH -SDS [14, 17] с последующим спиртовым высаживанием нуклеиновых кислот.
Другой способ выделения нуклеиновых кислот - метод фенольной де-протеинизиции [17] — обеспечивает высокую их сохранность и чистоту, так как основная часть белковых веществ удаляется на стадии разделения водной и фенольной фазы перед спиртовым высаживанием нуклеиновых кислот. Однако этот метод предусматривает использование реагентов, содержащих токсичные компоненты (фенол и хлороформ), а также является более трудоемким по сравнению с однопробирочным способом.
Выделение нуклеиновых кислот путем гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформной экстракции применяется при исследовании клеточной мРНК, вирусных ДНК и РНК, в настоящее время он упрощен благодаря комбинации денатурирующего агента (гуанидинтиоцианата) и фенола в одном растворе [62]. Различные коммерческие фирмы предлагают вместо хлороформа, который является высокотоксичным веществом, использовать 1-бром-З-хлоропропан, не уступающий по своим свойствам хлороформу, но значительно менее опасный [253].
Метод сорбции на силикагеле, впервые предложенный еще в 1990 году [49], состоит в связывании сорбентом (Si02) нуклеиновой кислоты в лизате пробы, серии промывок сорбента и элюции ДНК и РНК. Для лизиса в этом случае используется хаотропныи агент гуанидинтиоцианат (GuSCN) в смеси с ЭДТА и Triton Х-100. Это удобный и быстрый метод выделения нуклеиновых кислот, однако, включает довольно много операций, что создает риск контаминации. В процессе центрифугирования происходит осаждение сорбента в виде хорошо заметного (в отличие от спиртового осаждения ДНК и РНК) осадка. Принцип сорбции-элюции, но на фильтре, применяется в колонках для выделения ДНК и РНК, предлагаемых различными коммерческими фирмами. Метод нуклеосорбции был успешно использован А.Н. Кули-ченко для выделения ДНК возбудителей особо опасных инфекций: чумы, бруцеллеза и сибирской язвы [15].
Отечественными авторами был разработан эффективный способ обнаружения ДНК из образцов почвы и биологического материала на примере Coccidioides spp., основанный на гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформной депротеинизации с последующей очисткой ДНК методом нуклеосорбции [24].
Для лизиса клеток применяют щелочь (0,02-0,1 М NaOH) или различные детергенты. При работе с ионными детергентами следует учитывать их ингибирующее действие на ферменты. Так додецилсульфат натрия (SDS) ин-гибирует Год-полимеразу в концентрации свыше 0,01 %, саркозил - 0,02 %, дезоксихолат натрия - 0,06 % (вес/объем) [273]. И наоборот, хлорид калия в концентрации 10-50 мМ и/или сульфат аммония в концентрации 10-20 мМ добавляют для улучшения отжига праймера. Бычий сывороточный альбумин или желатин в концентрации 0,01 - 0,1 % (вес/объем) а также неионные детергенты Triton XI00, Nonidet NP40 и Tween 20 в концентрации 0,05 - 0,1 % (объем/объем) являются стабилизаторами фермента. Диметилсульфоксид в концентрации 1 - 10 % (объем/объем), 5 %-ный (объем/объем) ацетамид и глицерин в концентрации 5 - 20 % (объем/объем) могут в некоторых случаях улучшать специфичность ПЦР. Глицерин является ингибитором ферментативных реакций, однако в низких концентрациях он способствует повышению термостабильности Гад-ДНК-полимеразы. Формамид в концентрации 1 - 10 % (объем/объем) полезен при амплификации G/C богатых матриц [148].
В настоящее время с целью быстрой и эффективной экстракции ДНК широко используются различные коммерческие наборы, которые основаны преимущественно на ионнообменной хроматографии и сорбции. При помощи приемов хроматографии эффективно очищали образцы почвы и сточных вод от ингибирующих ПЦР веществ и детектировали штаммы кишечной палочки [257], для детекции ротавирусов в образцах кала с целью очистки ДНК применяли волокнисто-целлюлозный порошок CF11 [277], для этого же использовали коммерческую колонку (Molecular Biosistem Jnc), на которой очищали образцы кала, предварительно лизированные в буфере с протеина-зой К [175]. Такие методы применяют для очистки нуклеиновых кислот из сравнительно чистых источников, таких как ткани млекопитающих, бульонные и чистые культуры. Их нечасто используют в тех случаях, когда приходится выделять ДНК из более сложных образцов, таких как пищевые продукты, почва, вода из естественных водоемов.
Таким образом, представленные литературные данные показывают, что для каждого вида микроорганизма и в зависимости от характера анализируемых проб необходим подбор способов подготовки, очистки и выделения ДНК для проведения исследований методом ПЦР.
Выбор и характеристика праймеров и гибридизационных олигонук-леотидных зондов для обнаружения Burkholderia pseudomallei и Burk-holderia mallei
На первом этапе исследований нами определены оптимальные концентрации ингредиентов и режимы реакции амплификации. Для отработки оптимальных условий проведения ПЦР использовали ДНК, выделенную из проб, содержащих В. pseudomallei С141 в концентрации 1x10 -1x10 м.к./мл.
Реакцию амплификации проводили в двух форматах: с детекцией результатов ПНР «по конечной точке» и в режиме реального времени.
В качестве реакционного буфера использовали ПЦР-буфер и Taq-F-полимеразу производства ФГУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзо-ра, г. Москва. Для всех праймеров содержание MgCb составляло 3 мМ. Конечная концентрация дезоксинуклеозидтрифосфатов составляла 0,2 мМ каждого дНТФ.
Отжиг праймеров является важным параметром, определяющим специфичность и чувствительность реакции. Математический расчет температуры отжига праймеров позволяет получить лишь приблизительные показатели. Более точное значение этого параметра определяют опытным путем. Для отжига праймеров было испытано несколько температурных режимов в интервале 60 - 68 С.
Ранее при разработке стандартного варианта ПЦР [11] установлено, что для праймеров и зондов, направленных на обнаружение гена 23SрРНК, при проведении амплификации на приборе «Терцик» в качестве оптимальной яв о лялась температура отжига олигонуклеотидов, равная 67 С. Однако реакция амплификации на приборе «Rotor-Gene 6000» при данной температуре при 62 водила к увеличению числового значения порогового цикла (Ct). Уменьшение этой величины наблюдалось при снижении температуры отжига до 64 С. Известно, что при снижении температуры отжига велика вероятность неспецифической гибридизации праймеров и получения ложноположительных результатов. При увеличении температуры свыше оптимальной наблюдается снижение концентрации (выхода) амплифицируемого продукта и, регистрируемое на графике приборами для ПЦР в режиме реального времени, увеличение значения порогового цикла. Поэтому, для повышения специфичности реакции амплификации температура отжига на первых 10 циклах, проходящих без детекции флуоресценции на амплификаторе «Rotor-Gene 6000», бы о ла увеличена до 67 С. В последующих 35 циклах температура реакции амплификации составляла 64 С. Аналогичный алгоритм подбора температуры отжига был использован и для обнаружения гена fliC патогенных буркхоль-дерий: на первых 10 циклах температура отжига составляла 65 С, в после о дующих 35 циклах - 60 С. Для детекции гена orflS температура отжига о праймеров и зондов составила 64 С для обоих приборов (табл. 6-8). Оптимальное количество циклов амплификации было установлено эмпирически и составило 45 циклов для обоих приборов. На амплификаторе «Rotor-Gene 6000», как отмечено выше, первые 10 циклов проводили без детекции флуоресценции. Значение пороговой линии - 0,05. Программа амплификации была также оптимизирована при проведении ПЦР в режиме реального времени на приборе «SmartCycler». Программы термоциклирования реакционных смесей приведены в табл. 6, 7 и 8. 64 При проведении реакции амплификации на приборе «Терцик» использовали «точный» режим регулирования температуры. При постановке ПЦР как «по конечной точке», так и в режиме реального времени концентрация праимеров составляла 12 пМ. Данная концентрация праимеров была определена как оптимальная при разработке стандартного варианта ПЦР в предыдущих исследованиях [1, 11]. С целью определения оптимальной концентрации олигонуклеотидных зондов их содержание в ПЦР-смеси варьировали от 3 пМ до 9 пМ. Отрицательным контролем служила проба дистиллированной воды, прошедшая пробоподготовку. При проведении детекции на приборе «Gene» дополнительно использовали нормировочные (фоновые) пробирки для контроля фоновой флуоресценции, в которую вносили пробу отрицательного контроля и все компоненты реакции амплификации за исключением Taq-полимеразы. При содержании зонда 3 пМ уровень флуоресценции при анализе низ-ких концентраций микробных клеток (1x10 м.к./мл) на детекторе «Gene» приближался к пороговому и был значительно ниже, чем при более высоких концентрациях зонда (6 пМ и 9 пМ). При детекции «по конечной точке» числовые значения показателей уровня флуоресценции данный прибор определяет относительно фоновой флуоресценции. Однако, как видно из таблицы 9, при концентрации зонда 9 пМ уровень флуоресценции незначительно превышал ее значение с концентрацией зонда 6 пМ. Поэтому в целях исключения избыточного расходования реактивов (флуоресцентных зондов) предложена оптимальная концентрация зонда в реакционной смеси 6 пМ.
Определение эффективности различных способов очистки и выделения ДЬЖ возбудителей сапа и мелиоидоза для их обнаружения методом ПЦР в пробах почвы и пищевых продуктов
При исследовании проб почвы не все используемые методы выделения нуклеиновых кислот оказались достаточно эффективными. Так, при контаминации 17 образцов почвы клетками В. pseudomallei в концентрации 1 х 104 м.к./мл и последующем использовании метода гуанидинтиоцианат-фенольной экстракции с нуклеосорбцией [24] ДНК обнаруживали во всех исследуемых пробах. Выделение ДНК возбудителя мелиоидоза коммерческим набором «ДНК-экспресс» в 30 % случаев приводило к получению недостоверного результата. Метод R. Boom [49] не обеспечивал достаточной очистки ДНК от примесей, ингибирующих ПЦР, что приводило в 100 % случаев к отрицательным результатам.
При анализе проб почвы, контаминированных клетками В. pseudomallei в концентрации 1 х 10 м.к./мл, микроб обнаруживался в 71 % случаев (12 проб) при выделении ДНК методом гуанидинтиоцианат-фенольной экстракции с нуклеосорбцией и в 47 % случаев (8 проб) - набором «ДНК-экспресс». Однако, в 35 % случаев при использовании набора «ДНК-экспресс» были получены недостоверные результаты.
Технология «ДНК-экспресс» основана на термокоагуляционном кондиционировании ДНК, преимуществом этого метода является быстрота и простота в выполнении. Методика его состоит в том, что в пробирку с реактивом «ДНК-экспресс» помещают анализируемый материал, перемешивают на вортексе и инкубируют при 98 С в течение 10 мин, после чего центрифугируют при 12000 об/мин при комнатной температуре в течение 15 сек. Су-пернатант используют в качестве исследуемого образца ДНК для постановки амплификации. Однако, как следует из инструкции фирмы-производителя, в некоторых случаях возможно получение недостоверного результата, который нельзя однозначно интерпретировать и который требует повторного проведения процедуры выделения ДНК данным коммерческим набором из анализируемых проб. Так, при повторной обработке проб почвы с недостоверным результатом реактивом «ДНК- экспресс» нами в 2-х случаях был получен положительный результат. Таким образом, для выделениия ДІЖ возбудителей сапа и мелиоидоза из проб воды и жидких пищевых продуктов (сок, молоко) может быть рекомендован метод, предложенный R. Boom [49], так как он является простым, быстрым, доступным и экономически более выгодным и позволяет выявлять патогенных буркхольдерий в концентрации 1x10 м.к./мл.
Для эффективной очистки ДНК В. mallei и В. pseudomallei в пробах почвы более эффективным оказался метод гуанидин-фенол-хлороформной депротеинизации с последующей очисткой нуклеосорбцией на SiC 2, который, несмотря на многоэтапность и трудоемкость, обеспечивал получение очищенной ДНК. При его использовании чувствительность реакции амплификации составила 1 х 104 м.к./мл.
Тест-системы были апробированы в условиях передвижной автономной ПЦР-лаборатории. Укладка лаборатории состояла из оборудования, упакованного в пластмассовый ударопрочный герметичный кейс серии «Корсар»: термостата твердотельного, центрифуги настольной, программируемого термоциклера «Терцик», миницентрифуги-вортекса, ПЦР-детектора «Джин», портативного компьютера, штативов, набора пипеток полуавтоматических с расходными наконечниками, блока розеток (ЗАО «НПФ ДНК-технология»; г. Москва). В состав комплекта дополнительно входил источник питания (МР-940, MobilEn), обеспечивающий автономную работу оборудования, термоконтейнер для хранения препаратов, палатка, комплект разборной мебели, дезсредства.
Из исследуемых штаммов В. mallei и В. pseudomallei, выросших на плотных питательных средах, готовили бактериальные взвеси клеток в биди-стиллированной воде, вносили в пробы воды из открытых водоемов до конечной концентрации 1x10,1x10 иІхЮ м.к./мл, и инактивировали мер-тиолятом натрия. Инактивированные пробы использовали при работе в автономной ПНР лаборатории. Выделение ДНК проводили с использованием набора ДНК-сорб В («ЦНИИ Эпидемиологии», Москва). Амплификацию ДНК проводили с соблюдением как общепринятых требований к проведению ГЩР, так и требований режима работы с ООИ, предусмотренных СП 1.3.1285 — 03 «Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)». Проведенные исследования показали возможность идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза в условиях автономной мобильной ПЦР-лаборатории. Технология гибридизационно-флуоресцентной детекции обеспечивала высокую эффективность выявления патогенов в контаминиро-ванных возбудителями ООИ пробах воды открытых водоемов, сходную с полученной в условиях стационарной лаборатории. Определены перспективы модернизации автономной лаборатории, в первую очередь, касающиеся первичной пробоподготовки.
Применение гибридизационно-флуоресцентных систем детекции возбудителей сапа и мелиоидоза снижало риск контаминации, сокращало продолжительность и трудоемкость проведения исследований, что особенно важно в полевых условиях. Программное обеспечение позволяло быстро оценивать и документировать результаты анализов. В зависимости от комплектации лаборатории диагностическими тест-системами возможна идентификация чистых культур микроорганизмов, а также в пробах продуктов питания, воды и почвы, инфицированных патогенными буркхольдериями.
