Введение к работе
Актуальность проблемы
Сибирская язва в настоящее время продолжает оставаться проблемой для здравоохранения и ветеринарии. Даже в высокоразвитых странах случаются разлитые эпизоотии этой инфекции Примером может служить небывалая по масштабам эпизоотия сибирской язвы сельскохозяйственных и диких травоядных животных на сопредельных территориях США и Канады летом и осенью 2006 года, в ходе которой заболел один человек (Nishi J S. et al, 2007) Вспышки заболеваемости людей связаны с эпизоотиями и носят спорадический характер Тем не менее, они всегда сопряжены с проведением большого объема диагностических, терапевтических, противоэпидемических, профилактических мероприятий Проблема сибирской язвы вряд ли будет окончательно решена в связи с существованием стационарно-неблагополучных пунктов, сопряженных с почвенными очагами инфекции, сохраняющимися неопределенно долго Только на территории Российской Федерации таких пунктов зарегистрировано более 35 тысяч (Черкасский Б.Л, 1969, Онищенко Г.Г. с соавт., 1999, Черкасский Б Л, 2002) Чрезвычайная устойчивость спор Bacillus anthracis^ выживающих во внешней среде десятилетиями без утраты вирулентности, обеспечивает потенциал новых эпизоотии, возможность распространения возбудителя за пределы эпизоотического очага с инфицированными продуктами животноводства и заболевания людей Возросшая в современных условиях мобильность населения и расширяющиеся торгово-экономические связи определяют повышенный риск завоза возбудителя из неблагополучных областей с импортируемыми продуктами
В последние годы заявил о себе новый аспект проблемы — использование возбудителя сибирской язвы в качестве средства биологического терроризма (Черкасский Б.Л., 2004, Frischknecht F et al, 2003) Вдыхание спор сибиреязвенного микроба в таких случаях, как и при военном применении, ведет к развитию у жертв ингаляционной формы инфекции, отличающейся тяжелым течением и частыми фатальными исходами
Весьма важным вопросом, который в числе прочих необходимо решать всякий раз при возникновении вспышек сибирской язвы как природного характера, так и вызванных преднамеренным использованием спор В anthracis в качестве поражающего агента, является вопрос о происхождении и путях распространения возбудителя Неоценимым для его практического решения становится подход, основанный на генетическом типировании возбудителя В частности, при расследовании вспышки сибирской язвы вследствие террористического акта в США в 2001 году были использованы разработанные там же методы многолокусного анализа областей генома с вариабельным числом тандемных повторов (MLVA) (Keim Р et al, 2000) и секвенирования гена протективного антигена (ПА) (Price L et al, 1999; HofBnaster A et al, 2002) Эти методы позволили проследить связи случаев инфекции между собой и местом заражения, а также отличить культуры, не относящиеся к этой вспышке Однако выявить генетическую вариабельность штаммов, выделен-
ных в ходе одной вспышки, а также у вариантов одного и того же штамма дал возможность только полный сиквенс геномов (Read Т et al, 2002)
В связи с этим особую важность приобретает не только совершенствование методов и средств диагностики, профилактики и лечения, но и разработка точных и эффективных методов генетического типирования возбудителя для определения источника происхождения штаммов Banthracis, вызвавших вспышку сибирской язвы или использованных при террористическом акте В настоящее время наиболее распространен метод молекулярного типирования штаммов В anthracis, основанный на анализе нескольких хромосомных и плазмидных локусов с вариабельным числом тандемных повторов (VNTR- локусов), назьюаемый MLVA (Keim Р et al, 2000, Le Fleche P et al., 2001) MLVA в сочетании с филогенетическим анализом обнаружил закономерное географическое распределение генотипов штаммов сибиреяшенно-го микроба и различия в степени генетического родства между ними (Еременко ЕЙ и др , 2000, KeimР et al, 2000, Fasanella A et al, 2001, Le Fleche P et al, 2001, Wang В et al, 2001, Malio A et al., 2006) Необходимо отметить, что MLVA в оригинальном варианте и тем более секвенационное типи-рование требует дорогостоящего оборудования и реактивов, которыми в настоящее время в Российской Федерации располагает очень ограниченный круг ведущих научно-исследовательских учреждений У нас в стране предложена более доступная модификация MLVA, с использованием которой оценена генетическая вариабельность штаммов Banthracis, выделенных в СНГ (Еременко ЕЙ и др , 2000, Цыганкова О И и др , 2003). Кроме того, в качестве дополнительных генетических маркеров при определении степени генетического родства штаммов используют предложенное L Рпсе et al (1999) определение генотипа гена ПА в соответствии с полиморфизмом единичных нуклеотидов (SNP) Несмотря на высокую разрешающую способность данных систем генотипирования, они не способны различать штаммы, произошедшие из одного источника и имеющие одинаковый MLVA- и ПА-генотипы Метод анализа полиморфизма длины амплификационно-рестрикционных фрагментов (PCR-RFLP- анализ) гена протективного антигена возбудителя, который мог бы стать доступной альтернативой секвена-ционному типированию этого гена Целесообразным может быть дополнение существующих схем генетического анализа штаммов В anthracis маркерами единичных нуклеотидных повторов (SNR), которые проявляют высокую степень генетического полиморфизма (Цыганкова Е А , Еременко Е И, 2005, Musculo М et al, 2005, Stratilo Ch et al, 2006), новыми VNTR-маркерами, а также замена определения SNP методом сиквенса на PCR-RFLP-анализ гена ПА Решение этих задач позволило бы предложить приемлемый для нынешнего уровня оснащенности большинства лабораторий соответствующего профиля у нас в стране метод генетического типирования сибиреязвенного микроба
Таким образом, исследования, направленные на поиск практически приемлемого методического подхода к генетическому типированию сибиреязвенного микроба, представляются актуальными
Цель исследования - разработка методического подхода к генетическому типированию сибиреязвенного микроба, основанного на сочетании MLVA, SNR- и PCR- RFLP - анализа Задачи исследования: 1 Провести поиск потенциально вариабельных тандемных и единичных нуклеотидных повторов в геноме B.anthracis Сконструировать прай-меры к обнаруженным областям с тандем ными и единичными нуклео-тидными повторами и оптимизировать параметры амплификации с ними в ПЦР для VNTR- и SNR-анаяиза 2. Изучить вариабельность выявленных областей генома штаммов возбудителя сибирской язвы
Подобрать эндонуклеазы, имеющие сайты узнавания и рестрикции в пределах гена протективного антигена сибиреязвенного микроба Подобрать праймеры для амплификации областей гена протективного антигена и последующего рестрикционного анализа
Разработать метод анализа полиморфизма длины амплификационно-рестрикционных фрагментов (PCR-RFLP- анализ) гена протективного антигена
Изучить вариабельность последовательностей гена ПА у штаммов сибиреязвенного микроба и морфологических колониальных вариантов их популяций разработанным методом
Разработать методический подход к генетическому типированию В anthracis, основанный на сочетанном применении MLVA, SNR- и RFLP-PCR- анализа гена ПА
Оценить возможности применения использованных методов генетического типирования для эпидемиологического анализа штаммов возбудителя сибирской язвы разного географического происхождения, а также выделенных в ходе отдельных вспышек сибиреязвенной инфекции
Научная новизна. Для генетического типирования сибиреязвенного
микроба сконструированы оригинальные праймеры PX3№X4i,
39VNTRchf/39VNTRchr и 196chr/196chf - к вариабельным плазмидным и хромосомным областям генома; l6Achf716Achr, polyACpolyAr и РХіТРХг - к SNR-областям генома, PA 953f/PA 953г и PA800f/PA800r - к гену ПА
Подобраны оптимальные набор эндонуклеаз и условия реакций рестрикции, проведения обычной и мультиплексной ПЦР для VNTR-, SNR- и RFLP-PCR-анализа
Впервые обнаружена генетическая вариабельность плазмидной VNTR-области РХЗ-4, ассоциированная с фенотипической вариабельностью штаммов, отличающихся по комплексу биохимических и патогенных свойств
Впервые обнаружена генетическая вариабельность хромосомного ло-куса 39VNTRch, расположенного в пределах гена, кодирующего синтез кол-лагенового адгезивного белка В anthracis
Впервые разработан метод PCR-RFLP анализа гена ПА сибиреязвенно го микроба Впервые выявлена высокая вариабельность полиадениновых об-
ластей генома и PCR-RELP типов гена ПА штаммов, выделенных в ходе одной вспышки сибирской язвы, а также вариантов штаммов, имеющих идентичный MLVA-генотип
Впервые идентифицировано шесть новых, а также пять известных, но не встречавшихся ранее MLVA-генотипов среди штаммов, выделенных на территории СНГ
Разработан методический подход к генетическому типированию сибиреязвенного микроба, основанный на сочетанном анализе маркеров MLVA, PCR-RELP и SNR в нашей модификации, позволяющий дифференцировать штаммы разного географического происхождения, а также группы изолятов и отдельные штаммы, выделенных во время вспышек сибиреязвенной инфекции
Практическая значимость. Разработанные методы генетического ти-пирования используются в лаборатории Ставропольского НШТЧИ для анализа музейных, вновь поступивших для идентификации и выделенных из исследуемого материала штаммов возбудителя сибирской язвы Полученные в результате исследования новые генетические характеристики шгаммов дополнили имеющиеся в компьютерной базе данных «Штаммы Bacillus ап-thracis»
По материалам диссертационной работы составлены методические рекомендации
«Методические рекомендации по комплексной оценке фенотипиче-ских признаков (гемолитической, протеолитической, лецитиназной и пиг-ментсинтезирующий активностей, способности штаммами/ изолятами продуцировать капсулу и токсин т vitro) культур Bacillus anthracts», рекомендованные на заседании секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН академиком И А Бакуловым 28 мая 2004 г., протокол секции №2 и утвержденные директором СтавНИПЧИ (2004 г)
«Молекулярное типирование штаммов сибиреязвенного микроба на Основе вариабельности нуклеотидных последовательностей гена протектив-ного антигена», утвержденные директором СтавНИПЧИ (2005 г)
«Методические рекомендации по межвидовой и внутривидовой дифференциации группы бацилл, включающих В anthracis», утвержденные директором СтавНИПЧИ (2005 г.)
«Методические рекомендации по филогенетическому анализу штаммов микроорганизмов» утвержденные" директором СтавНИПЧИ (2005 г.)
Учебно-методическое пособие «Теоретические основы и практические аспекты полимеразной цепной реакции», утверждено директором СтавНИПЧИ (2005 г)
Основные положения, выносимые на защиту. 1. Локус с вариабельным числом тандемных повторов РХ 3-4 в межгенной области плазмиды рХ02 имеет два аллельных варианта, присущих штаммам сибиреязвенного микроба с разной фенотипической экспрессией комплекса ассоциированных с вирулентностью признаков
2 Анализ трех областей генома, содержащих единичные нуклеотидные
повторы, позволяет выявить высокую степень индивидуальной генети
ческой вариабельности у штаммов В anthracis
3 PCR-RFLP-анализ гена ПА, основанный на амплификации двух фраг
ментов гена pag с последующей рестрикцией тремя эндонуклеазами,
обнаруживает семь PCR-RFLP типов гена ПА среди штаммов В an
thracis и их вариантов разного происхождения
4 Методический подход к генотипированию штаммов В anthracis, осно
ванный на сочетанием анализе маркеров MLVA, PCR-RFLP и SNR в
нашей модификации дает возможность одновременно дискриминиро
вать штаммы, происходящие из разных вспышек сибирской язвы, объ
единяя штаммы из одной вспышки, и различать штаммы, выделенные в
течение отдельной вспышки
Материалы диссертации вошли в заключительный отчет по НИР Став-НИПЧИ «Изучение фенотипической и генетической вариабельности штаммов сибиреязвенного микроба» № ГР 02 200 109091
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на научно-практической конференции, посвященный 75-летию НИИ Микробиологии МО РФ (Киров, 2003), 5-ой Всероссийской научно-практической конференции (г Москва, 2004), VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников Содружества независимых государств- проблемы биологической безопасности и противодействия терроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005), научно-практической конференции «Фундаментальные исследования в биологии и медицине» (Ставрополь 2006), VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств» (Оболенск, 2006), научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России» (Ставрополь, 2007)
Публикации
По теме диссертации опубликовано 22 научные работы, из них 3 - в рецензируемых изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, депонировано — 1 работа, в сборниках научных трудов, материалах научных и научно-практических конференций - 18 работ
Структура и объем диссертации
