Введение к работе
Актуальность проблемы
Bacillus anthracis — возбудитель острою инфекционного заболевания животных и людей — на протяжении длительного периода вызывает у исследователей неизменный интерес, обострившийся после недавнего прецедента использования спор данного микроорганизма в качестве агента биотерроризма (Evans R G et al, 2002, Hoffinaster A R et al, 2002, Jernigan D В et al, 2002, Riedel S 2004) Серия террористических актов в США в 2001 г наглядно продемонстрировала неготовность хорошо оснащенной и регулярно финансируемой лабораторной системы этой страны к массовому исследованию проб от людей и из внешней среды на наличие возбудителя сибирской язвы Результатом этих актов биотерроризма явилась гибель людей, паника и гражданский хаос среди жителей страны, что, по мнению Г Г Онищенко (2003), является еще одним поражающим воздействием По критериям оценки биологических агентов, представляющих потенциальную угрозу для населения, возбудитель сибирской язвы занимает второе место Легкость культивирования В anthracis и необычайная устойчивость его спор к неблагоприятным факторам внешней среды и дезинфицирующим средствам делают возбудителя сибирской язвы популярным агентом биотерроризма
Помимо возможности применения возбудителя сибирской язвы в качестве агента биотерроризма, существует постоянная угроза проявления активности многочисленных стойких почвенных очагов данной инфекции Примером могут служить небывалые по масштабам эпизоотии сибирской язвы летом и осенью 2006 г в Северной Америке За период с июля по сентябрь в трех провинциях Канады и четырех штатах США от сибирской язвы пало в общей сложности более 1000 голов домашнего скота и диких животных В Канаде эпизоотии отмечались в 153 хозяйствах, при этом заболело два человека (Nishi J S et al, 2007)
На территории России за период с 1900 по 2003 год зарегистрировано более 35 тысяч стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов и более 70 тысяч вспышек инфекции В каждом из таких пунктов имеется несколько почвенных очагов, причем по мере их рецидивирования и новых случаев падежа скота, как правило, возникают новые Эпидемиочогическая ситуация по сибирской язве в РФ остается напряженной (Онищенко Г Г, 2003)
Общность филогенетического происхождения представителей группы Bacillus cereus, почти полная гомология генома и схожесть некоторых фенотипических признаков, проявление которых подвержено внутривидовой вариабельности, - все это в некоторых случаях делает идентификацию В anthracis затруднительной даже при использовании самого современного арсенала бактериологических, биохимических и молекулярно-генетических методов исследования (Papaparaskevas J et al, 2004, Okmaka R et al, 2006)
Оценка надежности различных тестов идентификации сибиреязвенної о микроба требует изучения вариабельности фенотипических признаков, лежащих в их основе не только на уровне штаммов, но и внутри их популяций Это диктует необходимость разработки более чувствительных методов определения различий в фенотипических свойствах отдельных составляющих популяции
Важным противоэпидемическим звеном в борьбе с сибирской язвой является иммунопрофилактика, в частности вакцинация (Бакулов И А с соавт, 2001, Пименов ЕВ с соавт, 2002, Wins ЕВ et al, 1994, Tumbull Р et al, 2001) Штаммы, используемые в качестве вакцинных, должны обладать целым комплексом свойств авирулентностью, иммуногеннО'стью, продуктивностью спорообразования, стабильностью спор при хранении Существует немало свидетельств неоднородности популяций вакцинных штаммов по тем или иным свойствам в отдельных сериях вакцинных препаратов (Кожухов В В с соавт, 1997, Сероглазое В В , 1998) Отбор вариантов вакцинных штаммов В anthraas с наиболее оптимальным комплексом свойств на основе популяционного анализа широкого спектра фенотипических признаков может не только обеспечить наиболее эффективную защиту иммунизированных лиц от возможности заболевания сибирской язвой, но и снизить экономические затраты на производство вакцины
Сложность генетической идентификации В anthracis обусловлена значительной гомологией геномов представителей группы Bacillus cereus и наличием четырех различных вариантов плазмидного состава штаммов возбудителя сибирской язвы Объективная и достоверная молекулярно-генетическая идентификация сибиреязвенного микроба и его дифференциация от других представителей группы В cereus может осуществляться лишь при использовании праймеров как к плазмид-ным, так и к специфическим хромосомным локусам Отсутствие мультиплексной амплификационной тест системы, способной осуществлять детекцию штаммов сибиреязвенного микроба с любым плазмидным составом и надежно дифференцировать их от близкородственных сапрофитов, снижает роль быстрого и высокочувствительного метода ГЩР в исследовании проб материала от больных людей, животных и из объектов внешней среды на наличие В anthracis
Периодические проявления активности местных почвенных очагов и возникновение заболеваний животных или людей вследствие заноса инфекции с других территорий требуют разных подходов при проведении противоэпидемических мероприятий Существенную помощь в решении этих вопросов может оказать применение методов молекулярно-генетического типирования выделенных во время вспышки штаммов возбудителя сибирской язвы Получившая мировое признание схема молекулярно-генетического типирования штаммов В anthracis на основе анализа характеристик полиморфных локусов с вариабельным числом тандемных повторов (Keim Р et al, 2000), требует наличия дорогостоящей аппаратуры, мало доступной большинству отечественных лабораторий, и нуждается в модификации
Нет окончательной ясности и в вопросе о стабильности VNTR-маркеров в условиях воздействия различных селекционирующих факторов Отсутствие данных о генотипах штаммов возбудителя сибирской язвы, выделенных на обширной территории России, в работах, посвященных глобальному распределению MLVA-генотипов В anthracis (Van Ert MN et al, 2007) делает работу по их іенотипиро-ванию актуальной, а ее результаты, несомненно, представят интерес, как для отечественных, так и для зарубежных ученых
Таким образом, актуальность изучения различных аспектов фенотипической и генетической вариабельности обусловлена тесной связью этих вопросов с проблемами индикации и идентификации В anthracis, оценкой вирулентности и им-муногенности, внутривидового типирования штаммов микроба с целью изучения филогенетических взаимоотношений штаммов различного происхождения и вариантов внутри групп, образованных производными исходного штамма
Целью исследования явилось изучение фенотипическои и генетической вариабельности штаммов В anthracis и разработка методических подходов для совершенствования диагностики сибиреязвенной инфекции и зпидемиолої ического анализа заболеваемости
Учитывая сказанное выше, нами были поставлены следующие задачи-
J Разработать метод оценки состава клеточных популяций штаммов сибиреязвенного микроба по признаку гемолитической активности, о собрать варианты возбудителя с разной гемолитической активностью и изучить корреляцию между проявлением этого признака, морфологией колоний, лецитиназной активностью и устойчивостью к сибиреязвенным бактериофагам
-
Определить степень вариабельности и оценить влияние различий культураль-но-морфологических и биохимических свойств клеточной популяции вакцинных штаммов на их иммуногенность и продуктивные свойства
-
Оценить вклад различных экзопродуктов в проявление гемолитической активности В anthracis
-
Разработать метод оценки популяционного состава штаммов сибиреязвенного микроба по фагорезистентности и выделения фагорезистентных кульгур, изучить устойчивость клеточной популяции штаммов к бактериофагам, селекционировать фагорезистентные варианты В antPiracis и определить спектр их фагорезистентности
-
Провести отбор штаммов В anthracis и их вариантов, по признаку чувствительности к сибиреязвенным бактериофагам, оценить их продуктивность и селективные свойства при выращивании на них сибиреязвенных бактериофагов
-
Изучить фенотипическую вариабельность природных штаммов сибиреязвенного микроба по основным тестам идентификации и дополнительным признакам и сконструировать изогенную систему штаммов для экспериментального изучения генетической детерминации этих признаков
-
Разработать мультиплексную ПЦР тест-систему для идентификации возбудителя сибирской язвы с праймерами к специфическим плазмидньш и хромосомному локусам и изучить диагностическую ценность разработанной тест-системы при исследовании клинического материала
-
Разработать модификацию метода MLVA В anthracis, позволяющую анализировать ампликоны методом электрофореза в агарозном геле, оценить стабильность MLVA-i енотипов, возможность и закономерность изменения их внутри популяций штаммов
-
Провести MLVA штаммов из различных регионов СНГ и России
-
Изучигь возможность использования молекулярно-генетического типирова-ния штаммов В anthracis методом MLVA в сочетании с филогенетическим анализом для эпидемиологического анализа вспышек заболевания сибирской язвой среди людей и животных
Научная новизна результатов исследований
Разработаны новые эффективные методы оценки гемолитической активности В anthracis и резистентности к бактериофагам, позволяющие не только выявлять наличие этих свойств у штаммов в целом, но и количественно оценить клеточную популяцию по различиям в этих признаках Данные методы, наряду с модифицированным нами вариантом MLVA, пополнили арсенал доступных по техническому оснащению методов изучения фенотипическои и генетической вариа-
бельности сибиреязвенного микроба и позволили выявить ряд закономерностей в изменении этих свойств, определить новые подходы и экспериментально обосновать способ отбора вариантов вакцинных штаммов, основанный на первичном отборе из популяции штамма токсигенных колоний с последующим отбором из них вариантов определенного культурально-морфологического типа, обладающих, помимо более высокой иммуногенности, высокопродуктивным спорообразованием и повышенной резистентностью спор к условиям лиофилизации и повышенным температурам, а также определить оптимальные штаммы для размножения сибиреязвенных бактериофагов и индикаторные штаммы В anthracis для определения специфической активности их препаратов
Впервые проведена комплексная оценка вклада лецитиназы, хлестерин-зависимого антролизина О и протеаз сибиреязвенного микроба в их гемолитическую активность на примере производных вариантов одного штамма В anthracis с различным сочетанием активности указанных экзопродуктов и показана зависимость проявления гемолитической активности от условий и методов ее определения
Разработана амплификационная тест-система с использованием сконструированных новых праймеров к гену Sap с хромосомной локализацией, что принципиально решило проблему детекции штаммов сибиреязвенного микроба с любым плазмидным составом, надежной дифференциации их от близкородственных са-профитов и одновременного определения их генетического потенциала патогенно-сти
Впервые на основе ретроспективного анализа MLVA-генотипов штаммов В anthracis, выделенных во время четырех вспышек сибирской язвы в июле-августе ] 998 г на сопредельных территориях ЮФО из различного материала, убедительно доказана эффективность использования методов молекулярно-генетического типи-рования штаммов возбудителя в сочетании с филогенетическим анализом для оценки возможности наличия связей между вспышками данного заболевания на сопредельных территориях
Анализ комплексной характеристики фенотипических свойств, плазмидного состава, наличия в геноме последовательностей целого ряда функционально значимых генов, а также генотипов, определенных на основании характеристик полиморфных локусов генома с вариабельным числом тандемных повторов, выборки штаммов, выделенных из различного материала на территории России, Узбекистана, Туркмении, Азербайджана и Украины, выявил более выраженную фенотипиче-скую вариабельность среди штаммов В anthracis, изолированных из почвы с давним сроком обсеменения, приуроченность отдельных генотипов к определенным регионам, 13 новых MLVA-генотипов и ранее неописанные аллельные размеры ампликонов по некоторым вариабельным локусам
Впервые при сопоставлении широкого спектра фенотипических свойств, данных о наличии большого набора структурных генов различной локализации и результатов филогенетического анализ на основе MLVA-генотипирования по двум схемам на примере пяти групп производных штаммов В anthracis в результате выполненных исследований обнаружена корреляция между характерными MLVA-генотипами и фенотипическими свойствами, определяющими более высокую вирулентность штаммов, а также направленность изменений генотипа при селекции культур с такой вирулентностью в популяции штаммов с умеренной вирулентностью
Приоритетность научных разработок различных разделов исследований подтверждена шестью патентами РФ на изобретения
Теоретическая и практическая значимость работы
Теоретический аспект исследований Обоснован популяционный подход не только к отбору штаммов и их вариантов, наиболее эффективных для использования в качестве вакцинных или для размножения бактериофагов и тестирования их специфической активности, но и к вопросам филогенетического анализа результатов молекулярно-генетического титрования штаммов на основе MLVA Проведение дальнейших исследований в этом направлении поможет оценить надежность генетического маркирования штаммов возбудителя сибирской язвы на протяжении отрезков времени, соизмеримых с длительностью существования почвенных очагов, для оценки их роли в возникновении вспышек сибирской язвы на их территории Определен вклад различных экзопродуктов сибиреязвенного микроба в проявление гемолитической активности и цитотоксического действия Продемонстрирована зависимость иммуногенных свойств вакцинных штаммов от состава клеточной популяции по совокупности признаков, включая морфологию колоний, гемолитическую, протеолитическую активности, токсинообразование in vitro
Практическим итогом исследований является разработка амплификацион-ной мультиплексной тест-системы, применение которой позволяет не только проводить ускоренную молекулярно-генетическую идентификацию культур, подозрительных на принадлежность к В anthracis, независимо от их плазмидного состава й одновременно оценивать их генетический потенциал патогенности, но и выявлять ДНК возбудителя в материале от людей с кожной формой заболевания сибирской язвой, традиционно трудной для микробиологической диагностики Использование результатов ПЦР в таком формате позволяет осуществлять быструю и точную диагностику этого опасного заболевания и индикацию ее возбудителя в пробах из объектов внешней среды, что является решающими условиями своевременной помощи больным и служит основанием для организации необходимого комплекса противоэпидемических и противоэпизоотических мероприятий при вспышках данной инфекции природного характера или возможных актах биотерроризма, позволяет предотвратить гибель людей и сельскохозяйственных животных, уменьшить финансовые затраты на противоэпидемические и лечебные мероприятия Тест-система использовалась при экспериментальной работе в Волгоградском научно-исследовательском противочумном институте Апробация работы тест-системы была проведена на различных пробах от людей, животных и из объектов внешней среды во время вспышки сибирской язвы в октябре 2004 г в Курском районе Ставропольского края и в г Моздоке осенью 2006 г и весной 2007 г, в результате чего была выявлена высокая эффективность ее применения не только для идентификации культур, но и для исследования на наличие ДНК В anthracis непосредственно материала от больных
Применение разработанной модификации молекулярно-генетического метода MLVA-генотипирования штаммов возбудителя сибирской язвы в сочетании с филогенетическим анализом является эффективным и объективным дополнительным методом эпидемиологического анализа для выявления путей распространения этой инфекции на сопредельных территориях в спорных случаях, что было выявлено на основании ретроспективного анализа четырех вспышек 1998 г и позднее подтверждено результатами применения этого методического подхода при анализе
случаев заболевания людей и КРС в г Моздоке и Курском районе Ставропольского края в 2006 и 2007 гг
По совокупности результатов проведенных исследований предложен способ выращивания бактериофага «Гамма А-26», упрощающий получения препарата бактериофага, сокращающий время на его получение и снижающий экономические затраты на его производство благодаря сокращению числа манипуляций и снижению расхода питательных сред при сохранении показателей его активности и специфичности Предложенный способ использовался при производстве экспериментальных серий сибиреязвенного бактериофага «Гамма А-26»
Разработанный методический подход к отбору наиболее перспективных вариантов сибиреязвенных вакцинных штаммов упрощает и систематизирует этот процесс Коррекция популяций вакцинных штаммов В anthracis позволит обеспечить повышение их протективных свойств и снижение экономических затрат на их производство вследствие более продуктивного спорообразования и повышения резистентности спор к условиям лиофилизации и воздействия повышенных температур
Материалы научных разработок легли в основу следующих методических документов методические указания «Основные требования оценки вакцинных штаммов сибиреязвенного микроба для иммунизации людей» МУ 3,3 1 1112-02 (Минздрав России, М 2002 г), методические указания «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами 1-2 групп патогенности» МУ 4 2 -03 (Минздрав России, М 2003 г), методические рекомендации по экспресс-анализу атипичных штаммов возбудителей особо опасных инфекций бактериальной природы (утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол Jfe 12 от 26 декабря 2000 г), методические рекомендации «Изучение популяци-онного состава сибиреязвенных штаммов по фагорезистентности и выделение фа-горезистентных субкультур» (утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 5 от Зімая 2000 г ), методические рекомендации «Использование полимеразной цепной реакции для идентификации Bacillus anthracis» (утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 5 от Зімая 2000 г), методические рекомендации «Использование многолокусной полимеразной цепной реакции для идентификации Bacillus anthracis и оценки их генетического потенциала патогенности» (утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 6 от 27 июня 2002 г ), методические рекомендации по комплексной оценке фенотипических признаков (гемолитической, протеолитической, лецитиназной и пигментсинтезирующей активностей, способности штаммами/изолятами продуцировать капсулу и токсин m vitro) культур Bacillus anthracis (рассмотрены и одобрены на заседании секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН и утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 11 от 3 ноября 2004 г), методические рекомендации по межвидовой и внутривидовой дифференциации групп бацилл, включающих В anthracis (утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 5 от 27 мая 2005 г ), методические рекомендации по филогенетическому анализу штаммов микроорганизмов на основе данных генетического типирования (утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 5 от 27 мая 2005 г), учебно-методическое пособие «Теоретические основы и практические аспекты полимеразной цепной реакции» (утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 5 от 27 мая 2005 г)
Основные положения, выносимые на защиту
-
Расширение круга изучаемых фенотипических признаков и применение новых более чувствительных методов позволяет выявлять вариабельность этих свойств не только у различных штаммов В anthracis, но и внутри их клеточной популяции Вариабельности в различной степени выраженности и с различной частотой подвержены практически все биологические свойства микроба, включая патогенность Отклонения от типичных свойств чаще всего встречаются среди изолятов, выделенных из почвы с большой давностью обсеменения и штаммов с длительным сроком хранения в лабораторных условиях
-
Гемолитическая активность возбудителя сибирской язвы является полидетер-минантным свойством и его проявление зависит от различных сочетаний у конкретных штаммов наличия лецитиназы, холестеринзависимого антролизи-на О и активности протеаз Культуральные фильтраты В anthracis с высокой активностью протеаз или гемолизинов оказывают цитотоксическое действие на лейкоциты периферической крови in vitro
-
Определенные культурально-морфологические варианты различных штаммов имеют сходство в проявлении гемолитической, протеолитической и лецити-назной активности, чувствительности к бактериофагам и эффективности ток-синопродукции на иммунопреципитирующей среде Отбор и изучение свойств таких вариантов позволяют выявить среди них наиболее иммуногенные и продуктивные по спорообразованию и их стабильности варианты вакцинных штаммов, а также культуры для эффективного размножения диагностических сибиреязвенных бактериофагов, обеспечивающих лизис штаммов В anthracis различных культурально-морфологических типов, и высокочувствительные индикаторные штаммы для определения активности фагов
-
Распределение по MLVA-генотипам штаммов и их вариантов с различными фенотипическими признаками, принадлежащих к 5 группам производных, свидетельствует о корреляции направленности изменений MLVA-генотипов с селективным отбором культур по фенотипу, наиболее характерному для вирулентных штаммов
-
Обе существующие схемы MLVA-генотигшрования штаммов В anthracis в сочетании с филогенетическим анализом являются эффективным методом внутривидовой дифференциации штаммов возбудителя сибирской язвы, не имеющих эпидемиологической связи
-
Применение мультиплексной амплификационной тест-системы с набором из трех пар праймеров к специфическим последовательностям плазмидных локу-сов и хромосомного локуса sap позволяет надежно идентифицировать штаммы сибиреязвенного микроба с любым набором плазмид и определять их генетический потенциал патогенности, дифференцировать бесплазмидные штаммы В anthracis от других бацилл группы Bacillus cereus
Апробация материалов диссертация '
Материалы диссертации были представлены на Российской научной конференции «Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций» (Саратов, 1993), на научно-практической конференции «60 лет противочумной службе Кавказа» (Ставрополь, 1995), на юбилейной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ (Киров, 1998), на 3-ей международной конфе-
ренции по сибирской язве (Plymouth, England, 1998), на 2-ой международной конференции по молекулярной биологии бацилл (Taos New Mexico, USA, 1999), на 1-ой Европейской конференции по опасным инфекциям (Winchester, England, 1999), на 1-й Всероссийской научно-практической конференции «Генная диагностика особо опасных инфекций» (Саратов, 2000), на международной научно-практической конференции «Современный эпидемический потенциал природных очагов чумы», посвященной 10-летию суверенитета Республики Казахстан и 50-летия Талдыкорганской противочумной станции (Талдыкорган, 2001), на научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здраво-охренении» в рамках Международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (Мосхва, 2002), на IV Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний», (Москва, 2002), на юбилейной научно-практической конференции «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе Итоги и перспективы», посвященной 50-летию Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (Ставрополь, 2002), на 5-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2004), на Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников содружества независимых государств проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005), на VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств» (Оболенск, 2006), на научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологическо-ю надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на Юге России» (Ставрополь, 2007)
Материалы исследований были доложены на заседании «Общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов» (Ставрополь, 2002), а также используются при проведении практических семинаров по лабораторной диагностике сибирской язвы, и ПЦР-диагностике инфекционных заболеваний, при проведении лекций и практических занятий на курсах первичной специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям и курсах повышения квалификации «Современные бактериологические методы исследования» при Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте
Материалы диссертации обсуждены и одобрены на межлабораторной конференции СтавНИПЧИ 6 февраля 2007 г
Публикации
Основное содержание диссертации отражено в 82 опубликованных работах (в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций - 6 статей, раздел в руководстве «Лабораторная диагностика возбудителей опасных инфекционных заболеваний» - 1, патентов РФ — 6, депонировано - 4 работы, в сборниках научных трудов, материалах научных и научно-практических конференций - 65 статей, 10 из которых опубликованы за рубежом)
Структура и объем диссертации.
