Введение к работе
Актуальность проблемы Холера - антропонозная инфекция, VI] пандемия которой, начавшись в 1961 году, продолжается и до настоящего времени 58 сессия Всемирной ассамблеи здравоохранения (А 58/55 от 23 мая 2005г) приняла "Международные медико-санитарные правила (2005)", в соответствии с которыми эта инфекция стоит первой в списке В как чрезвычайная ситуация международного значения в случаях явной угрозы ее международного распространения Это определяет приоритетность исследований, направленных на совершенствование подходов к осуществлению комплекса противоэпидемических мероприятий по ограничению и ликвидации очага холеры
Анализ эпидемиологической ситуации в мире по холере свидетельствует о сохранении высокого уровня заболеваемости во многих регионах и, прежде всего, в странах Южной Африки и в Индии (WER, 2001-2006)
7-ая пандемия холеры, по мнению отечественных специалистов, в настоящее время характеризуется тем, что эпидемические проявления могут быть обусловлены представителями вида Vcholerae Ol (классический и эльтор биовары) и Vcholerae 0139 серогруппы (Г Г Онищенко и др , 2000, ГГОнищенко, 2001; ВБЗиатдинов, 2003) В период с 1994 по 2004гг зарегистрированы завозные случаи холеры в 19 регионах России (Г Г Онищенко и др , 2005) В 2005 г в Российской Федерации выявлено 34 случая инфицирования людей холерными вибрионами Ol серогруппы (В ЕБезсмертный и др, 2006, ЭАМосквитина и др, 2006) Неполнота и несвоевременность сообщений ВОЗ об эпидемических осложнениях по холере в разных регионах мира, а также отсутствие централизованного анализа антибиотикограмм штаммов, вызвавших эпидемические вспышки, затрудняют проведение адекватных противоэпидемических мер по их локализации
Несмотря на то, что патогенетическая терапия холеры высокоэффективна, ВОЗ относит эту инфекцию (независимо от тяжести заболевания) к тем острым кишечным инфекциям, при которых этиотропная терапия обязательна (WHO/CDC/CSR/EDC/1999) Неблагоприятный прогноз по холере усугубляется тем обстоятельством, что с конца 80-х и начала 90-х годов XX столетия резко увеличивается число выделяемых штаммов возбудителя с маркерами резистентности к широко применяемым для экстренной профилактики и лечения холеры антибактериальным препаратам (тетрациклинам, хлорамфениколу, фуразолидо-ну, триметоприму/ сульфаметоксазолу, аминогликозидам, беталактамам) При этом все чаще регистрируется выделение культур с множественной лекарственной устойчивостью (В П.Савельев и др , 1999, Т В Хоменко, 2004, В V Krishna et al, 2006, L Shi et al, 2006)
Данные отечественных и зарубежных авторов свидетельствуют об экспрессии у холерного вибриона различных r-детерминант антибиотикорезистентности, появлении одних и утрате других в относительно короткий промежуток времени даже в одном регионе Так, во время одной вспышки холеры в Аргентине в 1993гг были выделены штаммы холерного вибриона Ol, имеющие детерминанты устойчивости к 7, 8 и 13 препаратам (A Petrom et al, 2002)
Расширение исследовательских работ, направленных на изучение молеку-лярно-генетических основ антибиотикорезистентности у возбудителя холеры,
приближает нас к пониманию такой вариабельности в проявлении устойчивости к антибактериальным препаратам у холерного вибриона
В 1980-2002гг была доказана плазмидная природа полиантибиотикоустой-чивости у штаммов Vcholerae eltor, выделенных в разных регионах мира R-плазмиды, отнесенные к тс С группе несовместимости, кодировали различные наборы г-детерминант резистентности (М J Finch et al, 1988, E Ferreira et a!, 1992, A Petroni et al, 2002 и др ) Сообщений об обнаружении Л-плазмид других групп несовместимости у холерного вибриона мы не встретили, что вызывает необходимость решения вопроса о возможности их экспрессии в штаммах возбудителя с различными маркерами антибиотикоустойчивости для получения информации о возможности расширения спектра резистентности у холерного вибриона в ходе эпидемического процесса Это касается и появления антибиотикорези-стентных мутантов холерного вибриона, и возможности реверсии возбудителя от чувствительного к резистентному фенотипу О наличии «молчащих» генов резистентности к хлорамфениколу у холерного вибриона сообщают D A Rowe-Magnus et al (2002) Реверсибельный регуляторный трансмиссивный характер устойчивости к тетрациклину, хлорамфениколу и другим антибиотикам описан у некоторых бактерий (G J Barcak, R Р Barchard, 1985, J D Nelson, G H McCracken, 2004) На необходимость разделения штаммов чувствительных и штаммов с генетической потенцией к развитию устойчивости в силу наличия генов антибиоти-корезистентности указывают J S Lewis a J.H Jorgensen (2005)
В последние годы в штаммах холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп обнаружены интегроны, SAT-конъюгативный элемент (от англ sulfamethoxazole, trimethoprim) (Н И Смирнова, 2002, Т СИльина, 2003, Д В Викторов и др , 2006, J.W Beaber et al, 2004, М Ehara et al, 2004, M Iwanaga et al, 2004; L Shi et al, 2006) Несмотря на то, что в настоящее время интенсивно изучаются молекуляр-но-генетические механизмы антибиотикорезистентности у холерных вибрионов, у ряда штаммов, проявлявших устойчивость к антибиотикам, не обнаружено ни ' плазмид, ни интегронов, ни SAT-конъюгативного элемента (L C.Campos et al, 2004, М Ehara et al, 2004), что предполагает существование и других механизмов, обеспечивающих их устойчивость к антибиотикам
Развитие молекулярно-генетических исследований по изучению локализации и функционированию генов антибиотикорезистентности у бактерий и, в частности, у холерного вибриона расширяет наши знания о природе этого явления, но не прибавляет оптимизма Скорее наоборот, пластичность генома возбудителя холеры, вариабельность резистентности уменьшают шансы на предсказуемость спектра и степени резистентности возбудителя, вызвавшего конкретную вспышку инфекции. Тем важнее необходимость постоянного наблюдения за состоянием чувствительности/устойчивости эпидемически значимых штаммов возбудителя холеры к антибактериальным препаратам Последнее осложняется отсутствием критериев интерпретации результатов определения чувствительности для бактерий семейства Vibrionaceae и контрольного (референтного) антибиотикочувствительного тест-штамма соответствующего вида возбудителя (МУК 4 2 1890-04) В то же время применение средств антибиотикопрофилактики и этиотропной терапии должно основываться на строго стандартизированном достоверном определении антибио-тикограммь; возбудителя, что согласуется с программным документом ВОЗ
(WHO/CDC/CSR/DRS/ 2001,2) «Глобальная стратегия ВОЗ по сдерживанию устойчивости к противомикробным препаратам» и Постановлением №11 от 1 04 2005г Главного государственного санитарного врача РФ «Об усилении мероприятий по эпидемиологическому надзору за холерой»
Цель работы анализ природной и экспериментальной вариабельности ан-тибиотикорезистентности у штаммов холерного вибриона Ol и 0139 серогрупп, экспериментальные доказательства возможности расширения спектра устойчивости возбудителя в ходе эпидемического процесса и совершенствование подходов к выбору средств этиотропной терапии холеры Задачи исследования:
Дать сравнительную оценку чувствительности/устойчивости к 23 антибактериальным препаратам разных групп 390 штаммов холерного вибриона Ol и ОІ39 серогрупп, выделенных от людей в разных регионах мира в период с 1927 по 2005гг
Оценить возможность появления устойчивости к тетрациклинам, левомицети-ну, ампициллину, стрептомицшгу, гентамицину у штаммов холерного вибриона биовара eltor при индукции антибиотиками т vitro с оценкой способности г-детерминант резистентности к трансмиссивной передаче другому хозяину
Изучить характер (трансмиссивный, нетрансмиссивный) антибиотикорези-стентности у экспериментальных штаммов и клинических изолятов холерного вибриона eltor и 0139 серогруппы
Провести сравнительное изучение частоты появления рифампицинорезистент-ных (Rif^) мутантов и вариантов, устойчивых к налидиксовой кислоте (Nat) с перекрестной резистентностью к фторхинолонам, у штаммов холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп
Изучить способность к экспрессии /?-плазмид различных групп несовместимости в эпидемически значимых штаммах холерного вибриона eltor.
Оценить соответствие данных антибиотикограмм у коллекции штаммов холерного вибриона Ol и 0139 серогрупп с результатами эффективности антибактериальных препаратов на модели генерализованной инфекции у белых мышей
Разработать подходы к оптимизации методов определения антибиотикограммы холерного вибриона и интерпретации ее результатов для выбора средств этиотропной терапии холеры
Научная новизна и теоретическая значимость В результате проведенных исследований впервые
проведен анализ встречаемости маркеров антибиотикорезистентности и их сочетаний на основе антибиотикограмм (значения МПК 23 препаратов) 390 штаммов холерного вибриона Ol и 0139 серогрупп, выделенных от людей в период с 1927 по 2005гг,
доказан индуцибельный характер устойчивости к тетрациклинам, левомице-тину, ампициллину, стрептомицину, гентамицину, амикацину, канамицину, что является одной из причин вариабельности спектра и степени резистентности у возбудителя холеры,
представлены данные о разнообразии набора трансмиссивных (к стрептомицину, тетрациклинам, левомицетину, триметоприму/ сульфаметоксазолу, ампициллину, аминогликозидам) и нетрансмиссивных (к рифампицину, хинолонам,
фуразолидону) маркеров антибиотикоустойчивости у штаммов холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп,
показано, что трансмиссивная устойчивость к стрептомицину и тримето-приму/ сульфаметоксазолу и нетрансмиссивная - к рифампицину у холерного вибриона характеризуется стабильностью,
представлены данные о высокой частоте (пхЮ"9 -108) появления Rifu Nalr мутантов холерного вибриона Ol и 0139 серогрупп при однократном воздействии препаратов и снижении частоты их выделения более чем на 1-2 порядка в случае добавления в среду культивирования других антибиотиков в субингиби-рующих концентрациях, что свидетельствует о перспективности этиотропной терапии холеры рифампицином и хинолонами в синергидных комбинациях с другими препаратами,
доказана возможность экспрессии Я-плазмид девяти групп несовместимости {тс С, J, S, N, М, FII, Fill, W, К) в антибиотикочувствительном штамме V cholerae eltor Р-5879 и его Rif, Nalг мутантах, а также Л-плазмид тс С, J, S групп несовместимости - в клиническом изоляте с множественной антибиотикорези-стентностью,
на основе сравнительных данных антибиотикограмм т vitro и эффективности антибактериальных препаратов in vivo предложены пограничные значения МПК и диаметров зон подавления роста для чувствительных и устойчивых штаммов холерного вибриона на трех питательных средах (агар Мюллера-Хинтона рН 7,3±0,2, агар Хоттингера рН 7,2+0,1, АГВ рН 7,4+0,2)
Научно-практическая ценность работы.
Сравнительная оценка активности антибактериальных препаратов т vitro и т vivo показала, что наличие антибиотикорезистентности (мутационной, трансмиссивной) к разным антибиотикам у штаммов холерного вибриона эльтор и 0139 приводит к неэффективности беталактамов (ампициллин, цефтриаксон, цефотак-сим и др ) при сохранении к ним чувствительности культур in vitro, что свидетельствует о возможности персистенции измененных форм возбудителя в макроорганизме Снижение эффективности т vivo фторхинолонов наблюдается уже при значениях МПК>0,5 мг/л, фуразолидона - при значениях МПК>16 мг/л, доксициклина - при значениях МПК>4 мг/л и это необходимо учитывать при назначении препаратов для экстренной профилактики и лечения холеры на основании оптимизированных подходов к определению антибиотикограммы возбудителя и ее интерпретации С этой целью нами предлагается использование в качестве контроля анти-биотикочувствительного референс-штамма холерного вибриона не Ol Р-9741 (КМ162) (справка о депонировании в ГК института «Микроб» №70 от 4 03 2003), для которого отработаны допустимые колебания значений МПК и зон подавления роста на среде Мюллера-Хинтона рН 7,3±0,2, агаре Хоттингера рН 7,2±0,1, АГВ рН 7,4±0,2 Разработаны «Методические рекомендации по определению чувствительности/ устойчивости холерного вибриона к антибактериальным препаратам методом серийных разведений и диско-диффузионным методом Интерпретация результатов исследования», одобренные Ученым Советом и утвержденные директором РостНИПЧИ (протокол №8 от 22 11 06)
Основные положения, выносимые на защиту:
Анализ антибиотикограмм 390 штаммов холерного вибриона 01 и 0139 серог-рупп, выделенных от людей за период с 1927 по 2005гг, показал, что устойчивость к 1-3 препаратам регистрировалась с 1983 по 1993гг, с 1993-1994гг все изученные штаммы характеризовались множественной антибиотикорезистентно-стыо с различным набором г-детерминант устойчивости (от 3х до 10т")
У изученных штаммов возбудителя холеры обнаружена нетрансмиссивная резистентность к рифампицину, хинолопам, фуразолндону и трансмиссивная - к стрептомицину, триметоприму/сульфаметоксазолу, тетрациклинам, левомицети-ну, ампициллину, гентамицину, канамицину, амикацину в разных сочетаниях
В ходе эпидемического процесса у холерного вибриона может расширяться спектр антибиотикорезистентности за счет
а) индукции антибиотиком экспрессии трансмиссивной устойчивости к тетра
циклинам, левомицетину, ампициллину, стрептомицину, гентамицину, канами
цину, амикацину,
б) мутаций резистентности к рифампицину и хинолопам,
в) включения Д-плазмид 9 групп несовместимости с разным набором маркеров
устойчивости
4 На основе сопоставления данных антибиотикограмм штаммов холерного виб
риона, полученных с использованием контрольного антибиотикочувствительного
референс-штамма Vcholerae поп 01 КМ 162, и эффективности препаратов in vivo,
а также клинических наблюдений предложены критерии интерпретации резуль
татов определения антибиотикограмм для 3х питательных сред (агар Мюллера-
Хинтона, Хоттингера, АГВ), способствующие адекватному выбору средств экс
тренной профилактики и этиотропной терапии холеры
Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на научных конференциях ФГУЗ РостНИПЧИ Ростпотребнадзора в 2001-2006гг, представлены на проблемных комиссиях «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов-на-Дону, 2001-200бгг), на научно-практической конференции «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе Итоги и перспективы» (Ставрополь, 2002г ), на научно-практической конференции «Окружающая среда и здоровье» (Саратов, 2002г), на VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002г), на IV Общероссийской конференции "Гомеостаз и инфекционный процесс" (Сочи, 2003г), на VIII Российской научно-практической конференции по проблеме "Холера" (Ростов-на-Дону, 2003г), на VII и VIII Международных конференциях MAKMAX/ASM по антимикробной терапии (Москва, 2005,2006г)
Диссертационная работа выполнена в рамках двух государственных тем №ГР 01 9 90 002822 «Экспериментальное обоснование рациональных подходов к этиотропной терапии холеры», где автор являлась исполнителем и № ГР 0120 0 410671 «Разнообразие спектра маркеров антибиотикорезистеїггности у эпидемически значимых штаммов холерного вибриона», где автор является ответственным исполнителем
Публикации результатов исследований
Основные материалы диссертации опубликованы в 20 научных работах, из которых 5 в центральной и 8 в региональной печати (Ростиздат)
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 174 машино-
писных страницах, содержит 43 таблицы, 3 рисунка Библиографический указатель содержит 338 литературных источников 134 отечественных и 204 иностранных
Похожие диссертации на Природная и экспериментальная вариабельность антибиотикорезистентности у штаммов холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп и обоснование выбора средств этиотропной терапии холеры
