Введение к работе
Актуальность проблемы. Заболеваемость холерой, входящей в группу
карантинных инфекций с диарейным синдромом, регистрируется на всех континентах мира. В 1961г. началась седьмая пандемия холеры Эль-Тор, которая по продолжительности во времени и числу охваченных стран превышает каждую из шести предшествующих [Москвитина Э.А. с соавт., 2003]. Сведения о регистрации на территории России в 1999-2002 гг. крупных эпидемических вспышек (Дальний Восток, 1999; Казань, 2001) и спорадических случаев холеры (Челябинск, 2000; Волгоград, 2001; Калмыкия, 2002) [Онищенко ГГ., 2000-2002; Москвитина Э.А. с соавт., 2003] обусловливают большой интерес исследователей к этойинфекции.
Холерные вибрионы могут обитать как в природных экосистемах, так и в организме человека. Для существования в двух таких разных экологических нишах возбудитель холеры должен обладать набором генов, которые обеспечивают ему выживаемость как во внешней среде, так и в организме хозяина, обуславливая его патогенность [Faruque S.M. et al, 1998; Литвин В.Ю. с соавт., 2001; АН М. et al, 2002; Faruque S.M., Nair G.B., 2002]. Полученные в последние 5-7 лет данные указывают на то, что гены, обеспечивающие жизнеспособность этого микроорганизма, локализованы на эволюционно древних участках большой хромосомы. [Trucksis М. et al, 1998; Heidelberg J.F. et al, 2000]. Кроме того, в геноме V.cholerae присутствуют мобильные генетические элементы, или МГЭ (профаги, «острова патогенности»), которые холерный вибрион приобрел в процессе эволюции. К настоящему времени известно, что хромосома эпидемически опасных штаммов V.cholerae содержит как минимум четыре «блока вирулентности»: 1) профаг СТХф с генами холерного токсина (СТ), вызывающего развитие основного симптома при холере - профузную диарею [Waldor М. К., Mekalanos J. J., 1996; Iida Т. etal, 2002; Davis B.M., Waldor M.K, 2003]; 2) «остров патогенности» (ОП) VPI, несущий кластер генов, кодирующих биосинтез основного фактора колонизации - токсин-корегулируемых пилей адгезии (TCP) [Karaolis D.KR. et al, 1998, 1999; Смирнова Н.И., 1999]; 3) недавно открытый второй ОП VPI-2 с генами, отвечающими за синтез нейраминидазы, усиливающей действие холерного токсина [Jermyn W.S., Boyd E.F., 2002], и 4) профаг RS1<{), присутствующий у всех вирулентных вибрионов эльтор [Faruque S.M., Asadulghani et al, 2002; Davis B.M., Waldor M.K, 2003]. Кроме того, геном эпидемически опасных и непатогенных холерных вибрионов содержит ОП с генами 01-антигена [Stroeher U.H. et al, 1998] и «остров персистенции» с генами маннозо-чувствительных пилей адгезии (MSHA), участвующих у эльтор вибрионов в образовании биопленки, защищающей их от неблагоприятных воздействий окружающей среды [Marsh J.W., Taylor R.K, 1999; Смирнова Н.И., Лозовский Ю.В., 2003]. Таким образом, для генома возбудителя холеры характерна модульная организация, обуславливающая генетическую гетерогенность этого микроорганизма. Тем не менее, до сих пор имеются лишь отдельные сведения о структуре генома вирулентных штаммов, выделенных во время массовых заболеваний холерой.лз. территории убывшего СССР
(
^ОСНАЦИОНАЛЬНАЯ I БИБЛИОТЕКА ] .ЛИЛ
(1970-1975 гг.). Весьма недостаточно данных об изменении структуры генома штаммов при попадании их в водную экосистему. Кроме того, появление атипичных по патогенным свойствам изолятов, которые часто выделяются из воды поверхностных водоемов и при определенных условиях могут вызывать спорадические заболевания холерой у людей, требует более тщательного изучения не только их фенотипических свойств, но и генетической организации, которое до начала нашей работы практически не было проведено.
До сих пор в литературе имеются разноречивые сведения об эволюционных связях и генетическом родстве эпидемически опасных, безопасных и атипичных штаммов холерного вибриона эльтор. Это указывает на необходимость гено-типирования штаммов, выделенных на территории бывшего СССР. Полученные данные будут полезны не только для фундаментальных исследований, но и для проведения более эффективного эпидемиологического мониторинга.
Несмотря на то, что ПЦР и ДНК-гибридизация позволяют быстро и эффективно оценить диагностическую значимость холерных вибрионов, эти методы требуют наличия в диагностических лабораториях дорогостоящего оборудования. В то же время в 1996 г. Н.М. Остроумовой были подобраны фаги ctx+ и ctx", чувствительность к которым и гемолитическая активность позволяли выявлять эпидемически опасные и неопасные штаммы V.cholerae биовара эльтор [Кокушкин A.M. с соавт., 1998]. Те не менее, к началу нашей работы данные о сравнительной оценке диагностической значимости простого и дешевого метода, основанного на применении указанных фагов, и ПЦР-анализа отсутствовали, что послужило основанием для проведения соответствующей работы и определения состава генов вирулентности в каждой из трех групп штаммов, отнесенных по чувствительности к фагам к эпидемически опасным, безопасным и требующим дополнительных исследований.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ - сравнительный анализ структуры генома штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор, выделенных от больных, вибрионосителей и из объектов окружающей среды на разных территориях.
-
С помощью комплексного ПЦР-тестирования 13 различных генов и генных «блоков» выявить различия в структуре генома штаммов V.cholerae биовара эльтор, изолированных от больных, носителей и из объектов окружающей среды на территории Поволжья и Туркменистана.
-
Выявить закономерность изменения генома штаммов холерного вибриона эльтор, обитающих в воде открытых водоемов и организме носителей в межэпидемический период.
-
Провести ПЦР- и риботипирование штаммов V.cholerae биовара эльтор, выделенных из различных источников на территории Поволжья и Туркменистана, с целью выявления их генетического родства.
-
Изучить молекулярно-генетические особенности атипичного штамма V.cholerae биовара эльтор, выделенного от больного холерой.
-
Провести сравнительный анализ эффективности фагового метода (фаги ctx+ и ctx") и ПЦР при дифференциации штаммов V.cholerae биовара эльтор по
эпидемической значимости.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Для выяснения структуры генома холерных вибрионов с различной эпидемической значимостью впервые проведен комплексный ПЦР-анализ 186 штаммов V.cholerae биовара эльтор, выделенных из различных источников на территории Поволжья и Туркменистана в эпидемически благополучные и неблагополучные по холере годы. Выявлено присутствие (или отсутствие) 13 генов, расположенных как на эволюционно древней части хромосомы (гены жизнеобеспечения), так и на пяти МГЭ, выполняющих различные функции. Установлено, что клинические штаммы и ряд изолятов, выделенных от носителей во время вспышек холеры, представлены генетически однородной популяцией и содержат набор всех тестируемых генов, относящихся как к стабильным генам жизнеобеспечения (hapA, toxR, rtxA), так и генам патогенности и пер-систенции, расположенным на МГЭ: СТХф (ctxA, zot, асе), Р^іф) (rstC), VPI (tcpA, aldA, toxT), ЕРІ (mshQ), VPI-2 (nanH), а также последовательности attRS. Вибрионы, изолированные в межэпидемический период из воды поверхностных водоемов и от вибрионосителей, характеризуются выраженной вариабельностью генома за счет утраты различных по размерам и функциям фрагментов ДНК. Показано, что процесс потери генов имеет определенную последовательность. Наиболее нестабильными являются гены вирулентности, входящие в состав профагов СТХф и Я81ф. Обнаружен ген (hapA), наследуемый клеткой в 100 % случаях независимо от среды обитания вибрионов.
Приоритетное значение имеют данные рибо- и ПЦР-типирования 29 штаммов V.cholerae биовара эльтор с различной эпидемической, значимостью, выделенных на территории Поволжья и Туркменистана, с целью изучения генетического родства между ними. Показано, что использованные методы молекулярного типирования позволяют дифференцировать холерные вибрионы эльтор на три группы: эпидемически опасные, авирулентные и нетоксигенные штаммы, сохранившие часть генов вирулентности. Установлено, что вибрионы последней группы имеют генетическое родство как между собой, так и с вирулентными штаммами.
Получены новые сведения относительно фенотипических и молекулярно-генетических свойств атипичного штамма V.cholerae биовара эльтор, вызвавшего единичный случай заболевания холерой в 2000 г. В экспериментах на модельных животных показано, что штамм нехолерогенен, но продуцирует ряд ферментов патогенности (гемолизин, фосфолипазу, растворимую гемагглютинин/протеазу). На основании данных ПЦР-анализа определен генотип этого штамма (ctxA'zof асеsftcpA'toxTaldA'rstCnanlTattRS*toxR*hapA *rtxA *mshQ*), подтверждающий его эпидемическую безопасность. В результате ПЦР-типирования с двумя «случайными» праймерами установлено, что по структуре генома данный штамм отличается как от вирулентных, так и от нетоксигенных эльтор вибрионов.
Впервые получены сведения о присутствии генов hapA, ctxA, tcpA и toxR, генетических маркеров эпидемически опасных штаммов, в хромосоме 142 штаммов V.cholerae биовара эльтор, выделенных на территории Поволжья, Дагестана, Туркменистана, Узбекистана, Сибири и Приморья в период с 1965 по 2002 гг.,
эпидемическая значимость которых была определена фаговым методом. Установлено, что результаты фагового теста и ПЦР-анализа при оценке эпидемической значимости 460 штаммов холерных вибрионов биовара эльтор совпадают в 97 % случаев, что указывает на высокую диагностическую ценность холерных бактериофагов ctx и ctx—. Лизис фагом ctx в 93,8 % случаев штаммов, содержащих ген tcpA, позволяет полагать, что пили TCP могут служить рецептором для данного фага.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. По результатам работы составлены методические рекомендации: «Мультиплексный ПЦР-анализ для идентификации штаммов Vibrio cholerae eltor и определения их эпидемической значимости» и «Риботипирование штаммов Vibrio cholerae», которые одобрены Ученым Советом (протоколы № 7 от 3 июля 2002 г. и № 9 от 18 декабря 2003 г.) и утверждены зам. директора Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб».
Депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" три штамма V. cholerae биовара эльтор с различным набором основных генов патогенности ctxA, tcpA, toxR и неодинаковой чувствительностью к новым холерным диагностическим бактериофагам ctx и Ctx", а также шесть штаммов V.cholerae биовара эльтор, имеющих различные генотипы по данным ПЦР-тестирования 13 генов патогенности. Указанные штаммы могут быть использованы в прикладных и фундаментальных исследованиях.
Данные о структуре генома 186 штаммов V.cholerae биовара эльтор с различной эпидзначимостью предназначены для использования Государственной коллекцией патогенных бактерий «Микроб» при молекулярно-генетической паспортизации штаммов, циркулирующих на разных территориях России.
